通竅活血湯含藥腦脊液抑制星形膠質細胞機械性損傷后炎癥反應的機制研究

劉飛飛 申友奎 陶開亮 張言濤

創傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是指因各種原因引起的顱腦損傷性病變[1]。在TBI 后的病理級聯反應中，炎癥反應與繼發性腦損傷的發生、發展密切相關；而星形膠質細胞在TBI 后炎癥反應過程中扮演著重要角色，在這一過程中調節星形膠質細胞功能可以提高TBI 患者的生存率，改善患者的預后[2]。IL-33 屬于IL 超家族成員之一，在中樞神經系統中主要表達于星形膠質細胞和少突膠質細胞。腫瘤發生抑制蛋白（suppressor of tumourigenicity，ST）2 是IL-33的特異性受體。IL-33 與ST2 結合后啟動下游信號級聯傳導，從而促進炎癥因子的釋放[3]。既往研究發現，血清IL-33 水平與TBI 嚴重程度、炎癥反應程度和預后轉歸密切相關，血清IL-33 可能是一種反映TBI 嚴重程度和臨床預后的炎癥標志物[4]。蛛網膜下腔出血后星形膠質細胞內IL-33 表達水平升高，進而增強下游炎癥因子IL-1β、TNF-α 轉錄水平[5]。由此推測，IL-33 在TBI 后星形膠質細胞誘發的炎癥反應過程中亦起著重要作用。藥理實驗結果證實，通竅活血湯可以抑制TBI 后的炎癥反應，減輕腦水腫，提高TBI 患者的生存率[6]。但是，目前關于通竅活血湯對TBI 后星形膠質細胞內IL-33 表達和IL-33/ST2 信號通路影響的研究不多。考慮到與中藥含藥血清相比，中藥含藥腦脊液可以避免血清中復雜成分的干擾，排除不能通過血腦屏障的成分，增加效應成分作用的針對性，故本研究利用機械性損傷的星形膠質細胞模擬TBI 的基本病理過程，探討通竅活血湯含藥腦脊液（Tongqiao Huoxue Decoction-containing cerebrospinal fluid，TQHXD-CSF）對星形膠質細胞機械性損傷后炎癥反應的影響以及其調控IL-33/ST2 信號通路的相關機制，為通竅活血湯的臨床應用提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與細胞 無特定病原體的雄性SD 大鼠20 只，體重250～300 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司[動物生產許可證號：SCXK（滬）2013-0018]。飼養條件：恒溫，溫度（22±2）℃，濕度50%～60%，每12 h明暗交替，通風15～20 次/h，大鼠自由攝食、飲水。星形膠質細胞株（批號：RAT-iCell-n009）由賽百慷（上海）生物技術股份有限公司提供。本研究經杭州鷹旸生物醫藥研發中心實驗動物倫理委員會審查通過（批準文號：202107-2901）。

1.2 藥物與試劑 通竅活血湯中的川芎、紅花、赤芍、桃仁、生姜、蔥、紅棗由浙江中醫藥大學附屬杭州市中醫院藥劑科提供，麝香購自杭州方回春堂集團有限公司；FBS（批號：11011-8615）購自浙江天杭生物科技有限公司；胰蛋白酶（批號：SH30042.01）、DMEM（批號：SH30243.01）均購自美國Hyclone 公司；四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑盒（批號：E606334-0500）、10%APS（批號：A600072-0025）均購自上海BBI Life Sciences 公司；IL-33 ELISA 試劑盒（批號：MM-61461R1）、IL-1β ELISA 試劑盒（批號：MM-0047R1）、轉化生長因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）ELISA 試劑盒（批號：MM-0181R1）、跨膜型ST2（transmembrane ST2，ST2L）ELISA 試劑盒（批號：MM-70539R1）均購自江蘇酶免實業有限公司；RIPA裂解液（批號：P0013D）、PMSF（批號：ST506）均購自碧云天生物科技有限公司；蛋白酶抑制劑（批號60237）購自康為世紀生物科技股份有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（批號：pc0020）、預染蛋白分子量標準（批號：PR1910）均購自北京索萊寶公司；30%丙烯酰胺（批號：BL513B）、三羥甲基氨基甲烷（批號：BL516A、BL514A）購自安徽白鯊公司；牛血清白蛋白（批號：4240GR100）購自廣州賽國生物科技有限公司；聚偏氟乙烯膜（批號：10600023）購自美國GE Healthcare Life公司；IL-33 抗體（批號：ab207737）購自美國Abcam 公司；ST2L 抗體（批號：60112-1-Ig）購自武漢proteintech公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號：AF7021）購自美國Affinity 公司；總RNA 抽提試劑盒（批號B511311）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；qRT-PCR 檢測試劑盒（批號：RR820A）購自日本Takara公司；miRcute 增強型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（批號：KR211）購自天根生化科技有限公司。

