右美托咪定對腦出血小鼠肥大細胞激活及神經(jīng)功能損傷的影響

楊正宇,毛慶祥

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院麻醉科,重慶 400042)

腦出血是一種危及生命的重大疾病,其致殘率和病死率都很高[1-2]。肥大細胞來源于造血干細胞,分布于機體組織、器官、血管周邊[3]。研究發(fā)現(xiàn),腦出血后會誘發(fā)腦內(nèi)肥大細胞激活,并釋放類胰蛋白酶、白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等物質(zhì),從而加重腦出血后腦損傷[4]。右美托咪定是一種具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和抗炎作用的α受體激動劑[5],對神經(jīng)系統(tǒng)具有保護作用[6],但其對腦出血神經(jīng)功能恢復(fù)的作用及機制不明。有研究報道,右美托咪定可抑制心臟肥大細胞脫顆粒從而減輕心肌缺血再灌注損傷[7],然而右美托咪定能否抑制腦內(nèi)肥大細胞激活從而改善腦出血后神經(jīng)功能尚未見文獻報道。本研究通過建立小鼠腦出血模型,探討肥大細胞激活在小鼠腦出血后腦損傷中的作用及右美托咪定對小鼠腦出血后腦保護作用的相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

27只雄性昆明鼠(25～30 g)購自重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心,小鼠飼養(yǎng)環(huán)境：溫度18～28 ℃,相對濕度40%～80%,每天進食正規(guī)鼠糧。本實驗符合《實驗室動物飼養(yǎng)和使用條例》并通過重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)研究倫理委員會審查。將小鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組(Sham組)、腦出血組(ICH組)和右美托咪定組(Dex組),每組9只,ICH組在小鼠腦內(nèi)注射30 μL自體血,Sham組不注射自體血,Dex組在腦出血造模前30 min經(jīng)腹腔注射右美托咪定(揚子江藥業(yè)集團有限公司,H20183219)50 μL/kg。

1.2 方法

1.2.1腦出血模型 根據(jù)LI等[8]的方法制備腦出血模型：1%戊巴比妥鈉5 mL/kg腹腔給藥麻醉小鼠,并將小鼠置于神經(jīng)定位儀(深圳市瑞沃德有限公司),以小鼠前囟為坐標(biāo),首先向前移動0.5 mm,然后向右移動2.3 mm,最后垂直向下移動3.7 mm。用肝素液潤滑過的微量注射器(上海市高鴿工貿(mào)公司)采集小鼠尾部自體血30 μL注射,注射完畢后使微量注射器停留于靶注射點,10 min后緩慢退出微量注射器,以此來模擬腦出血,最后進行徹底消毒,縫合切口。造模成功后24 h進行神經(jīng)功能檢測,隨即進行腦含水量檢測、HE染色、免疫熒光染色和Western blot實驗。

1.2.2神經(jīng)行為學(xué)評分

根據(jù)LIU等[9]評分指標(biāo),采用mNSS測試檢測小鼠神經(jīng)功能,mNSS測試分為運動實驗、感覺實驗、平衡木實驗及反射喪失和不正常運動實驗,4項實驗的評分總和為mNSS測試評分,mNSS測試最低評分0分,最高評分18分,評分越高說明神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。實驗采用雙盲法。

1.2.3蘇木精-伊紅染色

小鼠麻醉后經(jīng)心尖灌注4 ℃ 0.9%氯化鈉(30 mL/只),并用4%多聚甲醛固定(30 mL/只),然后將腦組織置于蔗糖溶液中脫水,最后將腦組織包埋,放置于冰凍切片機中,20 min速凍,切取厚度為10 μm的腦冠狀切片,HE染色液(上海Sangon Biotech有限公司)染色腦組織切片5 min,然后用清水沖洗切片,0.1%鹽酸乙醇分色15 s,最后將組織切片放入95%乙醇脫水并用二甲苯澄清,裝片。每組各取小鼠3只,共9只,在小鼠腦出血后24 h進行。

