鼻腔鼻竇鱗狀細(xì)胞癌中PIK3CA、p-AKT、PTEN的表達(dá)及意義

趙海清,王佳說,趙一辰,姜菲菲,閻艾慧△

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院：1.耳鼻咽喉科;2.臨床流行病學(xué)與循證醫(yī)學(xué)研究室,沈陽(yáng) 110001)

鼻腔鼻竇鱗狀細(xì)胞癌(sinonasal squamous cell carcinoma,SNSCC)占鼻腔鼻竇惡性腫瘤的60%～75%,是其最常見的亞型[1]。SNSCC的發(fā)生較為隱匿且侵襲性強(qiáng),罹患者預(yù)后往往不佳,所以其分子生物學(xué)機(jī)制一直是臨床醫(yī)師的重要研究方向。90%的頭頸鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)中存在磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylino-sitol 3-kinases,PI3K)/蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,AKT)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路的異常激活[2]。 PIK3CA可編碼合成PI3K的亞基——p110α蛋白,正向調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路,誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲等,是HNSCC中最常發(fā)生突變的癌基因[3-4]。10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN)是一種編碼雙重特異性磷酸酶的抑癌基因,其主要生物學(xué)功能是逆轉(zhuǎn)PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)的過程,間接抑制AKT的活性,負(fù)向抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路激活[5]。PIK3CA和PTEN的致癌突變率在癌癥中僅次于P53[6]。而目前,PIK3CA、p-AKT、PTEN與SNSCC關(guān)系的研究較為少見。本研究通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析PIK3CA、PTEN在HNSCC中的表達(dá)趨勢(shì),免疫組織化學(xué)檢測(cè)SNSCC中PIK3CA、p-AKT、PTEN蛋白的表達(dá)情況,分析它們與其臨床病理特征和預(yù)后間的關(guān)系,旨在探討SNSCC的機(jī)制和發(fā)展進(jìn)程,以期提供新的早期診療和預(yù)后相關(guān)標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

通過UCSC Xena(https：//xenabrowser.net/)檢索下載源自癌基因組圖譜的頭頸鱗癌數(shù)據(jù)集(TCGA-HNSC),其中包括502例頭頸鱗癌組織和44例癌旁組織。具體步驟：(1)R語(yǔ)言(4.2.1版本)fread函數(shù)獲取腫瘤組織和癌旁組織的表達(dá)矩陣;(2)R語(yǔ)言rtracklayer包根據(jù)注釋文件進(jìn)行TCGA-HNSC的基因名稱轉(zhuǎn)換,若出現(xiàn)多個(gè)探針對(duì)應(yīng)1個(gè)基因名的情況,則取平均值作為表達(dá)量;(3)limma包avereps函數(shù)去掉TCGA-HNSC的重復(fù)基因并取平均值;(4)ggplot2包將數(shù)據(jù)可視化,讀取處理過的表達(dá)矩陣并提取目的基因表達(dá)水平,按照腫瘤組織和癌旁組織分組,采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)?zāi)康幕虻谋磉_(dá)在兩組中是否存在差異。

1.2 一般資料

采用回顧性研究,選取2015年1月至2021年6月于本院手術(shù)切除后經(jīng)病理證實(shí)為SNSCC的石蠟標(biāo)本43例(SNSCC組),男31例,女12例;年齡18～79歲,平均(57.53±11.68)歲;病理分級(jí)：高分化6例,中分化18例,低分化19例;根據(jù)AJCC第8版TNM分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期[7]：Ⅰ期7例,Ⅱ期4例,Ⅲ期14例,Ⅳ期18例;腫瘤原發(fā)部位：上頜竇25例,鼻腔13例,篩竇5例。完善整理臨床資料及病理資料,預(yù)后情況通過電子病例信息、門診、電話隨訪至2022年11月1日。對(duì)照組為同期收集的20例鼻中隔偏曲患者正常下鼻甲黏膜組織。所有患者術(shù)前均未接受放化療、生物治療、免疫治療,均無淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究通過中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(科倫審[2021]386號(hào))。

