飼糧添加蘆丁對斷奶仔豬回腸形態結構和屏障功能的影響

馬龍飛，周斌斌，劉春雨，陳順，王恬，王超

(南京農業大學動物科技學院，江蘇 南京 210095)

仔豬早期斷奶易產生斷奶應激[1]，常見采食量降低，腸道黏膜及屏障功能受損[2]等。研究發現斷奶可導致小腸絨毛萎縮、隱窩深度增加，從而抑制營養物質的消化吸收和利用[3]。此外，仔豬斷奶可引起促炎因子表達量增加，機體免疫力下降，影響腸道緊密連接功能，導致腸道黏膜通透性增加，影響機體健康[4-5]。研究發現斷奶可導致腸道活性氧(ROS)增加，引起氧化應激，這可能是潛在的調控仔豬早期斷奶應激的重要靶點，已受到廣泛關注[6]。

蘆丁是廣泛存在于植物中的類黃酮物質，又名蕓香苷[7]，是由黃酮苷元槲皮素和二糖蕓香糖組成的糖苷，具有抗氧化、增強機體免疫等多種生物學功能，有調節斷奶仔豬腸道功能的潛力[8]。研究表明，飼糧中添加500 mg/kg蘆丁可改善肉雞空腸形態結構和屏障功能[9]，提高分泌性免疫球蛋白A(sIgA)含量，降低腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平和相應炎性因子基因表達量，增強腸道免疫，發揮抗炎作用[10]。Gautam 等[11]通發現蘆丁可通過提高抗氧化酶的活性，清除自由基，保護大鼠腸道免受氧化應激的影響，增強腸道抗氧化能力。腸道功能的提高對斷奶仔豬抗腹瀉能力和改善飼料轉化率方面起重要作用，但蘆丁對斷奶仔豬腸道功能的影響尚未見報道。因此，本試驗通過系統研究飼糧添加蘆丁對斷奶仔豬腸道免疫、抗氧化和屏障功能的影響，以期為生產應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

選擇16頭28 d斷奶，體重在(8.98±0.30)kg“杜×長×大”三元雜交公豬，隨機分為2組(每組8個重復，每個重復1頭豬)，對照組飼喂基礎飼糧，試驗(蘆丁)組在基礎飼糧中添加500 mg/kg蘆丁，試驗期14 d。基礎飼糧參照美國國家研究委員會(NRC，2012)頒布的營養需求標準，相應成分和營養水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養水平

1.2 飼養管理

仔豬飼養于帶有漏縫地板的不銹鋼圍欄中，溫度為26～30 ℃，濕度為50%～60%，自由采食和飲水。定期檢查豬舍環境和仔豬身體健康狀況，按常規程序免疫。

1.3 樣品采集與處理

飼養試驗結束時，試驗仔豬禁食12 h，電擊屠宰取樣。選取仔豬的回腸(約2.0 cm)于4%多聚甲醛溶液固定并制備切片。載玻片刮取回腸黏膜樣品于凍存管，置液氮冷凍后于-80 ℃低溫冰柜儲存待測。

1.4 指標測定與方法

1.4.1 腸組織形態觀察

將回腸組織于4%多聚甲醛中固定48 h后，通過酒精、二甲苯處理，石蠟包埋、切片，再用伊紅和蘇木精染色后置于顯微鏡(尼康H5500L，東京，日本)下觀察。用Image Pro Plus軟件測量腸絨毛高度、絨毛寬度和隱窩深度，計算絨毛面積、絨毛高度和隱窩深度比值。

1.4.2 抗氧化酶活相關指標測定

取回腸黏膜樣品(約100 mg)與生理鹽水按1∶9的比例勻漿，在4 ℃下以3 000 r/min離心15 min，取上清液采用相應試劑盒測定丙二醛(MDA)含量，總抗氧化能力(T-AOC)，以及總超氧化物歧化酶(T-SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)和過氧化氫酶(CAT)的活性。試劑盒均購自南京建成生物研究所，測定步驟按照試劑盒說明書進行。使用BCA試劑盒(碧云天生物技術有限公司，上海，中國)測定樣品蛋白濃度，指標按每mg或每g蛋白計算。

1.4.3 抗氧化、屏障功能、炎癥和細胞凋亡相關基因表達量的測定

取腸道黏膜組織樣品(約0.1 g)，使用TRIzol試劑(TaKaRa，大連，中國)提取總RNA，然后，使用逆轉錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，中國)將總RNA逆轉錄成cDNA。通過熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測目的基因mRNA表達，以β-肌動蛋白(β-actin)為內參基因，使用2-ΔΔCt方法計算各基因mRNA的相對表達量，具體操作根據先前研究進行[12-13]。引物序列見表2。

