閩楠群體遺傳結構分析與核心種質庫構建*

張俊紅 王 洋 周生財 吳小林 吳仁超 楊 琪 張毓婷 童再康

（1. 浙江農林大學省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室 杭州311300； 2. 麗水職業技術學院 麗水 323000；3. 浙江慶元縣實驗林場 慶元 323800）

閩楠（Phoebe bournei）屬樟科（Lauraceae）楠屬（Phoebe）常綠喬木，為我國特有二級珍稀瀕危保護樹種，其材質細膩，具淡香氣，富含倍半萜類化合物，耐腐性能超強，是商品材“金絲楠木”的重要原植物，現為南方山區重要珍貴造林樹種（Hanet al.，2022）。同時，閩楠干形通直、冠形優美，屬優良常綠觀賞樹種（吳大榮等，2003）。然而，閩楠童期長，結實大小年現象明顯，且種子容易失活，天然更新困難，加之長期不合理利用和氣候變化等因素，導致現存資源稀少，天然群體面積不斷縮小，分布呈片段化（吳大榮等，2011；劉軍等，2011）。因長期地理隔離和環境差異，閩楠群體內可能存在豐富遺傳變異。為更好保存和利用其種質資源，亟需探索良好的種質資源保存策略。

作為種質資源科學保存策略制定的前提，應充分掌握其遺傳信息、形態多樣性和適應性等，同時應去除冗余單株以獲得高的保存效率（Belajet al.，2018）。諸多研究表明，掌握種質資源的遺傳多樣性和遺傳結構不僅有利于其保護策略的制定，更有利于在對種質資源有效保存的前提下進行高效、合理的開發與利用（Wuyunet al.，2015；陳存等，2020）。核心種質庫構建是科學保存種質資源的重要策略，可最大程度上保存種質資源的遺傳多樣性，尤其對生長周期長、樹體高大的林木更具科研和生產價值。相關研究始于20 世紀80年代，Frankel 等（1984）首次提出核心種質概念，Brown（1989）進行了擴展，認為核心種質是種質資源的核心子集，通過保存最少數個體實現最大限度保存整個資源群體的遺傳多樣性、遺傳結構和遺傳變異程度。目前，主要采用表型性狀和分子標記2 種方法構建核心種質，如已構建了油茶（Camellia oleifera）（Zhuet al.， 2022； Wanget al.，2023）、美洲黑楊（Populus deltoids）（陳存等，2020）、杉木（Cunninghamia lanceolata）（李魁鵬等，2021）、木荷（Schima superba）（楊漢波等， 2017）和杜仲（Eucommia ulmoides）（李洪果等，2018）等樹種的核心種質庫。

近年來，分子標記技術廣泛用于種質資源群體的遺傳多樣性、遺傳結構研究及核心種質篩選，其中SSR 分子標記因穩定性好、精度高、共顯性遺傳和操作簡便等優點，已應用于杜仲（李洪果等，2018）、刺槐（Robinia pseudoacacia）（楊欣超等，2020）、文冠果（Xanthoceras sorbifolia）（申展等， 2017）、 蘋果（Malus domestica）（張春雨等，2009）、杉木（李魁鵬等，2021）和核桃（Juglans regia）（Wanget al.， 2013）等核心種質庫構建。閩楠群體遺傳多樣性和核心種質庫也有報道，馮一寧等（2022）利用18 對SSR 引物研究福建省3 個代表性閩楠自然居群88 個單株的遺傳多樣性和遺傳結構，結果表明其群體遺傳多樣性較豐富，群體內近交程度較高，3 個居群分2 類；Zhou 等（2021）利用23 對多態性EST-SSR 引物分析閩楠3 個天然居群75 個單株的遺傳多樣性，結果發現其居群具有豐富的遺傳多樣性，其中江西YS 居群的遺傳多樣性最高，遺傳結構分析表明YS 居群與其他2 個居群存在顯著遺傳分化；黃雨芹等（2020）利用7 個SSR位點分析江西和福建省16 個閩楠天然居群的237 份材料的遺傳多樣性，基于逐步聚類位點優先取樣策略，篩選出59 份核心種質。然而，閩楠在福建、江西、浙江、湖南和廣西等省（區）均有天然分布（http://www.iplant.cn/），上述研究中的居群僅來自福建和江西等地，不能全面檢測閩楠群體的遺傳多樣性和遺傳結構。鑒于此，本研究選用閩楠5 省（區）27 個種源地425 份種質資源，分析其遺傳多樣性和群體遺傳結構，篩選構建核心種質庫，以期用于閩楠種質資源保護、管理和利用，推進閩楠良種選育。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