1.3 方法

甲醛固定標(biāo)本,常規(guī)石蠟包埋,切片,厚度4 μm。采用SP二步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書。切片二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫水,3%H2O2室溫避光孵育10 min,高壓抗原熱修復(fù),依次加入一抗PIK3CA/p-AKT/PTEN(濃度1∶100)單克隆抗體,4 ℃過夜;室溫復(fù)溫,二抗孵育20 min,DAB顯色,蘇木精復(fù)染、脫水、透明,樹膠封片。陰性對(duì)照使用磷酸鹽緩沖液代替一抗。兔抗人單克隆PIK3CA抗體(ab135384)、兔抗人單克隆p-AKT抗體(ab8805)及兔抗人單克隆PTEN抗體(ab170941)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,SP試劑盒和DAB顯色液均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 結(jié)果判定

PIK3CA及p-AKT蛋白表達(dá)在SNSCC和正常下鼻甲黏膜組織的細(xì)胞質(zhì)中呈棕黃色,PTEN蛋白表達(dá)在細(xì)胞核中呈棕黃色。選取每張切片5個(gè)視野(400×),觀察至少100個(gè)細(xì)胞。按染色強(qiáng)度無染色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,深褐色為3分;陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)數(shù)≤10%為0分,>10%～25%為1分,>25%～50%為2分,>50%～75%為3分,>75%為4分。將二者分?jǐn)?shù)乘積作為判定結(jié)果：<3分為陰性,≥3分為陽(yáng)性。以上染色結(jié)果均由兩位高年資病理科醫(yī)師在雙盲情況下評(píng)估。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示,采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法;相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析,生存分析采用Kaplan-Meier法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HNSCC組織及癌旁組織PIK3CA、PTEN mRNA表達(dá)情況

生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析顯示,HNSCC組織PIK3CA mRNA表達(dá)高于癌旁組織(P<0.01),PTEN mRNA表達(dá)低于癌旁組織(P<0.05),見圖1。

A：PIK3CA mRNA表達(dá);B：PTEN mRNA表達(dá)。

2.2 SNSCC組織及正常下鼻甲黏膜組織PIK3CA、p-AKT和PTEN蛋白表達(dá)情況

SNSCC組PIK3CA和p-AKT蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組,PTEN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖2～4、表1。

表1 SNSCC組織及正常下鼻甲黏膜組織PIK3CA、p-AKT及PTEN蛋白表達(dá)情況(n)

A：SNSCC組;B：對(duì)照組。

A：SNSCC組;B：對(duì)照組。

A：SNSCC組;B：對(duì)照組。

2.3 SNSCC患者PIK3CA、p-AKT和PTEN蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

PIK3CA、p-AKT蛋白表達(dá)與臨床分期、分化程度、原發(fā)部位有關(guān)(P<0.05),而PTEN蛋白表達(dá)與臨床分期、分化程度和原發(fā)部位無關(guān)(P>0.05)。PIK3CA、p-AKT和PTEN蛋白表達(dá)與年齡、性別、吸煙及飲酒狀態(tài)均無關(guān)(P>0.05),見表2。

表2 SNSCC患者PIK3CA、p-AKT及PTEN蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4 PIK3CA、p-AKT和PTEN蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

通過Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),SNSCC組織中PIK3CA和p-AKT蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.664,P<0.01),PIK3CA和PTEN蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.414,P<0.01),p-AKT和PTEN蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.453,P<0.01)。

2.5 SNSCC患者PIK3CA、p-AKT和PTEN蛋白表達(dá)對(duì)生存時(shí)間的影響

SNSCC患者完成隨訪41例,失訪2例,生存時(shí)間為5.23～93.27個(gè)月,中位生存時(shí)間為36.07個(gè)月。Kaplan-Meier分析顯示,PIK3CA蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者中位生存期為28.33個(gè)月,陰性表達(dá)患者中位生存期為67.27個(gè)月,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);p-AKT蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者中位生存期為34.27個(gè)月,陰性表達(dá)患者中位生存期為73.37個(gè)月,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);PTEN蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者中位生存期為70.30個(gè)月,陰性表達(dá)患者中位生存期為33.37個(gè)月,比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖5。

