利勃隆促進雄性少精癥斑馬魚性行為和性腺發(fā)育及精子數(shù)量產(chǎn)生

趙成瑞,鄭新越,常明亮,康志云

(1.山西醫(yī)科大學汾陽學院,山西汾陽 032200;2.北京第一生物化學藥業(yè)有限公司,北京 101400)

全球約50%不孕不育由男性不育引起[1-3],男性不育目前已成為全球社會性疾病。研究報道,男性精液質(zhì)量和濃度均呈下降趨勢,少、弱精癥占男性不育癥的75%[4-7]。目前針對少、弱精子癥,臨床多用雌激素受體阻滯劑(如枸櫞酸氯米芬)進行治療,但存在潛在風險及用藥局限性,效果尚存爭議。睪酮替代療法也是普遍使用的治療方案,但其安全性仍是醫(yī)患擔憂的主要問題[8-9]。中醫(yī)藥(如五子衍宗丸)干預及治療效果呈散在性,缺乏大樣本、多中心的臨床試驗研究及臨床診治標準和依據(jù),同時自擬方的安全性及重復性無法得到有效驗證[10-11]。雖然輔助生殖技術(shù)滿足絕大多數(shù)少、弱精癥的生育需求,但操作要求高、費用高[12]。利勃隆是一種生物提取雄性激素類藥,主要成分為睪丸粉,由健康未變質(zhì)的新鮮或冷凍的牛、羊睪丸制成,臨床上主要用于治療神經(jīng)衰弱、發(fā)育遲緩、陽痿、男子更年期障礙等。目前尚無有關(guān)利勃隆治療少、弱精癥的研究。本實驗通過研究利勃隆對少精癥斑馬魚追尾行為、性腺發(fā)育和精子數(shù)量的影響,旨在為利勃隆提升男性性功能和治療少、弱精癥的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

利勃隆(批號H11022468)購自北京第一生物化學藥業(yè)有限公司,根據(jù)人用劑量換算[13],用養(yǎng)魚水配制成20.0 mg/mL母液,現(xiàn)配現(xiàn)用;環(huán)磷酰胺(批號A2112310)購自阿拉丁試劑(上海)有限公司,用養(yǎng)魚水配制;枸櫞酸氯米芬(批號L0807)購自上海塞浦路斯高特制藥有限公司,用二甲基亞砜(DMSO)配制成10.0 mg/mL母液,-20 ℃儲存?zhèn)溆?五子衍宗丸(批號18035166)購自中國北京同仁堂(集團)有限公司,超純水配制成6.00 mg/mL母液,-20 ℃儲存?zhèn)溆?DMSO(批號BCCD8942)購自德國Sigma公司;GENMED精子活力熒光染色試劑盒(批號H2MT0003)購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 主要儀器

網(wǎng)絡(luò)硬盤錄像機(DH-HCVR4104HC-V4)購自浙江大華技術(shù)股份有限公司,解剖顯微鏡(SZX7)購自日本Olympus公司,CCD相機(VertA1)購自上海土森視覺科技有限公司,電動聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡(AZ100)購自日本Nikon公司,電子天平(CP214)購自奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司、高速冷凍離心機(PICO17/21)購自美國Thermo Fisher公司、高速組織研磨器(MY-10)購自拓赫機電科技(上海)有限公司,另有解剖鑷、彈簧剪等。

1.3 實驗動物與分組

實驗前,受精后10月齡(10 mpf)自然成對交配繁殖AB品系雄性斑馬魚(由杭州環(huán)特生物養(yǎng)魚中心提供)飼養(yǎng)于28 ℃的養(yǎng)魚水中,智能開關(guān)控制光照晝夜時間比為14 h∶10 h。每升反滲透水中加入200 mg速溶海鹽,電導率為450～550 μS/cm,pH為6.5～8.5,硬度為50～100 mg/L CaCO3。每天常規(guī)飼料喂養(yǎng)。飼養(yǎng)管理符合國際實驗動物飼養(yǎng)管理評估認證委員會(AAALAC)認證的要求(認證編號001458)。取56尾雄性斑馬魚分為7組,分別為正常組,模型組,2個陽性對照組(枸櫞酸氯米芬組、五子衍宗丸組),利勃隆低、中、高濃度組,各組斑馬魚均置于1.2 L “爬坡”交配培養(yǎng)缸(圖1)。除正常組外,各組均給予200 μg/mL環(huán)磷酰胺配液,每天1次,連續(xù)染毒8 d,建立斑馬魚少精癥模型。建模第9天開始,按照枸櫞酸氯米芬組0.1 μg/mL濃度,五子衍宗丸組6 μg/mL濃度,利勃隆低、中、高濃度組200、300、900 μg/mL濃度給予相應(yīng)藥物,每天1次,持續(xù)8 d。期間各組正常喂食。

