基于“時空特點”探討電針預(yù)處理對腦缺血大鼠鈉鈣交換體1的影響

寧文華,李 禮,3△,張寶瑜,楊 沙,張麗麗,樊小農(nóng),沈 燕,4,張亞男,王 舒

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,天津 300381;2.國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心,天津 300381;3.天津市針灸學(xué)重點實驗室,天津 300381;4.國家中醫(yī)藥管理局腦病針刺療法重點研究室,天津 300381;5.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院,天津 300120

腦卒中是世界第二大致死因素、第三大致殘因素,缺血性腦卒中占80%[1]。重組組織纖溶酶原激活劑仍是唯一批準(zhǔn)用于治療缺血性腦卒中的藥物,但在臨床實踐中卻因其治療時間窗窄(4.5 h內(nèi))、嚴(yán)格的禁忌癥以及治療過程中可能存在的并發(fā)癥(顱內(nèi)出血等)而無法使更多人受益[2-3];動物模型中顯效的卒中神經(jīng)保護(hù)藥物,在進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化過程中卻均以失敗告終[4]。因此,繼續(xù)探索治療缺血性腦卒中的有效措施是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的重點課題。尋找預(yù)防腦卒中首次發(fā)生的最佳方案是卒中研究任務(wù)的重中之重[5]。課題組前期已證實[6],缺血前重復(fù)刺激大鼠“百會”、雙側(cè)“內(nèi)關(guān)”和“三陰交”可以抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,發(fā)揮腦保護(hù)作用,然而其具體作用機制尚未完全闡明。

Ca2+超載是缺血性神經(jīng)元死亡的主要因素[7],降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度可以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[8]。鈉鈣交換體(Na+/Ca2+exchanger,NCX)作為分布于細(xì)胞質(zhì)膜上的雙向膜離子轉(zhuǎn)運體,由于其高轉(zhuǎn)運能力是神經(jīng)元Ca2+外排的主要途徑。NCX1是NCX中最重要的亞型,通過調(diào)控NCX1表達(dá)及活性,在缺血性腦卒中的治療中具有關(guān)鍵作用[9],可作為卒中干預(yù)的潛在靶標(biāo)[10]。本實驗在前期明確電針預(yù)處理腦保護(hù)效應(yīng)的基礎(chǔ)上,選擇細(xì)胞質(zhì)膜Ca2+外排關(guān)鍵通道NCX1為切入點,進(jìn)一步觀察電針預(yù)處理對腦缺血不同時間點、不同缺血區(qū)域NCX1表達(dá)的影響,探討電針預(yù)處理腦保護(hù)的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級SD(Sprague-Dawley)大鼠,5～6周齡,雄性,體質(zhì)量230～250 g,均購自于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。實驗動物飼養(yǎng)于中國科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所,符合(Specefic Pathogen Free,SPF)級標(biāo)準(zhǔn),飼養(yǎng)溫度(22±2)℃,相對濕度(55±15)%,12 h/12 h明暗交替,自由飲水及進(jìn)食。實驗大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組與電針組,每組再分0、1、2和24 h亞組,每亞組各7只。假手術(shù)組、模型組0 h于手術(shù)后立即斷頭取腦,電針組0 h于末次干預(yù)后立即取材,其余1、2和24 h時間點均于造模結(jié)束后開始計時。所進(jìn)行動物實驗經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)(審批號:TCM-LAEC2019019)。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器 韓氏神經(jīng)穴位刺激儀(南京濟(jì)生);激光多普勒血流儀DRT4(美國惠普公司);大鼠腦槽(深圳瑞沃德);針灸針(北京漢醫(yī));線栓(深圳瑞沃德);異氟烷(深圳瑞沃德);超聲波細(xì)胞粉碎機(寧波新芝);小型臺式高速冷凍離心機(美國ThermoFisher);電泳儀(美國Bio-Rad);多功能成像儀(德國耶拿);多功能脫色搖床(美國ThermoFisher);生物組織脫水機(浙江金華科迪);生物組織包埋機(浙江金華科迪);切片機(德國Leica)。

1.2.2 試劑 高效RIPA裂解液(北京索萊寶);BCA蛋白定量試劑盒(武漢博士德);SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(武漢博士);彩虹廣譜蛋白Marker(北京索萊寶);20TBST緩沖液(北京索萊寶);5%脫脂牛奶(美國BD);兔抗NCX1單克隆抗體(美國Abcam);小鼠抗NCX1單克隆抗體(美國Abcam);小鼠抗β-actin抗體(北京中杉金橋);HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(北京全式金);HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體(北京全式金);PVDF膜(美國Millipore);ECL化學(xué)發(fā)光液(美國Millipore);無水乙醇(天津化學(xué)試劑廠);二甲苯(天津化學(xué)試劑廠);檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(北京索萊寶);鼠組化二抗試劑盒(北京中杉金橋);蘇木素染液(北京索萊寶);中性樹膠(北京索萊寶);4%組織固定液(北京索萊寶)。

