神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1對膿毒癥大鼠心肌損傷的作用研究

徐 超,黃 榮,趙鴻雁,曹 靜

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院昌吉分院：1.重癥醫(yī)學(xué)科;2.心理醫(yī)學(xué)科,新疆昌吉 831110)

膿毒癥是指宿主對感染反應(yīng)失調(diào)引起的危及生命的器官功能障礙。全球膿毒癥每年發(fā)病率為189/10萬人,膿毒癥的病死率為20%～50%,若合并心肌損傷,病死率明顯增加[1-3],數(shù)據(jù)顯示膿毒癥患者中有40%～50%會發(fā)生心肌損傷和心功能不全[4]。有研究指出神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(NRG-1)可以調(diào)節(jié)微血管內(nèi)皮細(xì)胞與心肌細(xì)胞間的相互作用[5],包括心臟血管生成、心肌炎癥的抑制等,且細(xì)胞因子過度產(chǎn)生[6]、炎癥反應(yīng)[7]及心肌凋亡[8]也是膿毒癥誘導(dǎo)心肌損傷的潛在分子機制[9]。本研究旨在通過分析NRG-1對膿毒癥心肌損傷相關(guān)指標(biāo)的影響,探討NRG-I對膿毒癥心肌損傷的作用,為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

隔水式恒溫培養(yǎng)箱B6-270、烘干箱BXH-280購自上海博迅實業(yè)有限公司;漩渦混合器GL-88B購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司;迷你離心機MLX-206購自美國Crystal公司;光學(xué)顯微鏡DM4000購自德國Leica公司;酶標(biāo)儀K6600A購自北京凱奧科技發(fā)展有限公司;高速冷凍離心機H2050R購自湖南湘儀動力測試儀器有限公司;Bio小型垂直電泳及轉(zhuǎn)印裝置1645050購自美國Biorad公司;化學(xué)發(fā)光成像儀WD-9423C購自北京六一生物科技有限公司。

1.2 實驗動物、藥品與試劑

選用無特定病原體(SPF)級6～8周齡雄性SD大鼠72只,體重200～300 g,大鼠購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心,許可證號SYXK(新)2018-0001。NRG-1(281228)購自美國Abcam公司;肌酸激酶(CK)ELISA試劑盒(BC1145)購自北京索萊寶科技有限公司;肌酸激酶同工酶(CK-MB)ELISA試劑盒(H197-1-2)購自南京建成生物工程研究所;超敏肌鈣蛋白(cTnⅠ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)ELISA試劑盒(JL50540-96T、JL13202-96T、JL20896-96T)購自上海江萊生物科技有限公司;磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)抗體(AP0098)、磷酸化糖原合酶激酶3β(p-GSK3β)抗體(bs-2066R)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白抗體(bs-4563R)、Bax蛋白抗體(bs-0127R)、β-actin抗體(AH11286487)、辣根過氧化物歧化酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(BJ06217694)購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1膿毒癥模型的建立

采用盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)法制作大鼠膿毒癥模型：術(shù)前禁食12 h,不禁水,使用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(40 mg/kg),仰臥位固定。右頸外靜脈置管用于輸液。備皮,消毒后行腹中線切口,長度 1.0～1.5 cm,尋找到盲腸后,移出腹腔,在距根部 1/4 處用 4 號絲線結(jié)扎,用 18 號針對穿腸壁刺兩次,擠出少量內(nèi)容物,將腸管回納入腹腔,使得腸內(nèi)容物持續(xù)溢出,逐層關(guān)腹,術(shù)后立即皮下注射乳酸鈉林格液50 mL/kg,所有大鼠經(jīng)靜脈給予營養(yǎng)支持。術(shù)后大鼠放回籠中,自由進(jìn)食、飲水,保持室溫 25 ℃。

1.3.2分組與給藥

雄性SD大鼠72只,給予標(biāo)準(zhǔn)飲食和飲水,所有大鼠實驗前均給予至少5 d時間適應(yīng)環(huán)境。SD大鼠被分為3組,分別為假手術(shù)組(n=24)、膿毒癥組(n=24)及膿毒癥+NRG組(n=24),以上3組分造模12、24 h兩個觀察點,每個時間點亞組12只。膿毒癥組和膿毒癥+NRG組采用CLP法制備大鼠膿毒癥模型;假手術(shù)組除不進(jìn)行CLP手術(shù),其他操作和膿毒癥組一致。3組大鼠于術(shù)前30 min被腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)進(jìn)行麻醉;膿毒癥+NRG組麻醉成功后,將其仰臥并固定于鼠板,經(jīng)腹腔注射重組人NRG(rhNRG,10 μg/kg)。假手術(shù)組麻醉成功后于腹腔注射同等體積生理鹽水。成功造模12、24 h后,分別取各亞組存活大鼠心臟及外周血清。