基于課題組前期實地調查，在福建、浙江、廣西、江西和湖南5 省（區）27 個縣（市）的閩楠天然分布區收集優株種子，參考地形圖，避開山川湖泊，篩選氣候環境相對一致的區域，劃分9 個群體（圖1）。培育出218 個半同胞家系（表1）的2年生苗，2013年6月每家系種植10 株于浙江省慶元縣閩楠國家種質資源庫（23°72′N，113°02′E）。每家系選擇形態差異明顯的1～2 單株，2018年3月采集218 個家系425 份種質鮮芽，冰盒保存帶回實驗室，置于?40 ℃冰箱內備用。

表1 閩楠種質資源信息Tab. 1 Information of P. bournei germplasm resources

圖1 閩楠天然種質資源的分布信息Fig. 1 The distribution information of P. bournei resources

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA 提取 采用改良CTAB 法（Doyle,1987）提取基因組DNA，使用NanoDrop2000（Thermo Scientific，美國）檢測DNA 純度和濃度，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質量。稀釋部分DNA 原液至125 ng·μL?1用于PCR 擴增，原液?20 ℃保存備用。

1.2.2 SSR 引物篩選和PCR 擴增 應用MISA 程序使用默認參數分別對轉錄組Unigenes 和基因組（Hanetal., 2022）進行SSR 位點搜索，再用Primer 3.0 分別設計100 對EST-SSR 引物和100 對G-SSR 引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。隨機選取8 個DNA 樣品作為模板篩選引物，確定出多態性優良的19 對EST-SSR 和14 對G-SSR 引物用于后續研究（表2）。

表2 33 對SSR 引物信息Tab. 2 The information of 33 pairs of SSR primers

PCR 反應體系10 μL：125 ng·μL?1DNA 模板1 μL、10 μmol·L?1上下游引物各0.5 μL、Premix TaqTM5 μL（0.25 U Taq, TaKaRa）、ddH2O 3 μL；擴增程序為：94 ℃預變性4 min；32 個循環：94 ℃變性30 s，54 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min；最后72 ℃延伸5 min。

1.2.3 SSR 擴增產物檢測與分析 EST-SSR 引物的PCR 擴增產物經8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳90 min，利用銀染技術顯現條帶（Charterset al.， 1996；Gresshoff，1991)，采用500 bp 的DNA ladder，在可見光燈箱上觀察、拍照記錄并讀帶。G-SSR 熒光引物合成及PCR 擴增產物檢測由北京擎科生物科技有限公司完成，應用ABI3730 測序儀進行毛細管電泳檢測，結合分子內標分析片段大小，測序儀檢測結果經Gene-Maker v2.2.0 軟件分析，并呈現出毛細管電泳圖。

1.3 數據分析

將EST-SSR 標記擴增條帶轉換成數字形式，得到bp 形式數據矩陣；G-SSR 引物擴增結果經Gene-Maker v2.2.0 軟件分析，得到bp 形式數據矩陣；利用DateTrans1.0 軟件轉換數據用于后續分析。采用Popgene32 軟件計算觀測等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Shannon 信息指數（I）和Nei’s 基因多樣性指數（H）。運用PIC_CALC 軟件計算各引物的多態性信息含量（PIC）；通過DPS 軟件基于UPGMA 法計算家系間遺傳距離，使用MEGA 軟件采用UPGMA 法進行聚類分析（Yehet al.，2000）。應用STRUCTURE 2.3.4 軟件對9 個閩楠群體進行遺傳類群劃分。設置K=1～10，Burin=100 000，MCMC=10 000，每個K值運行3 次，以K為橫坐標、ΔK為縱坐標作折線圖，選取最高值為最佳分類群數量。

1.4 核心種質構建及評價

1.4.1 取樣方法 參照Hu 等（2000）多次聚類法，設定10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%和50% 共9 個取樣比例，采用等位基因最大化的取樣策略構建核心種質。利用NTSYSpc 2.11a 軟件運用UPGMA聚類方法計算218 個家系的遺傳距離，應用MEGA 6.0 軟件構建聚類圖，從分類水平最低的種質中選擇具有最多稀有等位基因數的種質進入下一輪聚類，如2 份種質具有相同數目的稀有等位基因，則優先選擇稀有等位基因頻率最小的種質，如2 個值仍相同則隨機選擇，組內只有一種材料直接選入，對選取出的種質再次聚類，直到取得的種質達到設定取樣比例，構成核心種質的樣本群（張春雨等，2009）。

