基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜法定性分析啤酒中的β-葡聚糖

化敬言

（廈門大學(xué)，福建 廈門 361005）

1 前言

啤酒是一種以麥芽、啤酒花、水和酵母為原料，經(jīng)過(guò)液態(tài)糊化和糖化，再經(jīng)過(guò)液態(tài)發(fā)酵釀制而成的酒精飲料。啤酒的歷史可以追溯到美索不達(dá)米亞文明，因?yàn)槠錉I(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、口感好，啤酒已成為世界上消費(fèi)最多的酒精飲料之一。

在釀造啤酒的過(guò)程中，麥芽汁中的淀粉類物質(zhì)會(huì)在淀粉酶的作用下水解，形成葡聚糖和其他副產(chǎn)物。其中，β-葡聚糖是最主要的一種，它是由許多葡萄糖分子通過(guò)β-糖苷鍵連接而成的線性高分子。β-葡聚糖對(duì)啤酒的質(zhì)量具有比較突出的影響，包括優(yōu)化啤酒的口感和泡沫的穩(wěn)定性與掛杯性等。人體可以輕易地吸收啤酒中的β-葡聚糖，因?yàn)棣?葡聚糖是一種水溶性多糖，可以很容易地穿過(guò)腸道壁，進(jìn)入血液循環(huán)。然而，過(guò)量攝入β-葡聚糖可能會(huì)導(dǎo)致腸道脹氣、腹瀉、腹痛等不良反應(yīng)，因此建議適量飲用啤酒。

β-葡聚糖具有多種檢測(cè)方法，包括熒光輔助糖電泳法、高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法等。以上方法均有局限性，且不能檢測(cè)聚合度超過(guò)7的寡糖。利用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜法（MALDI-TOF MS），可快速分析啤酒中聚合度大于7的糖類。

MALDI-TOF由離子源（MALDI）和飛行時(shí)間質(zhì)量分析器（TOF）兩部分組成，可以同時(shí)測(cè)定樣品中的多種成分。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將微量樣品與過(guò)量基質(zhì)的混合液體點(diǎn)到樣品靶上，經(jīng)加熱或風(fēng)吹干形成共結(jié)晶后，把樣品靶放入離子源室內(nèi)。在達(dá)到一定真空后，激光照射到靶上的樣品，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給樣品分子，樣品分子瞬間汽化?；|(zhì)的質(zhì)子轉(zhuǎn)移給樣品分子使其離子化，然后進(jìn)入飛行時(shí)間質(zhì)量分析器，根據(jù)它們各自的質(zhì)荷比（m/z）進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)處理后得到質(zhì)譜圖。

離子離開(kāi)加速區(qū)的速度滿足。

其中，m表示離子質(zhì)量，z表示離子所帶電荷，U表示加速電場(chǎng)電壓。因此，m/z越大的離子飛行的速度越慢，到達(dá)檢測(cè)器的時(shí)間越長(zhǎng)。

作為一種重要的質(zhì)譜分析方法，MALDI-TOF MS在聚合物的表征中起到不可或缺的作用，可用于聚合物的數(shù)均和重均分子量的測(cè)定、分子量分布、重復(fù)單元結(jié)構(gòu)確認(rèn)、端基確定、雜質(zhì)及添加物的檢測(cè)等。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

2,5-DHB：色譜純，日本TCI公司；三氟乙酸：色譜純，阿拉丁試劑有限公司；雪津啤酒：產(chǎn)于福建省莆田市；乙腈：色譜純，德國(guó)Merck公司；醋酸鈉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2.2 儀器與設(shè)備

Autoflex maX MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀；分析天平：XS205型，美國(guó)Mettler-Toledo公司；超純水系統(tǒng)：Milli-Q型，美國(guó)Millipore公司；儀器的參數(shù)激光源：Nd: YAG激光，采集方法為反射正離子模式。

2.3 樣品的前處理

先用超聲波將啤酒脫氣0.5h，除去啤酒中的氣泡，隨后用超純水對(duì)啤酒進(jìn)行稀釋。

2.4 基質(zhì)的制備

在100μL乙腈/水溶液（體積比1:1，含0.1%三氟乙酸）中加入1mg2,5-DHB，渦旋均勻，使其溶解，得到10mg·mL-12,5-DHB基質(zhì)溶液。在乙腈/水溶液（體積比1:1，含0.1%三氟乙酸）溶解醋酸鈉，配制得到濃度為2mg·mL-1醋酸鈉溶液。

2.5 點(diǎn)樣與MALDI-TOF MS分析條件

點(diǎn)樣方式為混合法，即在靶板上，按照順序依次點(diǎn)上1μL基質(zhì)溶液、1μL待測(cè)樣品、1μL醋酸鈉溶液，隨后用移液槍混合均勻，用吹風(fēng)機(jī)豎直吹干。

