黃芪抑制膠質瘤的作用機制和基因靶點研究

陳潘迪 王洪財 李振強 王東峰 葉耿帆 陳茂送

腦膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發性惡性腫瘤，占顱內腫瘤的35%～61%，具有發病率高、治愈率低的特點。根據膠質瘤惡性程度，WHO 將其分為4 個級別：生長緩慢、較少發生惡性轉化的毛細胞性星形細胞瘤為Ⅰ級；彌漫性浸潤性星形細胞瘤為Ⅱ級；間變性星形細胞瘤為Ⅲ級；膠質母細胞瘤為Ⅳ級[1]。目前治療膠質瘤的方法主要有手術、放療、化療、免疫治療、電場治療等，但治療效果不佳，患者預后和生存不理想[2]。因此，尋找一種高效、低毒、有效的新型治療方法是當前研究的熱點。黃芪已被廣泛應用于免疫調節、抗氧化等方面的臨床治療。近年來研究發現，黃芪具有抑制腫瘤細胞分裂增殖的作用[3-5]。此外，黃芪還能增強免疫功能[6]，促進機體免疫抗腫瘤反應，但是具體作用機制尚不清楚。因此，本研究基于網絡藥理學預測黃芪抑制膠質瘤的作用機制和基因靶點，并通過細胞實驗進一步驗證，以期為臨床開發和利用黃芪治療膠質瘤提供依據。

1 材料和方法

1.1 基于網絡藥理學分析

1.1.1 黃芪的主要生物活性成分及藥物作用基因靶點篩選 利用中藥系統藥理學TCMSP v2.3 數據庫（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[7]，以“黃芪”為關鍵詞檢索到黃芪的所有生物活性成分，再設置篩選主要生物活性成分的條件為口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥比（drug-likeliss，DL）≥0.18。同時在TCMSP v2.3 數據庫檢索主要生物活性成分的蛋白質靶點，并通過STRING 數據庫（https://cn.string-db.org/）[8]轉化為基因符號，即藥物作用基因靶點。

1.1.2 膠質瘤相關的人類基因篩選 利用GeneCards數據庫[9]，以“膠質瘤”為關鍵詞檢索并導出膠質瘤相關的人類基因，篩選出Relevance≥2 倍score 中位數的基因；再利用OMIM數據庫檢索膠質瘤相關的人類基因[10]；兩者合并消除重疊后，最終獲得膠質瘤相關的人類基因。

1.1.3 黃芪在膠質瘤中的基因靶點識別 利用R 語言將黃芪的藥物作用基因靶點與膠質瘤相關的基因進行比對分析并取交集，篩選出重疊的基因靶點，得到黃芪可能治療膠質瘤的基因靶點數據。再利用UNIPROT 數據庫將上述基因靶點轉換成標準的UNIPROT ID 作進一步分析[11]。

1.1.4 基因本體論（gene ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組數據庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析 利用DAVID 數據庫對靶點基因進行GO 富集分析[12]，內容包括生物過程（biological process，BP）、細胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。再行KEGG 通路分析，篩選出P＜0.05 的通路作進一步分析。

1.1.5 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡的構建 為明確靶點間的相互關系，將前期得到的黃芪可能治療膠質瘤的基因靶點數據提交至STRING 數據庫，設定生物種類為“Homo sapiens”，將“Settings”中 的“minimum required interaction score”選為“highest confidence（0.900）”，其余均為默認設置，剔除游離無聯系基因，分析獲得PPI 網絡。

1.1.6 Hub 基因篩選 將上述PPI 網絡數據導入Cytoscape 3.9.1 軟件[13]，利用CytoHubba 插件中的MCC 算法計算并篩選黃芪治療膠質瘤的前10 位核心基因，即Hub 基因。

1.1.7 疾病-藥物-成分-靶點-通路的可視化網絡構建 將上述分析得到的靶點、通路、成分數據導入Cytoscape 3.9.1 軟件，刪除無聯系基因，構建疾病-藥物-成分-靶點-通路的可視化網絡圖，并使用插件Network Analyzer 分析其網絡特征。