1.4.2 核心種質代表性檢驗及評價 計算核心種質的Na、Ne、Ho、He、H和I，篩選最佳取樣比例構成的核心種質。通過SPSS22.0 軟件對原始種質和核心種質的遺傳多樣性參數進行t檢驗，以評價核心種質的代表性。

2 結果與分析

2.1 基于SSR 分子標記的閩楠種質資源群體的遺傳多樣性

采用SSR 標記分析425 份種質資源的遺傳多樣性，33 對SSR 引物共檢測出130 個等位點，各位點的變幅為2（G-MN120）～10（G-MN134）個，平均每對引物擴增出3.939 個等位點（表3）；Ne為1.142（G-MN114）～4.677（G-MN134）， 均 值 2.159；Ho為 0（E-MN17）～0.699（G-MN134），均值0.224；He為0.124（G-MN114）～0.787（G-MN134），均值0.477；I為0.269（G-MN114）～1.774（G-MN134），均值0.841；H為0.124（G-MN114）～0.786（G-MN134），均值0.476；PIC 為0.118(G-MN114)～0.759(G-MN134)，均值0.417，當0.25 ＜ PIC ＜ 0.5，屬于中等多態性位點，表明收集保存的閩楠種質資源具有豐富的遺傳多樣性。

表3 閩楠種質資源群體的遺傳多樣性①Tab. 3 The genetic diversity of P. bournei germplasm resources

2.2 閩楠種質資源群體的遺傳多樣性

閩楠9 個群體的Na為2.242～3.636，均值2.899；Ne為1.621～2.287， 均值1.967；Ho為0.157～0.280， 均值0.228；He為0.313～0.516，均值0.433（表4）。H變化范圍0.306～0.510，均值0.421，由高到低為湖南西部、福建北部、浙江南部、福建南部、福建中部、廣西北部、江西南部、湖南東部和江西北部。同時，I亦反映遺傳多樣性高低，變化范圍0.504～0.892，均值0.712，變化趨勢與H基本一致，由高到低為湖南西部、福建北部、浙江南部、福建中部、福建南部、廣西北部、江西南部、湖南東部、江西北部。因此，遺傳多樣性最高為湖南西部，遺傳多樣性最低為江西北部。

表4 9 個閩楠種質資源群體的遺傳多樣性①Tab. 4 The genetic diversity of nine P. bournei populations

2.3 閩楠群體間遺傳分化與遺傳結構

閩楠群體間遺傳分化與基因流分析表明，群體內近交系數（Fis）和群體間近交系數（Fit）的均值分別為0.440 和0.532，群體間遺傳分化系數（Fst）變化范圍為0.008(E-MN19)～0.354(E-MN90)，均值0.164，說明16.4%的遺傳變異存在于9 個閩楠群體間，而83.6%的變異存在于群體內。基因流(Nm)反映遺傳分化程度，其變化范圍為0.456(E-MN90)～29.475(E-MN19)，均值1.275，表明群體間存在一定基因交流。

進一步研究閩楠群體的遺傳結構發現（圖2），9 個閩楠群體可劃分為3 個類群，第一類群包括福建北部、福建中部（藍色部分）；第二類群包括福建南部、湖南西部、湖南東部、江西南部和浙江南部（綠色部分）；第三類群包括廣西北部和江西北部（紅色部分）。

圖2 9 個閩楠群體的遺傳結構Fig. 2 Genetic structures of nine P. bournei populations

2.4 閩楠核心種質資源篩選

采用逐步聚類等位基因最大化法分別構建50%（213）、 45%（191）、 40%（170）、 35%（149）、 30%（128）、 25%（106）、 20%（85）15%（64）和 10%（43）的9 個候選核心種質庫，采用Na、Ne、Ho、He、I和H等遺傳多樣性參數對候選核心種質庫進行比較分析（表5），結果表明，隨取樣比例降低，Na降低，而Ne、He、I和H增大，直至取樣比例降至20%后開始下降；Ho則隨取樣比例降低而升高。因此，本研究最終確定取樣比例為20%，即從425 份閩楠原始保存種質劃分為85 份核心種質和340 份保留種質。

表5 各取樣比例下的遺傳多樣性比較①Tab. 5 Comparison of genetic diversity under various sampling ratios

85 份核心種質Na、Ne、Ho、He、I和H的保留率分別為92.318%、103.803%、116.652%、105.052%、103.341%和104.664%，除Na外，其他5 個參數均高于原始種質和保留種質（表6），表明核心種質有效剔除了原始種質的遺傳冗余，保留了更多遺傳變異。340 份保留種質的6 個遺傳參數保留率分別為99.241%、98.300%、95.804%、97.568%、97.360%和97.647%，除Na外均低于核心種質和原始種質，表明保留種質因去除了遺傳多樣性更高的樣品導致遺傳重復率升高。據構建核心種質標準（Diwan,et al ., 1995），核心種質與原始種質在各性狀上的變異幅度比應大于70%，現構建的核心種質各遺傳參數均較為優質，符合核心種質要求。

