新型雙組分交聯封閉聚合物水凝膠促進大鼠創面愈合的研究

金晶 何屹 鄔凌峰 李家曄 沈斌 高金來

創面管理是醫療系統管理的重要組成部分[1]。術后創面感染會導致疼痛、愈合時間延長，甚至引發全身感染[2]。目前迫切需要開發理想敷料，以減少創面疼痛，加快創面愈合速度。在無任何敷料的情況下，一旦結痂覆蓋創面會降低上皮化速度；但如果使用濕敷料就不易形成結痂，有利于創面快速愈合[3-4]。傳統的紗布敷料不能保持創面濕潤，纖維組織易與肉芽組織融合，導致更換敷料時疼痛感明顯，并可能造成新的組織損傷[5-7]。目前開發了一種新型雙組分交聯聚合物封閉水凝膠，先在需要封閉的創面覆蓋一層植物纖維素衍生物水溶液，再噴涂一層氧化淀粉水溶液，原位快速（3 s）形成不流動的生物水凝膠，將術后創面有效封閉起來，從而減少滲出，促進創面愈合。本研究通過構建大鼠創面模型，就新型雙組分交聯封閉聚合物水凝膠對大鼠創面愈合的作用作一探討，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性SD 大鼠18 只，購自上海Legen 生物技術有限公司[生產許可證號為SCXK（浙）2019-0002]，體重（200±20）g。大鼠飼養于嘉興學院實驗動物房[使用許可證號為SYXK（浙）2020-0007]，室溫20～25 ℃，濕度40%～70%，不限制飲水、進食。本研究經嘉興學院醫學院實驗動物倫理委員會審查通過（批準文號：JUMC2022-171）。

1.2 試劑和儀器 新型雙組分交聯聚合物封閉水凝膠（批號：20200618）購自易敏（浙江）生物醫藥科技有限公司，硫酸慶大霉素（批號：N23030761）購自辰欣藥業股份有限公司，水合氯醛（批號：20220320）購自青島宇龍海藻有限公司，HE 染色試劑盒（批號：G1120）購自北京索萊寶科技有限公司，qRT-PCR 試劑盒（批號：A46012）購自美國Thermo Fisher 有限公司。qRTPCR 儀（型號：Stepone plus 7500）購自美國ABI 公司，熒光顯微鏡（型號：BX53）購自日本OLYMPUS 公司。

1.3 方法

1.3.1 大鼠創面模型構建 按0.3 mL/100 g劑量取10%水合氯醛麻醉大鼠，剃除大鼠背部毛皮并消毒皮膚，用打孔器在背部皮膚打孔（直徑8 mm，深度2 mm）。

1.3.2 大鼠分組與處理 按隨機數字表法將建模后的SD 大鼠分為水凝膠組、硫酸慶大霉素組、對照組，每組6 只。其中水凝膠組每天在創面處涂抹植物纖維素衍生物水溶液25 μL，同時噴涂氧化淀粉水溶液25 μL，1 次/d；硫酸慶大霉素組每天在創面處涂抹硫酸慶大霉素50 μL 作為陽性對照，1 次/d；對照組不作任何處理。藥物干預第10 天10%水合氯醛麻醉大鼠，以大鼠的背部創面中心為原點，取直徑10 mm、深度達真皮層的創面組織進行后續實驗，包括對創面組織進行HE染色并觀察組織形態，以及采用qRT-PCR 法檢測創面組織中IL-6、TNF-α、轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）水平。實驗結束后，采用CO2窒息法對所有大鼠進行無痛安樂死處理。

1.3.3 大鼠創面面積測量 每天記錄創面愈合情況，采用相機取固定高度和角度并以直尺作為對照標準，對創面進行拍照保存，使用Image Pro Plus 軟件計算創面面積。

1.3.4 大鼠創面組織病理學檢查及肉芽組織面積測量 采用HE 染色。取藥物干預10 d 后的創面組織于4%多聚甲醛溶液中進行固定，石蠟包埋，切片（厚度5 μm）。取肉芽組織面積最大的切片，按照HE 染色試劑盒說明書進行染色，在光鏡下觀察并拍照，使用圖像分析軟件測量創面肉芽組織面積。

1.3.5 大鼠創面組織中IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA 相對表達量檢測 采用qRT-PCR 法。取藥物干預10 d后的創面組織30 mg，加入1 mL Trizol 后使用組織研磨器在冰浴中將組織樣本研磨成勻漿，加入適量氯仿離心后吸取RNA 層。將其轉移至另一個EP 管中，加入等體積的異丙醇并混勻，4℃下12 000 r/min離心10 min后RNA 沉于管底。使用1 mL 75%乙醇洗滌后，使用DEPC 水重懸，取1 μg RNA 逆轉錄成cDNA，反應體系為SYBR Green Mix 10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、cDNA 1 μL，并用Nuclease-Free 補足體積至20 μL，引物序列見表1。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內參，采用2-ΔΔCt法計算組織中IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA 相對表達量。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.4 統計學處理 采用GraphPad Prism 7.0 統計軟件。計量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組大鼠創面面積變化比較 從藥物干預第4 天起，水凝膠組和硫酸慶大霉素組大鼠創面面積均明顯小于對照組（均P＜0.05），而水凝膠組與硫酸慶大霉素組比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見圖1（插頁）。