1.3 儀器 細胞培養箱（型號：BB150）、低溫高速離心機（型號：Micro17R）均購自美國Thermo 公司；光學顯微鏡（型號AE2000）購自德國Motic 公司；倒置熒光顯微鏡（型號：Ts2-FC）購自日本尼康公司；酶標儀（型號：CMaxPlus）購自美國MD 公司；電泳儀（型號：EPS300）、電泳槽（型號：VE 180C）、轉膜儀（型號：VE186）均購自天能公司；化學發光儀（型號：610020-9Q）購自勤翔公司；PCR 儀（型號：Mastercycler）購自德國Eppendorf 公司；mRNA 定量儀（型號：Nanodrop one）購自美國Thermo Scientific 公司；qRT-PCR 儀（型號：CFX Connect）購自美國Bio-Rad 公司。

1.4 方法

1.4.1 TQHXD-CSF 及正常腦脊液的制備 將20只SD大鼠按隨機數字表法分為給藥組和正常組，每組10只，分別制備TQHXD-CSF及正常腦脊液。TQHXD-CSF的制備方法參考文獻[7]。給藥組大鼠按3 mL/kg劑量灌胃通竅活血湯，早晚各1次，連續5 d；正常組大鼠按3 mL/kg劑量灌胃0.9%氯化鈉溶液，早晚各1 次，連續5 d。兩組大鼠末次給藥后1.5 h，肌肉注射戊巴比妥鈉（劑量50 mg/kg）麻醉，頸后剃毛并碘伏消毒，切開皮膚后鈍性分離肌肉層，用1 mL無菌注射器由枕骨大孔刺入延髓池抽取腦脊液。4 ℃、3 000 r/min 離心10 min，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-20 ℃條件下凍存備用。

1.4.2 細胞分組與處理 將星形膠質細胞分為正常組和機械性損傷組（3、6、12、24、48 和72 h）。星形膠質細胞機械性損傷模型的構建參考文獻[8-9]：待細胞貼壁后，用10 μL 微量移液器槍頭作“#”字劃傷，劃傷道寬度1 mm，兩相鄰劃傷道間隔4 mm。盡可能使劃傷的速度、力度相同，以保證同一組內星形膠質細胞損傷程度和范圍一致。劃傷后用PBS 清洗孔板上分離的細胞，換新的完全培養基繼續培養；正常組為無機械性損傷的星形膠質細胞。另取星形膠質細胞分為空白組（完全細胞培養基）、腦脊液對照組（含5%、10%、20%、40%正常腦脊液）和TQHXD-CSF組（含5%、10%、20%、40% TQHXD-CSF），確定TQHXD-CSF 最佳給藥濃度為20%。再另取星形膠質細胞分為正常組（含20%正常腦脊液）、模型組（含20%正常腦脊液）、TQHXD-CSF 組（含20%TQHXD-CSF）和ST2L 中和抗體+TQHXD-CSF 組（含20%TQHXD-CSF+5、10、20 μg/mL ST2L 中和抗體）；除正常組外，其余各組均按照星形膠質細胞機械性損傷模型構建方法處理細胞。

1.4.3 星形膠質細胞形態觀察 收集各組處理后的細胞，置于倒置顯微鏡下觀察各時點細胞形態學變化。

1.4.4 星形膠質細胞活性檢測 采用MTT 法。收集各組處理后的細胞，每孔加入10 μL MTT 染液，在培養箱內孵育。使用酶標儀測定各時點450 nm 處的光密度值，即細胞活性。