表6 原始種質、核心種質和保留種質的遺傳多樣性比較①Tab. 6 Comparison of genetic diversity of original, core and reserved germplasms

2.5 閩楠核心種質的確認與評價

原始種質共425 份，基于20%取樣比例下構建的核心種質包含85 份，剩下的340 份為保留種質。對核心種質和原始種質2 個群體的遺傳參數Na、Ne、Ho、He、I和H進行t檢驗，結果表明在0.05 水平上差異不顯著（P＞ 0.05，表7）。由此可見核心種質可充分代表原始種質的遺傳多樣性。

表7 核心種質與原始種質的遺傳多樣性參數t 檢驗①Tab. 7 The t test of the genetic diversity parameters between core collection and original collection

85 份核心種質來自21 個地理來源的78 個家系，其中7 個家系含2 份種質，基本覆蓋了全分布區，福建松溪和湖南永州分別包括18 和17 份核心種質（表8）。來自于福建北部和福建中部的39 份種質，屬于第一類群（藍色部分）；福建南部、湖南西部、湖南東部、江西南部、浙江南部的42 份種質屬于第二類群（綠色部分）；廣西北部、江西北部的4 份種質屬于第三類群（紅色部分）。

表8 閩楠核心種質分布情況Tab. 8 The distribution of core collection in P. bournei

3 討論

3.1 閩楠種質資源遺傳多樣性

遺傳多樣性指不同群體間及同一群體內不同個體間遺傳變異程度的總和（Castelánet al.，2019），反映物種適應環境的能力及其被改造和利用的潛力。分子水平上的遺傳多樣性可根據等位基因數（Na）、Shannon 多樣性指數和Nei’s 多樣性指數等進行評價。本研究利用SSR 引物對425 份閩楠種質進行遺傳多樣性檢測，共檢測到130 個等位點，表明閩楠遺傳信息在進化過程中發生顯著變異。多態性信息（PIC）一般定義為低（PIC ＜ 0.25）、中（0.25 ＜ PIC ＜ 0.5）或高（PIC ＞ 0.5），閩楠33 對引物的平均 PIC 為0.417，屬中度多態性引物，表明適用于閩楠群體大量樣本的遺傳多樣性分析。閩楠種質資源的期望雜合度（He）為0.477，高于楊葉木姜子（Litsea populifolia）（王雪等，2019）（He= 0.246）， 但低于分布更廣的栓皮櫟（Quercus variabilis）（Shiet al.， 2017） (He= 0.707)。Nei’s 基因多樣性指數（H）與Shannon 指數（I）均可度量群體的變異程度和遺傳多樣性，閩楠種質資源的H和I平均值分別為0.476 和0.841，高于10 對SSR 引物對39 個閩楠個體遺傳多樣性（H：0.259，I：0.391）（劉丹，2019），表明閩楠大樣本的遺傳多樣性顯著高于小群體，進一步明確種質資源擴大收集范圍的必要性。在群體水平上， 9 個閩楠群體的I變化范圍為0.504～0.892，均值0.712；H變化范圍為0.306～0.510，均值0.421，其中遺傳多樣性最高為湖南西部群體，最低為江西北部群體，反映出閩楠種質庫具較高水平的遺傳多樣性，高于同屬物種浙江楠（P. chekiangensis）（H： 0.321，I： 0.465）和紫楠（P. sheareri）（H： 0.376，I：0.576）天然群體的遺傳多樣性（Dinget al.，2015；Wanget al.，2022）。一個物種的遺傳多樣性與生境、生活史等有關（Hamricket al.，1992），同時遺傳多樣性受地理分布、群體大小和氣候變化等影響（Rubio-Moragaet al.，2012）。因此，閩楠群體的高遺傳多樣性可能與其較廣的分布范圍、壽命長和異交等生活特征有關。

3.2 閩楠群體遺傳分化和遺傳結構

研究表明，群體間遺傳分化系數Fst ＜ 0.05 為低水平的遺傳分化，0.05＜ Fst ＜ 0.15 為中等水平，0.15 ＜Fst ＜ 0.25 為較高水平，Fst ＞ 0.25 則為高水平的遺傳分化（Pearseet al.，2004）。閩楠群體間遺傳分化結果表明83.6%變異存在于群體內，與浙江楠（Dinget al.，2015）、光皮樺（Betula luminifera）（張俊紅等，2010）等研究一致，暗示閩楠選擇時需更加注重群體內的單株選擇。