1.2 細胞實驗論證

1.2.1 主要材料 膠質瘤細胞株U251（批號：CL-0237）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。黃芪（干藥材）由寧波市醫療中心李惠利醫院中醫科提供。PBS（批號：21-040-CVC）購自美國Corning 公司；胰蛋白酶（含0.25%乙二胺四乙酸）（批號：25200056）、DMEM 細胞培養基（批號：11965092）、FBS（批號：10099）均購自美國Gibco 公司；細胞計數試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）（批號：CK04）購自日本同仁化學公司；活死細胞雙染色試劑盒（批號：KTA1001）購自Abbkine 生物技術有限公司。

1.2.2 細胞培養及傳代 將含有1 mL U251 細胞懸液的凍存管置于37 ℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5 mL含10% FBS 的DMEM 培養基混合均勻。1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，補加5 mL 完全培養基后吹勻；再將所有細胞懸液加入培養瓶中，置于37 ℃、含5% CO2培養箱中培養過夜。當細胞密度達80%～90%時進行傳代培養，取對數生長期的細胞用于后續實驗。

1.2.3 黃芪培養液的制備 將60 g 黃芪研磨后置于700 mL 蒸餾水中浸泡30 min，然后煎煮1 h，湯液經24目藥典篩（孔徑0.85 mm）過濾，藥渣按照上訴步驟重復操作2次。將3次藥液混合，濃縮至50 mL，4 000 r/min離心30 min 去除雜質，收集上清液，并用0.22 μm 孔徑的微孔濾膜器濾菌，添加蒸餾水至60 mL，得到1 g/mL的無菌黃芪提取液，儲存于-20 ℃冰箱內備用。使用時，將黃芪提取液分裝并用完全培養基配置成濃度為1、5、10 mg/mL 的黃芪培養液。

1.2.4 黃芪對U251 細胞存活率的影響檢測 采用CCK-8 法。將U251 細胞調整密度至1×105/L，鋪于96孔板中，放在37 ℃、含5% CO2的培養箱中過夜培養。吸去舊培養液，分別加入濃度為1、5、10 mg/mL 的黃芪培養液作為實驗組（設為1 mg/mL 組、5 mg/mL 組、10 mg/mL 組），加入完全培養基作為對照組。培養24、48、72 h 后加入CCK-8，在培養箱中繼續孵育2 h；使用酶標儀檢測波長450 nm 處（參照波長630 nm）的吸光度（absorbance，A），計算細胞存活率。細胞存活率=（A實驗組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%，其中空白組只含CCK-8，不含細胞和培養液。

1.2.5 黃芪對U251 細胞凋亡的影響檢測 采用活死細胞雙染色法。將U251 細胞鋪于24 孔板中，置于37 ℃、含5% CO2的培養箱中過夜培養。分別加入濃度為1、5、10 mg/mL 的黃芪培養液作為實驗組（設為1 mg/mL 組、5 mg/mL 組、10 mg/mL 組），加入完全培養基作為對照組，繼續培養48 h。根據活死細胞雙染色試劑盒說明書配置0.5 mL 染色溶液并加入細胞中，于黑暗中37 ℃條件下孵育30 min，PBS 清洗2 次。在顯微鏡下分別拍攝活死細胞的熒光圖并進行融合觀察。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism 9.0 統計軟件。計量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基于網絡藥理學分析結果

2.1.1 黃芪的主要生物活性成分及藥物作用基因靶點 共檢索得到87 種黃芪成分，其中20 種（23.0%）符合OB≥30%且DL≥0.18，見表1。在TCMSP v2.3 數據庫中檢索這20 種主要生物活性成分，共得到462 個蛋白質靶點，經SRTING 數據庫轉化為基因符號后得到420個藥物作用基因靶點。

2.1.2 黃芪在膠質瘤中的基因靶點篩選與識別 共獲得膠質瘤相關的人類基因1 144 個。將420 個黃芪的藥物作用基因靶點與膠質瘤相關的人類基因進行比對分析，最終篩選出145 個黃芪可能治療膠質瘤的基因靶點。

2.1.3 基因靶點的GO 富集分析 145 個基因靶點經GO 富集分析后得到740 個BP、88 個CC、145 個MF，其中最主要的生物學功能包括不同蛋白結合、相同蛋白結合、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正向調控、酶結合等，見圖1（插頁）。

圖1 基因本體論富集分析結果

2.1.4 基因靶點的KEGG 通路分析 145 個基因靶點經KEGG 通路分析后得到信號通路168 條，其中最主要的信號通路包括癌癥通路、脂質與動脈粥樣硬化、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、化學致癌-受體激活等，見圖2（插頁）。