1.2.4腦含水量測定

小鼠斷頭取腦,分別測量腦組織的濕重和干重,并計算腦含水量,計算公式為：(濕重-干重)/濕重×100%。每組各取小鼠3只,共9只,在小鼠腦出血后24 h進行。

1.2.5免疫熒光染色

將30 μL封閉液滴加到組織切片上,經(jīng)過1 h封閉,晾干后滴加20 μL(1∶100)小鼠抗小鼠類胰蛋白酶單克隆抗體(1∶1 000,美國Novus Biologicals公司),并將其置于4 ℃冰箱孵育過夜。次日,用0.01% PBST漂洗組織切片15 min,重復(fù)3次,晾干后滴加20 μL美國Abbkine公司FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶100),置于37 ℃溫箱中孵育1 h,以確保完全結(jié)合,然后用0.01% PBST漂洗15 min并重復(fù)3次,晾干后滴加DAPI(上海碧云天生物技術(shù)公司)溶液20 μL,最后封片并將切片置于熒光顯微鏡下計算肥大細胞數(shù)量。每組小鼠3只,共9只,在小鼠腦出血后24 h進行。

1.2.6Western blot

將小鼠麻醉后暴露心臟,然后經(jīng)心尖灌注生理鹽水30～40 mL,取出小鼠大腦,分離出血側(cè)腦組織稱重,每1 g腦組織中加入8 mL的組織裂解液,并將其充分研磨后,靜置15 min,然后置于4 ℃離心機,12 000 r/min離心20 min,提取上清液,與5×loading buffer以4∶1的配比混勻,最后在95 ℃的溫度下煮5 min。將上樣蛋白樣品通過SDS-PAGE電泳和電轉(zhuǎn)(250 mA,30～50 min)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,在37 ℃搖床封閉2 h后,將小鼠抗小鼠類胰蛋白酶單克隆抗體、兔抗小鼠IL-1β和TNF-α單克隆抗體(1∶700,美國Affinity公司)和大鼠抗小鼠β-actin多克隆抗體(1∶5 000,美國Santa Cruz公司)滴加到PVDF膜上,并放入4 ℃冰箱孵育過夜。次日,用0.01% PBST清洗PVDF膜3次,每次10 min,然后將PVDF膜放入稀釋比為1∶5 000的二抗液中孵育1 h,再次清洗PVDF膜3次,每次10 min。最后將ECL發(fā)光液100 μL滴加到PVDF膜,靜置30 s后,置于凝膠成像儀(廣州光儀科技公司)中檢測蛋白表達量。每組各取小鼠3只,共9只,在小鼠腦出血后24 h進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 右美托咪定減輕小鼠腦出血后神經(jīng)運動功能障礙

mNSS測試結(jié)果顯示,ICH組小鼠神經(jīng)運動功能評分較Sham組明顯提高(P<0.05),而Dex組神經(jīng)運動功能評分較ICH組有所下降(P<0.05),較Sham組神經(jīng)運動功能評分提高(P<0.05),見圖1。

圖1 各組小鼠神經(jīng)運動功能損傷程度

2.2 右美托咪定減輕小鼠腦出血后腦水腫

HE染色結(jié)果顯示,與Sham組相比,ICH組血腫周圍腦組織腫脹明顯,表現(xiàn)為空泡樣自溶壞死,而Dex組一定程度逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象。腦含水量檢測結(jié)果顯示,ICH組右側(cè)大腦含水量明顯高于Sham組(P<0.05),而Dex組右側(cè)大腦含水量明顯低于ICH組(P<0.05),見圖2。

A：Sham組HE染色圖,Bar=50 μm;B：ICH組HE染色圖,Bar=50 μm;C：Dex組HE染色圖,Bar=50 μm;D：腦含水量檢測結(jié)果。a：P<0.05,與Sham組比較;b：P<0.05,與ICH組比較。