1：1區(qū);2：2區(qū)。

1.4 檢測方法

1.4.1追尾頻數(shù)

模型建立第16天后,撈取正常雌性斑馬魚按1∶1比例置于各組培養(yǎng)缸,鏤空隔板隔開雄雌魚12 h后,拔掉隔板,錄像機記錄各組雄雌魚追尾情況：雄魚頻繁將雌魚由1區(qū)經(jīng)“爬坡”追逐至2區(qū),雌魚在2區(qū)被迫轉(zhuǎn)彎回游,速度下降,雄雌魚追尾。雄魚追到雌魚后頭部緊頂著雌魚腹部的行為即為斑馬魚追尾,追尾頻數(shù)可反應(yīng)性行為活躍度,見圖1。

1.4.2體長、體重和精巢重量測量

斑馬魚追尾頻數(shù)統(tǒng)計后,撈取雄性斑馬魚,按組用MS-222麻醉,吸水紙吸去斑馬魚體表水,分別用CCD相機拍照測量體長,電子天平稱量體重;在解剖顯微鏡下,剪開腹腔,取出精巢,放入離心管稱重量。

1.4.3精子數(shù)量測定

精巢稱重量后,研磨、離心取上清液,按照GENMED精子活力熒光染色試劑盒說明書步驟進行精子染色,染色結(jié)束后置于熒光顯微鏡下拍照,每尾斑馬魚觀察2個視野。用Image J高級圖像處理軟件分析并采集數(shù)據(jù),統(tǒng)計精子數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 利勃隆對斑馬魚追尾的影響

與正常組[(25.33±2.50)次/min]比較,模型組[(2.93±1.28)次/min]斑馬魚追尾頻數(shù)明顯降低(P<0.001);與模型組比較,枸櫞酸氯米芬組[(15.67±2.31)次/min,P<0.001]和五子衍宗丸組[(20.87±3.07)次/min,P<0.001],以及利勃隆低[(16.20±1.97)次/min]、中[(21.07±3.06)次/min]、高[(17.00±1.31)次/min]濃度組(均P<0.001)斑馬魚追尾頻數(shù)均明顯升高,其中利勃隆低、中、高濃度組中,以利勃隆中濃度組斑馬魚追尾頻數(shù)最高,斑馬魚性行為活躍度最明顯。

2.2 利勃隆對斑馬魚體長、體重、精巢重量、精子數(shù)量的影響

2.2.1利勃隆對斑馬魚體長的影響

與正常組比較,模型組斑馬魚體長明顯變短(P<0.001);與模型組比較,枸櫞酸氯米芬組(P<0.001)和五子衍宗丸組(P<0.001),以及利勃隆低、中、高濃度組(P<0.001、P<0.001、P=0.002)斑馬魚體長均明顯增加(P<0.01),見圖2。

a：P<0.001,與正常組比較;b：P<0.01,c：P<0.001,與模型組比較。

2.2.2利勃隆對斑馬魚體重的影響

與正常組比較,模型組斑馬魚體重明顯減輕(P<0.001);與模型組比較,枸櫞酸氯米芬組(P=0.013)和五子衍宗丸組(P=0.014),以及利勃隆低、中、高濃度組(P=0.004、0.002、0.003)斑馬魚體重均明顯增加,見圖3。

a：P<0.001,與正常組比較;b：P<0.01,c：P<0.001,與模型組比較。

2.2.3利勃隆對斑馬魚精巢重量的影響

與正常組比較,模型組斑馬魚精巢重量明顯減輕(P<0.01);與模型組比較,枸櫞酸氯米芬組(P=0.013)和五子衍宗丸組(P=0.021),以及利勃隆低、中、高濃度組(P=0.007、0.006、0.005)斑馬魚精巢重量均明顯增加,見圖4。

a：P<0.001,與正常組比較;b：P<0.01,c：P<0.001,與模型組比較。

2.2.4利勃隆對斑馬魚精子數(shù)量的影響

與正常組比較,模型組斑馬魚精子數(shù)量明顯減少(P<0.001);與模型組比較,枸櫞酸氯米芬組(P=0.040)和五子衍宗丸組(P<0.001),以及利勃隆低、中、高濃度組(P=0.048、P<0.001、P=0.010)斑馬魚精子數(shù)量明顯增加;利勃隆中濃度組與陽性對照組(枸櫞酸氯米芬組和五子衍宗丸組)及利勃隆低、高濃度組間比較,差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.001、P=0.003、P<0.001、P<0.001),見圖5。

a：P<0.001,與正常組比較;b：P<0.05,c：P<0.01,d：P<0.001,與模型組比較;e：P<0.01,與陽性對照組(枸櫞酸氯米芬組和五子衍宗丸組)比較;f：P<0.001,與利勃隆低、高濃度組比較。