1.3.3HE染色觀察心臟組織病理形態(tài)變化

將上述操作得到的大鼠心臟置于10%甲醛固定7 d后,進(jìn)行石蠟包埋、切片。二甲苯浸泡20 min脫蠟,梯度乙醇(95%、85%、70%)各浸泡5 min充分水化后,滴加蘇木素染色10 min,自來水反藍(lán)5 min。滴加伊紅染色3 min,染色完畢后,將組織切片再次進(jìn)行梯度乙醇(80%、95%、100%)脫水。待組織樣本切片干燥后,使用中性樹膠封片。100×視野的正置顯微鏡拍片。

1.3.4ELISA檢測血清及心肌組織中心肌酶水平變化

收集各亞組大鼠血清,采用CK、CK-MB、cTnⅠ ELISA試劑盒檢測血清中CK、CK-MB、cTnⅠ水平,步驟嚴(yán)格按照檢測試劑盒說明書進(jìn)行。收集各亞組模型大鼠心臟組織,采用TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒檢測心肌組織中TNF-α、IL-6水平,步驟參照各試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.5Western blot檢測心肌組織中心肌損傷相關(guān)蛋白水平變化

收集各亞組模型大鼠心臟組織,液氮浸泡后研磨,加入預(yù)冷組織裂解液(RIPA)裂解,冰上孵育60 min,4 ℃、12 000 r/min離心20 min,取上清液。蛋白定量試劑盒(BCA)進(jìn)行蛋白定量。Western blot方法檢測各亞組心肌組織中p-Akt、p-GSK3β、Bcl-2蛋白、Bax蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清CK、CK-MB表達(dá)水平比較

造模12、24 h,與假手術(shù)組比較,膿毒癥組大鼠血清CK、CK-MB表達(dá)水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與膿毒癥組比較,膿毒癥+NRG組大鼠血清CK、CK-MB表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠血清CK、CK-MB表達(dá)水平比較

2.2 大鼠心臟組織HE染色

HE 染色結(jié)果顯示假手術(shù)組大鼠心臟組織未見病理改變,膿毒癥組大鼠心臟組織產(chǎn)生明顯的病變,可見心臟外膜出血,且造模24 h亞組出血量較造模12 h 亞組多;膿毒癥+NRG 組造模12 h 亞組大鼠心臟組織見少量炎性細(xì)胞浸潤,少量纖維組織增生;膿毒癥+NRG組造模24 h 亞組大鼠心臟組織見少量炎性細(xì)胞浸潤,見圖1。

圖1 各組大鼠心臟組織病理圖(HE染色,100×)

2.3 各組大鼠血清cTnⅠ及心肌組織TNF-α、IL-6的表達(dá)水平比較

造模12、24 h,與假手術(shù)組比較,膿毒癥組大鼠血清cTnⅠ及心肌組織TNF-α、IL-6均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與膿毒癥組比較,膿毒癥+NRG組大鼠血清cTnⅠ及心肌組織TNF-α、IL-6均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠血清cTnⅠ及心肌組織TNF-α、IL-6的表達(dá)水平比較

2.4 各組大鼠心肌組織中p-Akt、p-GSK3β、Bcl-2蛋白、Bax蛋白表達(dá)水平比較

Western blot結(jié)果顯示,造模12、24 h,與假手術(shù)組比較,膿毒癥組大鼠心肌組織中p-Akt、p-GSK3β表達(dá)水平降低,Bax蛋白表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);造模24 h,與膿毒癥組比較,膿毒癥+NRG組大鼠心肌組織Bax表達(dá)水平降低,p-AKT、p-GSK3β表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);造模12、24 h,Bcl-2在各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖2,表3、4。

1：假手術(shù)組(12 h);2：模型組(12 h);3：模型+NRG組(12 h);4：假手術(shù)組(24 h);5：模型組(24 h);6：模型+NRG組(24 h)。

表3 造模12 h時各組大鼠心肌組織中p-Akt、p-GSK3β、Bcl-2蛋白、Bax蛋白條帶灰度值

表4 造模24 h時各組大鼠心肌組織中p-Akt、p-GSK3β、Bcl-2蛋白、Bax蛋白條帶灰度值

3 討 論

膿毒癥患者若并發(fā)心肌損傷可加重病情,增加死亡率[10],心肌損傷所致心功能不全與膿毒癥致死亡率明顯相關(guān)(70%～90%)[11],因此,膿毒癥心肌損傷的治療非常重要。本課題組前期研究已證實,抑制心肌炎癥介質(zhì)(IL-6、TNF-α)可減輕膿毒癥大鼠心肌損傷[12]。且有研究發(fā)現(xiàn)在膿毒癥休克中,心肌損傷可能是由TNF-α和IL-6的協(xié)同作用所致[13]。NRG-1/ErBbs 系統(tǒng)在抑制炎癥反應(yīng)、保護神經(jīng)功能方面作用極其重要[14-16]。但NRG-1是否通過降低炎癥反應(yīng)保護膿毒癥后心肌損傷目前尚不清楚,有待進(jìn)一步闡明。