圖5 SNSCC患者PIK3CA、p-AKT及PTEN蛋白表達(dá)與生存時(shí)間的關(guān)系

3 討 論

鼻腔鼻竇惡性腫瘤占頭頸部腫瘤的3%～5%,每年發(fā)病率約為0.36/10萬,易侵犯上頜竇和鼻腔[8-9]。雖然,近年來SNSCC發(fā)病率呈下降趨勢(shì)[10],但因其發(fā)生位置和生長(zhǎng)模式較為隱匿,同時(shí)侵襲性較高易累及鄰近器官,就診時(shí)多處于中晚期,罹患者預(yù)后較差。盡管多模式多學(xué)科的綜合治療具有明顯優(yōu)勢(shì),可增加患者生存率和器官保存率,但預(yù)后效果仍不好,5年生存率僅為30.2%～59.5%[11-12]。術(shù)后上頜骨的缺損會(huì)改變頭頸部解剖結(jié)構(gòu),導(dǎo)致頜面畸形和發(fā)音障礙等,繼而影響患者心理健康和生活質(zhì)量[13-14]。因此,探究SNSCC相關(guān)的腫瘤標(biāo)記物,對(duì)其早期診治、分期判斷、預(yù)后評(píng)估及精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)治療至關(guān)重要。

有研究發(fā)現(xiàn),PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路可能促進(jìn)鼻竇鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移潛能[15]。本研究發(fā)現(xiàn),與正常下鼻甲黏膜組織比較,SNSCC組織中PIK3CA及p-AKT蛋白呈高表達(dá),而PTEN蛋白呈低表達(dá)。PIK3CA的過表達(dá)可激活下游AKT、mTOR等信號(hào)分子,導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖、分化和遷移等生物學(xué)效應(yīng),促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[16]。已有研究報(bào)道[17],PIK3CA高表達(dá)或突變與宮頸癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌及頭頸癌有關(guān)。為進(jìn)一步了解PIK3CA在SNSCC病理發(fā)展中的作用,本研究通過免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),SNSCC患者腫瘤組織中PIK3CA蛋白表達(dá)與腫瘤分化程度和臨床分期有關(guān),提示高表達(dá)的PIK3CA可促進(jìn)SNSCC病理進(jìn)展,相關(guān)機(jī)制可能是PIK3CA對(duì)癌細(xì)胞的增殖和侵襲具有促進(jìn)作用。WU等[18]研究發(fā)現(xiàn),單獨(dú)應(yīng)用PI3K抑制劑(LY294002)可降低白細(xì)胞介素(IL)-11介導(dǎo)的人舌鱗癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。此外,本研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)于鼻竇的鱗狀細(xì)胞癌組織中PIK3CA及p-AKT蛋白陽(yáng)性表達(dá)率更高,可能因?yàn)椴煌谠l(fā)鼻腔的SNSCC患者,原發(fā)于鼻竇內(nèi)早期多無明顯癥狀,門診發(fā)現(xiàn)時(shí)多已處于中晚期。