1.4.5 星形膠質細胞上清液IL-33、IL-1β、TGF-β1 及ST2L 水平檢測 采用ELISA 法。收集各組處理后的細胞，通過反復凍融破壞細胞并放出細胞內成分，2 500 r/min 離心20 min，留取上清液。使用ELISA 試劑盒檢測星形膠質細胞上清液IL-33、IL-1β、TGF-β1和ST2L 水平。

1.4.6 星形膠質細胞IL-33、ST2L 蛋白表達水平檢測 采用Western blot 法。收集各組處理后的細胞，經裂解、離心后，提取蛋白。采用BCA 法定量并調整各組蛋白濃度。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白，并電轉移至聚偏氟乙烯膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；加入對一抗（IL-33 為1∶1 000，ST2L 為1∶1 000，GAPDH 為1∶500）孵育12 h。經緩沖液漂洗后，加入HRP 標記的二抗（1∶5 000），37 ℃孵育2 h。再次緩沖液漂洗后用增強的化學發光試劑盒顯影，使用凝膠成像儀進行灰度值分析，即IL-33、ST2L 蛋白表達水平。

1.4.7 星形膠質細胞IL-33、ST2L mRNA 表達水平檢測 采用qRT-PCR 法。收集各組處理后的細胞，使用Trizol試劑提取總RNA，測定RNA含量和純度。配制相應反應體系進行逆轉錄反應，反應條件：42 ℃15 min，85 ℃5 min。配制相應反應體系進行PCR擴增，引物序列見表1；反應條件：95 ℃10 min變性，95 ℃15 s；60 ℃60 s；共40個循環。反應結束后以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算IL-33、ST2L mRNA 表達水平。

表1 引物序列

1.5 統計學處理 采用SPSS 16.0 統計軟件和Graph-Pad Prism 8.0 繪圖軟件。計量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；組內各時點比較采用重復測量數據的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 正常組和機械性損傷組星形膠質細胞形態變化及活性比較 正常組星形膠質細胞生長狀態良好，隨著培養時間的延長，細胞密度逐漸增加，胞體形態多樣，細胞突起之間相互連接形成網絡。機械性損傷組星形膠質細胞損傷后3 h，損傷邊緣區細胞反應性膠質化，細胞體積增大，突起結構消失；損傷后6 h，胞體向空白區域伸出纖長的突起；損傷后12 h，損傷邊緣區細胞開始向損傷處生長；隨著損傷后時間的延長，損傷區細胞數量逐漸增多，細胞胞體肥大，粗大的突起交織成網，見圖1（插頁）。機械性損傷組星形膠質細胞損傷后6、12、24、48、72 h 細胞活性均明顯低于正常組（均P＜0.05），且以損傷后6 h 細胞活性下降最明顯（均P＜0.05），見圖2。以上結果提示造模成功，機械性損傷導致星形膠質細胞出現反應性改變。

圖1 正常組和機械性損傷組星形膠質細胞形態變化

圖2 正常組和機械性損傷組星形膠質細胞活性比較

2.2 正常組和機械性損傷組星形膠質細胞上清液IL-33、IL-1β、TGF-β1 及ST2L 水平比較 機械性損傷組星形膠質細胞損傷后3、6、12、24、48、72 h IL-33、ST2L、IL-1β 水平均明顯高于正常組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），且以損傷后12 h 升高最明顯；損傷后3 h TGF-β1 水平明顯高于正常組，但損傷后6、12、24、48、72 h TGF-β1 水平均明顯低于正常組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖3。

圖3 正常組和機械性損傷組星形膠質細胞IL-33、IL-1β、TGF-β1 及ST2L 水平比較

2.3 正常組和機械性損傷組星形膠質細胞IL-33、ST2L 蛋白及mRNA 表達水平比較 機械性損傷組星形膠質細胞損傷后3、6、12、24、48、72 h IL-33、ST2L 蛋白及mRNA 表達水平均明顯高于正常組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與損傷后3 h 比較，機械性損傷組星形膠質細胞損傷后12 h IL-33、ST2L 蛋白及mRNA 表達水平均明顯升高（均P＜0.05），損傷后72 h IL-33、ST2L 蛋白及mRNA 表達水平均明顯降低（均P＜0.05），見圖4-5。