用分子泵將真空度降低至1.0×10-6mbar以下，根據(jù)樣品性質(zhì)、待測(cè)樣品的分子量大小等，選擇合適的模式，即“RP”模式。調(diào)整m/z檢測(cè)范圍與激光能量，通過(guò)累加圖譜等方式，得到合理的圖譜。采樣完畢，打開(kāi)待分析文件。根據(jù)圖譜中的峰值定性分析。

測(cè)試完成，打開(kāi)入口蓋，送出樣品靶，把裝有樣品靶的靶托從樣品靶平臺(tái)取出，把樣品靶清洗干凈。取另一塊干凈的靶板，放回儀器樣品靶平臺(tái)上，送回儀器內(nèi)，并選擇方法，使儀器處于待機(jī)狀態(tài)。

3 結(jié)果與分析

3.1 葡聚糖對(duì)應(yīng)峰的尋找

在啤酒中，葡聚糖一般是聚合度不高的二糖或寡糖。不同聚合度的葡聚糖之間會(huì)相差n個(gè)C6H10O5結(jié)構(gòu)單元，因此，可以尋找一組或多組相對(duì)分子質(zhì)量均相差約為162的化合物。當(dāng)找到不少于4個(gè)峰的時(shí)候，可證明該組數(shù)據(jù)可信。

本實(shí)驗(yàn)中，可觀察到兩組葡聚糖。第一組葡聚糖對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量分別為526.937、689.109、851.185、1013.233、1175.292、1337.3651、1499.340，第二組葡聚糖對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量分別為568.934、731.133、893.1731、1055.224、1217.251。譜圖中（圖1）所有所需的峰對(duì)應(yīng)的m/z已經(jīng)標(biāo)出。

圖1 以摻有鈉離子的2, 5-DHB為基質(zhì)采集到的啤酒稀釋液的MALDI-TOF MS譜圖

3.2 葡聚糖聚合度的分析

不考慮端基時(shí)，若葡萄糖發(fā)生聚合，二糖的相對(duì)分子質(zhì)量為342，三糖的相對(duì)分子質(zhì)量為504。當(dāng)葡聚糖存在端基時(shí)，其相對(duì)分子質(zhì)量一定大于該聚合度下不存在端基的葡聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)中，第一組葡聚糖最低、最高相對(duì)分子質(zhì)量分別為526.937與1499.340，其聚合度分布在3～9；第二組葡聚糖最低、最高相對(duì)分子質(zhì)量分別為568.934與1217.251，其聚合度分布在3～7。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)條件有限，未選擇各種廠商的啤酒進(jìn)行測(cè)試。同時(shí)，若條件允許，可嘗試實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，如改變啤酒稀釋的比例、改變基質(zhì)的種類與組成以及改變點(diǎn)樣方法等。

實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要注意各溶液加入的順序，并混合均勻。在其他的某些質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)中，可能會(huì)采用基質(zhì)包裹目標(biāo)物的點(diǎn)靶方法，因此更需要注意溶液加入的順序。值得注意的是，尋找目標(biāo)物時(shí)，m/z較低處的區(qū)間內(nèi)峰的情況較為復(fù)雜，可從較大的相對(duì)分子質(zhì)量入手，向下尋找低聚合度的葡聚糖。采集數(shù)據(jù)時(shí)，樣品點(diǎn)邊緣的樣品含量一般較高，且明亮處樣品含量較高。因此，激光發(fā)射點(diǎn)應(yīng)盡量選擇邊緣明亮處。

選擇合適的物質(zhì)作為基質(zhì)時(shí)，該物質(zhì)需要具備特性的物理與化學(xué)性質(zhì)，包括但不限于：可吸收激光能量并把能量轉(zhuǎn)移給分析物，避免過(guò)量的能量使分析物裂解；可包埋分析物，避免分析物分子締合導(dǎo)致的質(zhì)量復(fù)雜化；可通過(guò)光激發(fā)或光離子化作用把質(zhì)子轉(zhuǎn)移給分析物，促進(jìn)分析物分子離子的形成；與待測(cè)樣品極性相似、溶解度相近，可以形成良好的共結(jié)晶體。若目標(biāo)物為聚合物，可添加金屬離子作為助離子化劑。不同的樣品中，基質(zhì)揮發(fā)效果不同。使用不同的基質(zhì)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，可以改善結(jié)晶情況，使樣品均勻分散并有效解吸電離，增強(qiáng)質(zhì)譜信號(hào)，進(jìn)而提高分析的靈敏度、分辨率和重復(fù)性等。

除了本實(shí)驗(yàn)中定性分析β-葡聚糖之外，MALDITOF MS在常規(guī)物質(zhì)檢測(cè)，如小分子藥物，以及多肽、細(xì)菌等復(fù)雜物質(zhì)檢測(cè)方面也有廣泛應(yīng)用。隨著研究的深入，MALDI-TOF MS在分析檢測(cè)中的作用一定會(huì)越來(lái)越重要。