近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn),膿毒癥大鼠CK、CK-MB及cTnⅠ較健康大鼠明顯升高,其中cTnⅠ是預(yù)測膿毒癥大鼠心肌損傷敏感度和特異度較高的指標(biāo),cTnⅠ增高,既可反映缺血性心臟病,也可反映膿毒癥性心肌損傷。本研究也在動物模型中證實膿毒癥大鼠血清中CK、CK-MB及cTnⅠ水平明顯升高,與上述研究一致。膿毒癥最主要特征是全身炎癥反應(yīng),IL-6、TNF-α等炎癥指標(biāo)明顯升高,有研究表明炎癥因子參與膿毒癥心肌損傷的發(fā)生、發(fā)展[17]。同時,還有研究證實IL-6、TNF-α等炎癥因子高低與膿毒癥誘導(dǎo)的心肌損傷嚴(yán)重程度密切相關(guān)[18],炎癥因子也激活炎癥細(xì)胞促使炎癥級聯(lián)反應(yīng)。本研究檢測了各組大鼠心肌組織中的TNF-α、IL-6的表達(dá)水平,顯示膿毒癥組大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6水平明顯增高,提示炎癥因子TNF-α、IL-6在膿毒癥心肌損傷發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用,與劉治國等[19]的研究結(jié)果一致。

NRG-1是一種主要分布于神經(jīng)和心血管系統(tǒng)的表皮生長因子樣蛋白,其所在信號通路參與多種心臟活動過程,包括心臟血管生成、心肌炎癥的抑制等,并在缺血性心肌損傷中減輕心肌微血管內(nèi)皮損傷、改善心肌缺血達(dá)到保護心肌的作用。在心肌損傷時,內(nèi)皮細(xì)胞釋放NRG-1,可通過Akt信號通路,抑制細(xì)胞色素C的釋放和細(xì)胞凋亡而保護心肌。本實驗對膿毒癥模型大鼠進(jìn)行腹腔注射rhNRG-1,大鼠血清中CK、CK-MB水平明顯下降,心臟組織中炎癥因子TNF-α、IL-6表達(dá)水平明顯下降,表明NRG-1抑制了膿毒癥大鼠心肌組織中炎癥因子的表達(dá),從而減輕了心肌組織的損傷,對改善膿毒癥心肌損傷有一定意義,而NRG-1改善膿毒癥心肌損傷的機制需進(jìn)一步研究。

Akt激活是多種生長因子發(fā)揮促細(xì)胞生存的重要前提,Akt通路在損傷組織的再生、修復(fù)、重構(gòu)和再上皮化中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)Akt磷酸化后激活下游靶向酶標(biāo)GSK3β使其磷酸化,進(jìn)而控制下游靶基因影響生命活動[20]。有研究發(fā)現(xiàn),miRNA-214可通過調(diào)控Akt通路減輕膿毒癥大鼠心肌損傷[21],提示膿毒癥心肌損傷的發(fā)生可能與Akt通路有關(guān),為進(jìn)一步證實該推測,本研究檢測各組大鼠心肌組織中p-Akt、p-GSK3β表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)膿毒癥組大鼠心肌中其表達(dá)水平較假手術(shù)組下調(diào),但給予腹腔注射rhNRG-1處理24 h后,膿毒癥大鼠心臟組織中p-Akt、p-GSK3β表達(dá)水平上調(diào),表明膿毒癥心肌損傷與Akt通路相關(guān),且NRG-1增強了膿毒癥大鼠心肌組織中p-Akt、p-GSK3β的表達(dá),抑制了膿毒癥大鼠促炎因子TNF-α、IL-6表達(dá),從而減輕了心肌損傷。這可能與Akt信號通路開啟或關(guān)閉一些下游調(diào)控蛋白如GSK3有關(guān),GSK-3β底物又能促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活,Akt激活后磷酸化下游靶標(biāo),參與了心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展[21]。Bax蛋白是程序性細(xì)胞死亡的重要促凋亡介質(zhì),屬于Bcl-2蛋白家族,通常與抗凋亡分子Bcl-2蛋白相互作用影響細(xì)胞凋亡程序[22]。本研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥組大鼠心肌組織中促凋亡因子Bax較假手術(shù)組升高,提示膿毒癥不僅可造成心肌細(xì)胞壞死,影響心臟功能,還可促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。有研究表明Akt通路可抑制Bax蛋白磷酸化,進(jìn)而使其失活抑制細(xì)胞凋亡[23]。本研究也發(fā)現(xiàn),經(jīng)腹腔注射rhNRG-1處理后,膿毒癥+NRG組大鼠p-Akt表達(dá)水平較膿毒癥組升高,且Bax蛋白表達(dá)水平較膿毒癥組降低,從而達(dá)到保護心肌的作用。但Bcl-2蛋白的作用在本實驗中未得到證實,在后期的實驗中作者會持續(xù)關(guān)注。

膿毒癥心肌損傷發(fā)病機制復(fù)雜,結(jié)合前期研究認(rèn)為是多通路、多因素參與的結(jié)果,不能用單一的分子機制或炎癥通路解釋清楚,本課題組將繼續(xù)專注于膿毒癥心肌損傷機制的研究,為進(jìn)一步探索膿毒癥心肌損傷的治療提供新思路。