圖4 正常組和機械性損傷組星形膠質細胞IL-33、ST2L 蛋白表達水平比較（A：電泳圖；B：柱狀圖）

圖5 正常組和機械性損傷組星形膠質細胞IL-33、ST2L mRNA 表達水平比較

2.4 TQHXD-CSF 對星形膠質細胞活性的影響 使用不同濃度TQHXD-CSF 處理星形膠質細胞24 h，檢測TQHXD-CSF 在細胞中作用的安全濃度。與空白組比較，5%、10%濃度的正常腦脊液和TQHXD-CSF 對細胞增殖的影響比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）；當濃度為20%時，腦脊液對照組和TQHXD-CSF 組細胞活性較空白組均明顯升高，且TQHXD-CSF 組明顯高于腦脊液對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；當濃度為40%時，腦脊液對照組細胞活性較空白組明顯升高，TQHXD-CSF 組明顯低于腦脊液對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖6。故后續實驗以20%作為TQHXD-CSF 最佳給藥濃度。

圖6 TQHXD-CSF 對星形膠質細胞活性的影響

2.5 TQHXD-CSF 對星形膠質細胞機械性損傷后細胞形態及活性的影響 與正常組比較，模型組細胞密度稀疏、胞體增大且突起結構消失；與模型組比較，TQHXD-CSF 組細胞數量增多，形態由不規則形轉變為三角形或圓形，細胞間連接相對緊湊，見圖7（插頁）。與正常組比較，模型組細胞活性明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，TQHXD-CSF 組細胞活性明顯升高（P＜0.01），見圖8。

圖8 TQHXD-CSF 對星形膠質細胞機械性損傷后細胞活性的影響

2.6 TQHXD-CSF 對星形膠質細胞機械性損傷后炎癥反應和IL-33/ST2 信號通路的影響 與模型組比較，TQHXD-CSF 組IL-33、IL-1β、ST2L 水平以及IL-33、ST2L mRNA及蛋白表達水平均明顯降低，TGF-β1水平均明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與TQHXD-CSF 組比較，ST2L 中和抗體（5、10、20 μg/mL）+TQHXD-CSF 組IL-1β 水平均明顯降低，ST2L 中和抗體（10、20 μg/mL）+TQHXD-CSF 組TGF-β1水平均明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖9-10。

圖9 TQHXD-CSF 對星形膠質細胞機械性損傷后IL-33、IL-1β、TGF-β1 及ST2L 水平的影響

圖10 TQHXD-CSF 對星形膠質細胞機械性損傷后IL-33、ST2L 蛋白及mRNA 表達水平的影響（A：IL-33、ST2L 蛋白表達的電泳圖；B、C：IL-33、ST2L 蛋白表達水平比較；D、E：IL-33、ST2L mRNA 表達水平比較）

3 討論

在全球范圍內，TBI 仍是目前造成創傷相關死亡和殘疾的三大病因之一[10]。TBI 后的炎癥反應不僅會在急性期加重繼發性腦損傷，還會增加晚發的阿爾茨海默病、帕金森病和肌萎縮側索硬化癥等神經退行性疾病發生風險[11]。然而，臨床上對于TBI 后的炎癥反應仍缺乏有效的治療策略。因此，積極探索調控TBI后炎癥反應的有效措施，將有助于改善TBI 的療效。