表2 實時熒光定量PCR引物序列

1.4.4 回腸黏膜緊密連接蛋白相對表達量的測定

根據文獻方法[14]測定回腸黏膜緊密連接相關蛋白表達量。試驗取腸黏膜樣品裂解勻漿，將等量變性蛋白進行SDS-PAGE 分離，轉移至 PVDF 膜，經室溫封閉，4 ℃下一抗孵育過夜，室溫二抗孵育 1.5 h后，置超敏 ECL 化學發光試劑(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，中國)反應，再用ChemiDoc MP成像系統(BIO-RAD，Hercules，CA，USA)觀察并使用 ImageJ軟件(Media Cybernetics Inc.，Bethesda，MD，USA)分析蛋白密度。抗體Occludin(1∶5 000)、Claudin-1(1∶4 000)和β-actin(1∶1 000)由Proteintech Group公司提供。

1.5 數據統計與分析

試驗數據采用SPSS 22.0軟件通過獨立樣本t檢驗分析對照組和蘆丁組之間的統計學差異，P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示有差異趨勢。試驗數據用“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 蘆丁對斷奶仔豬回腸組織形態的影響

如圖1及表3所示，與對照組相比，飼糧添加500 mg/kg蘆丁對斷奶仔豬回腸的絨毛高度、絨毛寬度、隱窩深度、絨毛面積和絨毛高度/隱窩深度均無顯著影響(P>0.05)。

A.對照組；B.蘆丁組。

表3 蘆丁對斷奶仔豬回腸組織形態的影響(n=6)

2.2 蘆丁對斷奶仔豬回腸黏膜抗氧化指標的影響

如表4所示，飼糧添加500 mg/kg蘆丁顯著提高了斷奶仔豬回腸黏膜中CAT活性(P<0.05)，并有降低MDA含量的趨勢(P=0.06)，但對T-AOC、GSH和T-SOD活性無顯著影響(P>0.05)。

表4 蘆丁對斷奶仔豬回腸黏膜抗氧化指標的影響(n=8)

2.3 蘆丁對斷奶仔豬回腸黏膜增殖與凋亡基因表達的影響

如圖2所示，與對照組相比，飼糧添加500 mg/kg蘆丁顯著提高了回腸黏膜中Bcl-2 mRNA表達量(P<0.05)，但對P53、CAS3、CAS9和Bax mRNA表達量無顯著影響(P>0.05)。

同一指標組間相比，*表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.4 蘆丁對斷奶仔豬回腸黏膜緊密連接蛋白基因和蛋白表達的影響

如圖3和圖4所示，與對照組相比，飼糧添加500 mg/kg蘆丁顯著提高了回腸黏膜中ZO-1和Occludin mRNA表達量以及Occludin的蛋白表達量(P<0.05)，但對Claudin-1 mRNA表達量和蛋白表達量均無顯著影響(P>0.05)。

圖3 蘆丁對斷奶仔豬回腸黏膜緊密連接蛋白基因表達的影響(n=8)

圖4 蘆丁對斷奶仔豬回腸黏膜緊密連接蛋白表達的影響(n=4)

2.5 蘆丁對斷奶仔豬回腸黏膜炎癥相關基因表達的影響

如圖5所示，與對照組相比，飼糧添加500 mg/kg蘆丁顯著降低了斷奶仔豬回腸黏膜TNF-α 和IL-6 mRNA表達量(P<0.05)，但對NF-κB、IFN-γ、IL-1β、IL-4和IL-10 mRNA表達量無顯著影響(P>0.05)。

圖5 蘆丁對斷奶仔豬回腸黏膜炎癥相關基因表達的影響(n=8)

2.6 蘆丁對斷奶仔豬回腸黏膜抗氧化相關基因表達的影響

如圖6所示，與對照組相比，飼糧添加500 mg/kg 蘆丁顯著提高了回腸黏膜SOD1和SOD2 mRNA表達量(P<0.05)，但對Nrf2、Keap1、GCLC、GCLM、HO-1和GSH-Px mRNA表達量無顯著影響(P>0.05)。

圖6 蘆丁對斷奶仔豬回腸黏膜抗氧化相關基因表達的影響(n=8)

3 討論

腸道形態結構在營養物質消化吸收中發揮重要作用，仔豬早期斷奶可導致腸道絨毛高度下降、腸道結構完整性受損等，影響腸道內營養物質的消化吸收[15]。在飼糧中添加生物活性物質是一種潛在的有效調控仔豬腸道健康、緩解早期斷奶應激的方式。研究發現，飼糧添加番石榴葉提取物可提高斷奶仔豬空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度，改善腸道損傷[16]；Chen等[17]通過對斷奶仔豬空腸形態結構研究還發現飼糧添加白藜蘆醇可降低其隱窩深度并提高絨毛高度，維護腸道健康。但本研究結果表明，添加500 mg/kg蘆丁對仔豬回腸絨毛高度、絨毛寬度、隱窩深度、絨毛面積等未產生顯著影響，提示飼糧添加蘆丁未能顯著改善回腸絨毛形態結構。而500 mg/kg蘆丁顯著增加了斷奶仔豬回腸黏膜中Bcl-2 mRNA的表達量。Bcl-2有抗凋亡效果，是改善腸道形態結構的主要蛋白之一[18]。本試驗中回腸黏膜形態結構未出現顯著變化的原因可能是蘆丁作用時間(試驗期僅14 d)或劑量不足，后期有待進一步探討其適宜添加劑量與時間。