圖2 京都基因和基因組數據庫富集分析結果

2.1.5 PPI 網絡構建與Hub 基因篩選 PPI 網絡見圖3。Hub基因關聯程度從高到低依次為血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）A、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）1、JUN、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）9、PTGS2、IL-6、IL-1B、CASP3、TP53、HIF1A，見圖4。

圖3 蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖

圖4 Hub 基因

2.1.6 疾病-藥物-成分-靶點-通路的可視化網絡構建 疾病-藥物-成分-靶點-通路的可視化網絡見圖5（插頁）。在所有生物活性成分中，MOL000098（槲皮素）的度值最高，為118；在所有信號通路中，hsa05200（癌癥通路）的度值最高，為61；在所有基因靶點中，AKT1、RELA、PTGS2、MAPL1、TP53 的度值較高，分別為21、20、20、19、18，在黃芪治療膠質瘤過程中可能起重要作用。

圖5 疾病-藥物-成分-靶點-通路的可視化網絡構建

2.2 細胞實驗論證結果

2.2.1 不同濃度黃芪培養液對U251 細胞存活率的影響 培養24 h 時，5 mg/mL 組、10 mg/mL 組細胞存活率較對照組、1 mg/mL 組均明顯降低（均P＜0.05）；培養48、72 h 時，1 mg/mL 組、5 mg/mL 組、10 mg/mL 組細胞存活率較對照組均明顯降低（均P＜0.05），5 mg/mL組、10 mg/mL 組細胞存活率較1 mg/mL 組均明顯降低（均P＜0.05），10 mg/mL 組細胞存活率較5 mg/mL 組均明顯降低（均P＜0.05），見圖6。

圖6 不同濃度黃芪培養液對U251 細胞存活率的影響

2.2.2 不同濃度黃芪培養液對U251 細胞凋亡的影響黃芪對U251 細胞具有一定的凋亡作用，且隨著黃芪培養液濃度的增加，凋亡細胞明顯增多，見圖7（插頁）。

圖7 不同濃度黃芪培養液對U251 細胞凋亡的影響

3 討論

黃芪是臨床上常用的一味中藥，具有抗菌消炎、解毒等功效[14-15]。近年來研究發現，黃芪還具有抑制腫瘤細胞分裂與增殖的作用[3-5]。有體外實驗結果表明，黃芪可以抑制膠質瘤細胞增殖并誘導膠質瘤細胞凋亡[16]，但是具體作用機制如何尚不清楚。因此，本研究基于網絡藥理學作一分析，并通過細胞實驗作進一步驗證。

網絡藥理學作為一種新興的藥物研發策略，在藥物發現、機制研究和臨床應用等方面均有廣闊的應用前景。但是，基于網絡藥理學分析的結果受數據來源的影響較大，因此需要對數據的質量作進一步嚴格的評估和篩選，對結果進行多次驗證和重復性分析。本研究基于網絡藥理學分析共篩選出145 個黃芪可能治療膠質瘤的基因靶點，包括AKT1、RELA、PTGS2、MAPL1、TP53 等關鍵基因，這些基因可能在生物學過程中發揮核心作用。GO 富集分析顯示，這些關鍵基因主要通過不同蛋白結合、相同蛋白結合、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正向調控、酶結合等生物學功能發揮作用。KEGG 通路分析顯示，這些關鍵基因調控多個信號通路來發揮藥物作用，主要包括癌癥通路、脂質與動脈粥樣硬化、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、化學致癌-受體激活等。進一步構建PPI 網絡，利用MCC 算法分析得到Hub 基因，主要包括VEGFA、AKT1、JUN、MMP9、PTGS2、IL-6、IL-1B、CASP3、TP53、HIF1A。最后構建疾病-藥物-成分-靶點-通路的可視化網絡，發現在黃芪所有生物活性成分中，槲皮素發揮主要作用；在所有信號通路中，癌癥通路可能起主要作用。本研究進一步通過細胞實驗證實，不同濃度黃芪培養液對U251 細胞增殖均有抑制和凋亡作用，且其作用強度呈濃度依賴性。

綜上所述，黃芪對U251 細胞增殖具有抑制和凋亡作用，主要基因靶點包括AKT1、RELA、PTGS2、MAPL1、TP53。