Wright（1931）認為，當Nm＞ 1 時，存在一定的基因流動，這些基因流可防止由遺傳漂變引起的家系間的遺傳分化；當Nm＜ 1 時，群體發生強烈遺傳分化。植物的基因流主要借助種子或花粉遷移而成（Hamrick，1989），閩楠群體間基因流（Nm）平均值為1.275，低于同屬浙江楠（Nm=1.992）（(Dinget al.，2015）和紫楠（Nm=1.322）（Wanget al.，2022），以及其他廣布性樹種如光皮樺（Nm=3.596）（張俊紅等，2010）、楓香（Liquidambar formosana）（Nm=3.051）（孫榮喜，2017）和花楸（Sorbus pohuashanensis）（Nm=3.047） （鄭健等，2008)），表明閩楠群體間存在基因流動，但可能已發生了一定水平的遺傳分化。

STRUCTURE 群體遺傳結構分析顯示，9 個群體被劃分為3 個類群，未嚴格按照地理聚類，其遺傳變異存在一定隨機變異特性，且存在地理距離較近的群體分離。Hamrick（1989）認為植物群體遺傳結構受交配系統和基因流相互作用影響，異花授粉可增加群體間基因交流，減少遺傳漂變，使遺傳分化水平較穩定。閩楠屬蟲媒的異花授粉植物，花粉傳播距離低于風媒花，雖分布范圍較廣，但多呈片段化分布，致使花粉和種子難以大范圍交流，促使其群體間的遺傳分化，且群體間的基因流相對較低，可能在一定程度上影響群體遺傳結構。

3.3 閩楠核心種質構建

林木核心種質篩選目前主要基于形態性狀和分子標記，其中利用表型數據構建核心種質具有簡便、費用低和構建時限短等優點（Huet al.，2000），但表型性狀易受外界因素和生長發育時期的影響，而分子標記數據不受環境等因素影響（明軍等，2005）。確定取樣比例是構建核心種質的關鍵，Brown（1989）基于中性選擇理論認為5%～10%的核心種質能夠代表全部種質資源70%以上的遺傳變異。國內外不同植物構建核心種質時取樣比例一般在5%～40%，10%～30%是大部分核心種質構建效果較好的取樣比例（楊漢波等，2017）。一般認為對于原始種質多且遺傳多樣性小的物種可適當減小取樣比例，相反則需增加取樣比例（Kanget al.， 2006）。本研究選取10%～50%的9 個取樣比例，結果發現等位基因數（Na）隨取樣比例下降有所降低，但總體降幅不大，說明取樣比例的降低導致較少量等位基因被剔除。Shannon 信息指數（I）和Nei’s 基因多樣性指數（H）隨取樣比例降低而升高，在取樣比例為20%時達最大值，而后下降，表明本研究中20%的取樣比例為閩楠核心種質構建的最佳取樣比例。

取樣策略是影響核心種質構建有效性的另一重要因子。目前，多數研究采用分層分組和聚類方法構建核心種質，但不同分組和聚類方法的核心種質存在較大差異。等位基因最大化法是其中最具優勢的方法，已在模式植物和農作物的核心種質構建過程中被廣泛采用（Kanget al.，2006；潘英華等，2018；徐海明等，2004），該策略最大優點在于能保存遺傳多樣性最為豐富的種質資源，滿足分類學家和遺傳學家的需要。因此，本研究選用等位基因最大化法構建核心種質，得到85 份核心種質，保留20%原始種質，且經t檢驗表明核心種質和原始種質的遺傳多樣性參數差異不顯著，核心種質的遺傳多樣性參數保留率均高于100%，能很好代表初始種質的遺傳多樣性信息。

4 結論

利用33 對SSR 引物對425 份閩楠種質資源進行遺傳多樣性和遺傳結構分析，收集的閩楠種質資源群體具有豐富的遺傳多樣性，并將9 個群體分成3 個類群。采用逐步聚類等位基因最大化法，按20%入選率得到85 份核心種質，等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Shannon 信息指數（I）和Nei’s 基因多樣性指數（H）的保留率分別為92.318%、103.803%、116.652%、105.052%、103.341%和104.664%，t檢驗顯示核心種質和原始種質的遺傳多樣性參數差異不顯著，表明構建的85 份核心種質能有效代表閩楠原始種質的遺傳信息，可達到最大化保留原始種質的目的，為閩楠種質資源的有效保存和利用提供理論支撐。