星形膠質細胞約占腦內細胞總數的90%，是中樞神經系統疾病和損傷的關鍵反應細胞。在生理條件下，星形膠質細胞通過糖異生為神經元提供代謝和神經營養支持，同時在突觸功能的調節和維持血腦屏障穩定性等方面亦發揮重要作用。此外，星形膠質細胞還參與腦血流的調節[12]、生物鐘的調節[13]以及神經遞質的攝取、釋放[14]等過程。TBI 后星形膠質細胞由靜息狀態向激活狀態轉變，成為反應性星形膠質細胞，表現出細胞肥大、纖維酸性蛋白表達上調、分泌炎性因子和趨化因子等特性[15]。根據TBI 的損傷程度、病理階段和反應性星形膠質細胞的類型，星形膠質細胞在TBI 后繼發性腦損傷和組織修復中發揮不同作用。一方面，活化的反應性星形膠質細胞可釋放TNF、IL-1α、IL-1β 等促炎細胞因子，從而加重腦水腫，加速神經元死亡；另一方面，星形膠質細胞通過分泌抗炎因子IL-10、TGF-β1 和上調腦源性神經營養因子表達等，進而促進神經元存活和突觸修復[16]。研究發現，體外培養的星形膠質細胞經脂多糖誘導活化后可表達IL-33 并激活下游相關信號傳導通路[17]。在體內，IL-33 與膜受體ST2L 結合后觸發細胞內的信號級聯反應，促進TBI 后小膠質細胞和巨噬細胞的募集[18]。本研究發現，隨著機械性損傷后培養時間的延長，星形膠質細胞出現典型的反應性增生改變，IL-33、ST2L 和促炎因子IL-1β 水平持續升高，而抗炎因子TGF-β1水平在短暫升高后持續降低，這說明星形膠質細胞機械性損傷模型能夠模擬TBI 后星形膠質細胞的炎癥反應變化。因此，調節星形膠質細胞的功能，使其發揮抗炎作用而減少促炎因子的釋放，可能為治療TBI 提供新的思路和靶點。

通竅活血湯具有活血化瘀、通竅活絡的功效。該方劑中的麝香芳香開竅，為君藥；桃仁破血行滯潤燥，紅花活血化瘀止痛，赤芍清熱活血，川芎行血活血，均為臣藥；佐以生姜、大棗調和營衛、通利血脈；蔥為使藥，載藥上行，通陽入絡。由于通竅活血湯在體內具有多成分、多途徑、多靶點、多系統的治療特點，且由于血腦屏障的存在，通竅活血湯的神經保護作用與其在腦內的有效成分關系較大，而目前關于通竅活血湯治療TBI 的作用機制以及對TBI 后星形膠質細胞炎癥反應的具體作用和機制等均尚不明確。本研究作了相關探討，結果發現濃度為20%的TQHXD-CSF 提高星形膠質細胞機械性損傷后細胞活性的能力最強。因此本研究選擇濃度為20%的TQHXD-CSF 作進一步實驗，結果顯示20%濃度的TQHXD-CSF 處理星形膠質細胞機械性損傷模型后，能改善細胞形態，增強細胞活性，降低IL-33、ST2L、IL-1β 水平，提高TGF-β1水平。由此可見，TQHXD-CSF 能在星形膠質細胞機械性損傷后發揮抗炎效應。研究表明，IL-33/ST2 信號通路參與心肌梗死、腫瘤、腦梗死等多種疾病的病理過程[19]。在TBI 小鼠模型中，IL-33/ST2 信號通路通過抑制自噬、內質網應激和細胞凋亡來發揮神經保護作用[20]。為了分析TQHXD-CSF 是否通過IL-33/ST2 信號通路來抑制星形膠質細胞機械性損傷后的炎癥反應，本研究加入ST2L 中和抗體來抑制IL-33/ST2 信號通路，結果發現ST2L 中和抗體能明顯增強TQHXD-CSF對IL-1β 的下調作用和對TGF-β1 的上調作用，這表明IL-33/ST2 信號通路可能參與星形膠質細胞機械性損傷后的炎癥反應過程，提示TQHXD-CSF 的抗炎作用可能與抑制該信號通路有關，但具體機制仍需深入研究明確。

綜上所述，星形膠質細胞機械性損傷后IL-33、ST2L 及IL-1β 水平均明顯升高，TGF-β1 水平降低；而TQHXD-CSF 能改善星形膠質細胞機械性損傷后的細胞形態，降低IL-33、ST2L 及IL-1β 水平，提高TGF-β1水平，其作用機制可能與負向調節IL-33/ST2 信號通路有關。