腸屏障可阻止病原體透過腸黏膜組織進入機體，有效保證機體健康。細胞間的緊密連接是腸屏障功能發揮的決定因素之一[19]。ZO-1是一種緊密連接蛋白，Occludin則是一種跨膜蛋白，其蛋白表達水平降低或蛋白結構被破壞后，黏膜通透性增加，腸屏障功能下降，腹瀉率增加[20]。本試驗結果表明，蘆丁可顯著提高ZO-1和Occludin mRNA表達量，并顯著提高了Occludin 蛋白表達量，提示蘆丁具有改善仔豬腸屏障的作用，進而減少仔豬腹瀉。本試驗結果與Wang等[21]的結果相似，他們發現飼糧添加藤黃酚補充劑可顯著提高腸道黏膜ZO-1和Occludin mRNA表達量和蛋白表達量，改善斷奶仔豬腸屏障功能，降低仔豬腹瀉。此外，添加大豆異黃酮也可增加ZO-1和Occludin mRNA表達量，緩解LPS引起的仔豬腸道屏障功能受損，緩解LPS誘導的仔豬腹瀉[22]。

腸道中TNF-α和IL-6等促炎細胞因子過量表達可引起腸道炎癥、損傷，嚴重影響畜禽健康與生長[23-25]。本試驗結果表明飼糧添加500 mg/kg蘆丁可顯著降低斷奶仔豬腸道TNF-α和IL-6 mRNA表達水平，提示蘆丁具有緩解斷奶仔豬腸道炎癥的潛力。與本試驗結果相似，Qiu等[26]也發現白藜蘆醇可降低TNF-α和IL-6等促炎因子的基因表達量，緩解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇引起的仔豬腸道炎癥。此外，研究發現TNF-α和IL-6的表達水平過高可導致腸道通透性增加、屏障功能受損[26]。本試驗中飼糧添加蘆丁顯著降低腸黏膜中TNF-α和IL-6 mRNA表達的結果，與蘆丁可顯著增強仔豬黏膜屏障功能的結果一致。

仔豬早期斷奶會誘導機體ROS大量產生，進而導致氧化應激，引起組織氧化損傷，甚至影響整個機體的功能[27]。研究發現，氧化應激可破壞腸道黏膜，引起腸道損傷，導致腸道屏障功能障礙，而提高腸道抗氧化可有效增強腸道屏障功能[28-29]，因此緩解氧化應激可能是改善仔豬斷奶應激的重要靶點。CAT是機體主要的抗氧化酶之一，MDA是評價機體脂質過氧化的重要指標[30-31]。本試驗結果表明蘆丁顯著提高了回腸黏膜上CAT活性，并有降低MDA含量的趨勢，提示蘆丁具有提高腸道抗氧化能力，緩解斷奶仔豬氧化應激的效果。 SOD1和SOD2在消除過量ROS的防御系統中發揮重要作用[32]。Zhang等[33]研究發現提高仔豬腸黏膜SOD mRNA水平可有效緩解腸道氧化應激。與其結果相似，本試驗發現飼糧添加蘆丁顯著提高了回腸黏膜SOD1與SOD2 mRNA水平，這與蘆丁有降低MDA含量趨勢的結果一致。研究發現氧化應激同樣與細胞凋亡水平關系密切，體內大量產生的超氧陰離子、羥自由基等氧自由基可誘導細胞凋亡[34]。而SOD可通過去除超氧陰離子抑制細胞凋亡[35]。與其結果相似，本試驗中蘆丁在增強腸道抗氧化能力、緩解仔豬氧化應激的同時顯著增加了抗凋亡基因(Bcl-2 mRNA)的表達水平。但飼糧添加蘆丁對仔豬回腸黏膜中Nrf2信號通路相關基因的表達水平未產生顯著影響，提示飼糧添加蘆丁可能通過其他信號通路增強仔豬回腸抗氧化功能，但具體信號通路仍需要進一步探索。

4 結論

飼糧添加500 mg/kg蘆丁可降低炎癥反應(TNF-α和IL-6 mRNA表達水平下降)，改善斷奶仔豬腸道屏障(緊密連接蛋白與基因水平表達增強)，這可能與抗氧化能力增加密切相關。此外，斷奶仔豬飼糧添加500 mg/kg蘆丁雖然顯著增加了回腸黏膜中Bcl-2 mRNA的表達水平，但未對腸道形態結構產生明顯效果。