2.3 右美托咪定減少小鼠腦出血后肥大細胞數(shù)量

免疫熒光結(jié)果顯示,ICH組血腫周圍肥大細胞數(shù)量較Sham組增多(P<0.05),而Dex組肥大細胞數(shù)量較ICH組減少(P<0.05),見圖3。

A：肥大細胞數(shù)量統(tǒng)計圖;B：免疫熒光染色圖,Bar=50 μm。a：P<0.05,與Sham組比較;b：P<0.05,與ICH組比較。

2.4 右美托咪定降低小鼠腦出血后腦內(nèi)類胰蛋白酶、IL-1β和TNF-α表達

Western blot結(jié)果顯示,ICH組小鼠腦內(nèi)類胰蛋白酶、IL-1β和TNF-α表達較Sham組明顯增加(P<0.05),而Dex組小鼠腦內(nèi)類胰蛋白酶、IL-1β和TNF-α表達較ICH組明顯減少(P<0.05),見圖4。

3 討 論

腦出血后會引發(fā)神經(jīng)功能損傷,血腫對腦組織的壓迫會導(dǎo)致原發(fā)性腦損傷,而腦出血后血腫周圍的一系列病理生理反應(yīng)會導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷[10-12]。然而,有關(guān)腦出血后繼發(fā)性腦損傷的機制尚不完全清楚,缺乏有效的防治措施。有研究發(fā)現(xiàn),腦出血會誘發(fā)腦內(nèi)肥大細胞激活并發(fā)生脫顆粒從而加重腦出血后炎性反應(yīng),進而加重腦出血后繼發(fā)性腦損傷[13]。本研究結(jié)果顯示,小鼠腦出血后腦組織內(nèi)類胰蛋白酶、IL-1β和TNF-α表達量增加,并且血腫周圍肥大細胞數(shù)量增多,這表明腦出血后肥大細胞激活,從而引發(fā)肥大細胞脫顆粒,這與之前的研究結(jié)果相符。

右美托咪定對腦出血后腦損傷有保護作用,有研究指出,右美托咪定通過抑制神經(jīng)元自噬作用、凋亡和炎性反應(yīng)而起到神經(jīng)保護作用[14-18]。臨床研究表明,右美托咪定對高血壓腦出血患者具有一定的腦保護作用,并且對患者的呼吸和循環(huán)影響較小,是高血壓腦出血患者圍術(shù)期鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛治療的安全有效藥[19-20]。另有研究報道,右美托咪定可以有效抑制肥大細胞激活,從而減輕脊髓缺血再灌注損傷。此外,研究還發(fā)現(xiàn),右美托咪定通過抑制肥大細胞激活來減輕丁哌卡因誘發(fā)的坐骨神經(jīng)炎性反應(yīng)[21-22]。在本研究中,Western blot實驗表明：右美托咪定可以降低小鼠腦出血后類胰蛋白酶、IL-1β和TNF-α的表達;免疫熒光實驗和甲苯胺藍染色實驗結(jié)果顯示：右美托咪定明顯減少了小鼠腦出血后血腫周圍肥大細胞數(shù)量,從而減輕了小鼠腦出血后腦水腫和神經(jīng)功能損傷。因此,筆者推測右美托咪定可通過抑制肥大細胞激活而減輕小鼠腦出血后腦損傷。然而,右美托咪定抑制肥大細胞激活的具體機制需要更深一步探究,有研究報道,右美托咪定通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)而減輕小鼠腦損傷[23],在后續(xù)的研究中本課題組將探索右美托咪定是否通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)而減輕肥大細胞脫顆粒,從而減輕腦出血后腦損傷。

綜上所述,小鼠腦出血后,腦內(nèi)肥大細胞激活并加重神經(jīng)功能損傷。右美托咪定可能通過抑制肥大細胞激活而改善神經(jīng)功能損傷。本實驗是在小鼠腦出血前給予右美托咪定,而對于腦出血后給予右美托咪定能否減輕腦出血后腦損傷值得研究,本實驗對右美托咪定的腦保護作用提出了新的觀點。