細(xì)胞周期調(diào)控異常是惡性腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵,而PTEN可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞間期及分裂期,在致瘤性轉(zhuǎn)化進(jìn)程中扮演了關(guān)鍵角色[19]。細(xì)胞質(zhì)中的PTEN可通過其脂質(zhì)磷酸酶活性拮抗PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路,使細(xì)胞停滯在G1期,抑制其存活及增殖等[20]。有研究[21-22]提出,PTEN在細(xì)胞核中也存在,且在保持基因組的穩(wěn)定性、DNA的錯(cuò)配修復(fù)和腫瘤抑制功能中發(fā)揮主要作用。PTEN蛋白異常表達(dá)與PTEN基因突變、缺失和甲基化等密切相關(guān),大多數(shù)研究表明,突變是其低表達(dá)的根本原因[23]。李玉蘭等[24]研究表明,miR-144-3p可通過抑制PTEN促進(jìn)PI3K/AKT信號(hào)通路活化,誘導(dǎo)口腔鱗癌細(xì)胞的惡性發(fā)展。還有研究發(fā)現(xiàn),PTEN是PI3K/AKT信號(hào)通路的主要負(fù)性調(diào)節(jié)因子,miR-96-5p上調(diào)可通過直接靶點(diǎn)PTEN促進(jìn)HNSCC細(xì)胞的遷移和化療耐藥性[25]。本研究結(jié)果顯示,PTEN蛋白在SNSCC組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于正常下鼻甲黏膜組織,由此推測(cè)SNSCC中PTEN缺失,可能導(dǎo)致PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的過度激活,進(jìn)而促進(jìn)SNSCC的發(fā)生、發(fā)展。此外,本研究未得出PTEN蛋白表達(dá)與SNSCC患者的臨床病理特征間存在關(guān)系,這與馮欽等[26]在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的研究結(jié)果一致。其原因可能是PTEN蛋白缺失是SNSCC發(fā)生過程中的晚期分子事件,或是樣本量較小,急需增加樣本量后進(jìn)一步研究。

PIK3CA和PTEN的突變可能是HNSCC的始動(dòng)因素[16]。有研究顯示,腫瘤中PIK3CA與PTEN蛋白表達(dá)有關(guān)[27]。本研究發(fā)現(xiàn),PIK3CA和PTEN蛋白表達(dá)在SNSCC組織中呈負(fù)相關(guān),對(duì)此作者有兩種猜想：(1)PIK3CA激活和PTEN缺失共存的SNSCC中,PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路傳導(dǎo)效率可明顯增強(qiáng)[20];(2)隨著SNSCC的發(fā)展,PTEN表達(dá)下調(diào)可延緩PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路傳導(dǎo)效率的衰減。生存分析顯示,PIK3CA蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者的中位生存期明顯低于陰性表達(dá)患者,進(jìn)一步驗(yàn)證了高表達(dá)的PIK3CA在SNSCC發(fā)展過程中的作用。溫菲菲等[28]對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌的研究顯示,PIK3CA是其預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究中,尚未發(fā)現(xiàn)PTEN與SNSCC患者預(yù)后存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,這可能與人乳頭瘤病毒(HPV)的感染狀態(tài)有關(guān),有研究[29]發(fā)現(xiàn),HPV陰性的腫瘤中PTEN缺失更為常見。此外,COCHICHO等[30]發(fā)現(xiàn),聯(lián)合HPV感染情況及PIK3CA表達(dá)狀態(tài)對(duì)HNSCC患者進(jìn)行分層診療,將能更準(zhǔn)確預(yù)測(cè)預(yù)后。

SNSCC病例本身較為罕見,且受限于治療方法,目前收集到的新鮮標(biāo)本有限,僅采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)組織中PIK3CA、p-AKT及PTEN蛋白表達(dá),今后將增加分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn),通過PCR技術(shù)等進(jìn)一步研究具體機(jī)制。PIK3CA、p-AKT及PTEN蛋白在SNSCC中的差異化表達(dá)可作為新型細(xì)胞因子區(qū)分腫瘤與正常組織,有助于早期發(fā)現(xiàn)與診療;PIK3CA及p-AKT蛋白在輔助判斷腫瘤的進(jìn)展程度及預(yù)后也有一定價(jià)值。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路雖與SNSCC的發(fā)生、發(fā)展相關(guān),但其在腫瘤發(fā)生過程中的具體機(jī)制仍需深入探索與研究,以期為SNSCC個(gè)體化精準(zhǔn)治療提供更全面的理論依據(jù)。