3 討 論

本實驗采用環(huán)磷酰胺處理雄性斑馬魚,建立斑馬魚少精癥模型。環(huán)磷酰胺是目前已明確可損害生精功能的化學藥物之一,它可殺傷分化中的精原細胞,導致長期無精或少精,是實驗采用較多的誘導少、弱精或生殖系統(tǒng)損傷模型的技術(shù)。斑馬魚易養(yǎng)殖、性成熟快、易給藥、易建模,其基因與人類基因的相似度達87%[14-15],其信號傳導通路、生理結(jié)構(gòu)及功能與哺乳動物高度相似[16-17],適合用于人類生殖功能發(fā)育和損傷修復研究。利勃隆是一款上市多年的雄性激素類藥,用于治療神經(jīng)衰弱、發(fā)育遲緩、男子更年期障礙等疾病,其富含豐富的蛋白偶聯(lián)睪酮、精氨酸及各類生化因子和無機元素,起效成分和作用機制目前暫不明確。本研究各項檢測指標提示,利勃隆對雄性少精癥斑馬魚身體發(fā)育(體長、體重)有促進作用,對性行為活躍度(追尾頻次)、生殖系統(tǒng)功能(精巢重量、精子數(shù)量)有提升作用。與陽性對照組枸櫞酸氯米芬和五子衍宗丸相比,精子數(shù)量的提升有明顯優(yōu)勢。

臨床上,大多不育癥男性被檢查出睪酮水平異常。本課題組前期通過小鼠模型實驗證實,利勃隆作為一款純生物提取生化藥品,具有成分復雜、多靶點特點,其所含睪酮成分是以與雄激素結(jié)合蛋白結(jié)合及游離方式存在,用藥后具有快速提升血清睪酮作用。關(guān)于內(nèi)源性睪酮與男性不孕的關(guān)系,張楓[3]回顧性分析100例已婚不育男性的臨床資料發(fā)現(xiàn),血清中促卵泡生成素和睪酮水平與精子質(zhì)量密切相關(guān),是導致男性不育的獨立風險因素。陳創(chuàng)奇等[18]報道,男性不育癥患者血清游離睪酮和生物活性睪酮水平越高,則正常形態(tài)精子百分率越高。鐘匯等[19]研究發(fā)現(xiàn),檢測血清生殖激素水平有利于指導少、弱精癥患者的臨床診療。經(jīng)對利勃隆活性成分及營養(yǎng)成分定性檢測,其還含有大量雄激素結(jié)合蛋白及精氨酸等活性成分,且存在許多營養(yǎng)因子和促進睪丸間質(zhì)細胞活性的成分。作者認為,雄激素結(jié)合蛋白能與睪酮結(jié)合并有效提高精曲小管內(nèi)睪酮水平,保證精子生成需要;精氨酸為精子合成的主要原料,對于生精及精子質(zhì)量提升具有明顯效果。睪丸間質(zhì)細胞是合成與分泌睪酮的主要場所,人體95%的睪酮由睪丸間質(zhì)細胞合成與分泌[20]。利勃隆中存在的許多營養(yǎng)因子及促進睪丸間質(zhì)細胞活性的成分,能夠促進睪丸間質(zhì)細胞分泌睪酮,全面改善和提升性腺功能,提升男性的睪丸儲備功能和生育能力,改善精子質(zhì)量和數(shù)量[21]。

本研究對利勃隆在促進性行為、性腺發(fā)育及精子數(shù)量產(chǎn)生的功效及相關(guān)成分作用機制進行了初步探索與分析,并利用科學的動物學實驗加以證實,但在對該藥物中起效成分的定性定量分析、藥效評價及其作用機制的研究上,尚未開展實驗研究,以上方面將是課題組后續(xù)研究的內(nèi)容。本研究結(jié)果為利勃隆老藥新用的開發(fā)提出了新的研究方向和思路。