圖1 3 組大鼠創面面積變化比較（A：創面愈合情況，×2；B：創面面積變化，與對照組比較，aP＜0.05）

2.2 3 組大鼠創面肉芽組織面積比較 水凝膠組藥物干預10 d 后創面明顯愈合，肉芽組織區域較少，真皮組織區域較多，見圖2A（插頁）。水凝膠組、硫酸慶大霉素組創面肉芽組織面積均明顯小于對照組（均P＜0.05），而水凝膠組與硫酸慶大霉素組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2B（插頁）。

圖2 3 組大鼠創面肉芽組織面積比較（A：HE 染色結果，×4；B：肉芽組織面積比較，與對照組比較，aP＜0.05）

2.3 3 組大鼠創面組織中IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA相對表達量比較 水凝膠組、硫酸慶大霉素組創面組織中IL-6、TNF-α mRNA 相對表達量均明顯低于對照組（均P＜0.05），TGF-β mRNA 相對表達量明顯高于對照組（P＜0.05）；而水凝膠組與硫酸慶大霉素組創面組織中IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA 相對表達量比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見圖3。

圖3 3 組大鼠創面組織中IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA 相對表達量比較（A：IL-6；B：TNF-α；C：TGF-β）

3 討論

皮膚是人體與外部環境之間最重要的屏障，也是先天免疫系統的重要組成部分。它通過減少微生物的黏附和侵襲[8]，在防止微生物的滲透和預防感染方面起著重要作用。然而，當這個屏障被打破時，機體易被微生物感染。創面愈合是一個復雜的過程，主要經歷凝血期、炎癥期、增殖期和重建期等4個階段[9-11]。在凝血期，血小板聚集起到止血的作用；在炎癥期，各種生長因子和生物活性物質啟動組織修復；在增殖期，纖維細胞增殖并遷移到創面，與內皮細胞一同生長并形成血管；在重建期，角質形成細胞通過合成細胞外基質并參與細胞間信號調控，從而促進基底膜形成。然而，任何一個時期都可能影響創面遷延不愈。本研究通過構建大鼠創面模型，就新型雙組分交聯封閉聚合物水凝膠對大鼠創面愈合的作用作一探討，為其臨床應用提供理論依據。

新型雙組分交聯封閉聚合物水凝膠是一種新型液體敷料，生物水凝膠原位快速形成并發揮保護作用，具體機制為帶有大量氨基的梳狀高分子植物纖維素衍生物與帶有大量醛基的星狀高分子氧化淀粉通過席夫堿反應交聯形成水凝膠，以星狀高分子、梳狀高分子為基的生物水凝膠能加速成膠反應；而噴涂在底層的植物纖維素衍生物與黏膜具有較強的靜電吸引作用，該作用力來自于植物纖維素衍生物分子與水分子、組織上含氫基團（如氨基、羧基等）強的氫鍵作用以及植物纖維素衍生物高分子上大量羧基和氨基與黏膜組織表層細胞、蛋白、細胞間骨架上帶正電性基團、負電性基團之間的靜電吸引作用，上述這些作用賦予水凝膠穩固黏著創面的能力，從而達到封閉創面的效果，進而減少滲出，抑制創面組織炎癥因子（IL-6、TNF-α）的分泌，增加TGF-β 因子分泌，誘導纖維細胞增殖，最終促進創面愈合。本研究結果顯示，與對照組比較，水凝膠組和硫酸慶大霉素組從藥物干預第4 天起創面面積和肉芽組織面積均明顯縮小，創面組織中IL-6、TNF-α mRNA 相對表達量均明顯降低，TGF-β mRNA 相對表達量均明顯升高，差異均有統計學意義；而水凝膠組與硫酸慶大霉素組創面肉芽組織面積以及組織中IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA 相對表達量比較，差異均無統計學意義；以上結果提示水凝膠與慶大霉素在促進創面愈合方面顯示出相似的療效。隨著抗生素耐藥性問題的日益突出，非抗生素創面治療方案，如水凝膠的出現為患者提供了更多選擇，有助于減少抗生素耐藥的風險。而水凝膠作為新型創面治療材料，具有獨特的纖維網狀結構，具有封閉創面、減少滲出的同時又能保持透氣、防水的特點，為創面愈合提供良好的修復環境。此外，水凝膠在燒傷和慢性創面治療中的應用價值也值得進一步探究。未來研究方向也可關注改進水凝膠的配方，以提高其治療效果，并在更廣泛的創面類型上進行有效性測試。

綜上所述，新型雙組分交聯封閉聚合物水凝可加速大鼠創面愈合，減少炎癥反應。