1.3 干預(yù)方法

采用自制鼠衣束縛實驗大鼠,并用膠帶固定于實驗臺上,確保大鼠腹部朝上,充分暴露針刺部位,見圖1。電針預(yù)處理穴位選取大鼠“百會”、雙側(cè)“內(nèi)關(guān)”“三陰交”。根據(jù)《實驗針灸學(xué)》[11]大鼠穴圖譜進(jìn)行定位,“百會”(GV20)取大鼠頂骨正中點,沿皮向后斜刺2 mm;“內(nèi)關(guān)”(PC6)取大鼠前肢內(nèi)側(cè),腕關(guān)節(jié)上3 mm左右的尺橈骨之間,直刺2 mm;“三陰交”(SP6)取大鼠后肢內(nèi)踝尖上5 mm,直刺1.5 mm。電針預(yù)處理參數(shù)為疏密波,頻率2/15 Hz,強度1 mA,時間20 min。1次/d,連續(xù)5 d,于末次電針2 h后制備模型。

圖1 電針干預(yù)示意圖

1.4 造模方法

通過線栓法阻閉大腦中動脈,構(gòu)建大鼠永久性腦缺血模型,具體操作方法:①實驗大鼠于術(shù)前12 h禁食不禁水。采用異氟烷氣體吸入性麻醉(4%誘導(dǎo),2%維持)。待麻醉起效后于大鼠頭皮正中切一2 cm開口,鈍性分離皮下組織、骨膜,暴露冠狀縫和矢狀縫,將激光多普勒血流儀(DRT4)探頭固定于冠狀縫后4 mm,矢狀縫向右旁開3 mm處,用以監(jiān)測局部腦組織血流量的變化;②將實驗大鼠以仰臥位固定于鼠板上,頸前皮膚備皮、消毒,于頸部正中行2 cm切口,鈍性分離頸前組織,充分暴露頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈;③尼龍繩結(jié)扎右側(cè)頸總動脈、頸外動脈后,動脈夾夾閉右側(cè)頸內(nèi)動脈,用彎針于頸總動脈開一小切口;④將線栓由頸總動脈緩慢插入大腦中動脈,并通過血流儀觀察血流阻閉情況,當(dāng)腦血流趨于穩(wěn)定后較基線值降低70%視為造模成功,見圖2;⑤結(jié)扎固定線栓,逐層縫合頸前肌肉,碘伏消毒,將大鼠移至恒溫箱,蘇醒后移至飼養(yǎng)籠。

注:A點標(biāo)記處為基線血流值,B點標(biāo)記處為線栓阻塞后血流值。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 免疫組化法觀察大鼠缺血區(qū)、非缺血區(qū)皮層NCX1陽性細(xì)胞數(shù) 大鼠異氟烷吸入性麻醉后仰臥位固定于鼠板,剪開胸腔,充分暴露心臟,剪開右心耳,快速推注生理鹽水,而后推注4%多聚甲醛,至四肢抽動。灌注結(jié)束后,斷頭取腦并置入4%多聚甲醛中固定。石蠟包埋、切片(4 μm)和脫蠟。將切片置于高壓鍋中用0.1%檸檬酸鈉抗原修復(fù)。PBS沖洗5次,每次2 min;5%BSA封閉20 min。將稀釋好的NCX1(1∶100)一抗滴加于組織上,4 ℃冰箱過夜;次日用PBS清洗切片5次,每次5 min,滴加二抗增強劑,室溫孵育20 min;再用PBS清洗5次,每次5 min,加二抗(1∶100)室溫孵育30 min。用PBS清洗5次,每次5 min,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水、透明和中性樹膠封片,晾干。在顯微鏡下進(jìn)行觀察,每張切片于400倍視野下隨機選擇5個互不重疊視野,采用Image J軟件分別計算每個視野中NCX1的陽性細(xì)胞數(shù)量,取其平均值。

1.5.2 Western blot法檢測大鼠缺血區(qū)、非缺血區(qū)NCX1蛋白表達(dá) 大鼠麻醉斷頭取腦,提取前述位相應(yīng)區(qū)域皮層腦組織,加入含PMSF蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液,使用超聲勻漿機勻漿、離心,而后吸取上清,進(jìn)行蛋白定量。計算蛋白樣品濃度之后,加入5蛋白上樣緩沖液,跨膜蛋白變性條件為37 ℃,15 min。采用10%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉1 h,分別加入β-actin(1∶2 000)、NCX1(1∶2 000)一抗,4 ℃孵育過夜。次日將抗體孵育盒從冰箱取出,室溫?fù)u床復(fù)溫1 h。TBST緩沖液清洗PVDF膜,3次,每次10 min。清洗結(jié)束后,加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1∶5 000),室溫?fù)u床孵育1 h,之后再次置于TBST緩沖液中,洗3次,每次10 min。隨后加入ECL化學(xué)發(fā)光液,使用多功能成像儀顯影。用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析,以目的條帶灰度值與內(nèi)參灰度值比值,作為各樣本相對表達(dá)量結(jié)果進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 電針預(yù)處理對MCAO大鼠缺血區(qū)皮層NCX1陽性細(xì)胞表達(dá)的影響

NCX1在細(xì)胞膜陽性表達(dá),3組間0 h時相NCX1蛋白陽性表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與同時相假手術(shù)組比較,模型組1 h、2 h和24 h時相NCX1蛋白陽性表達(dá)顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);電針組NCX1蛋白陽性表達(dá)于1 h、2 h時顯著高于同時相模型組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),24 h時與同時相模型組,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);提示電針預(yù)處理可上調(diào)缺血區(qū)皮層1 h、2 h時相NCX1蛋白陽性表達(dá)。見圖3、表1。

表1 各組大鼠不同時相缺血區(qū)皮層NCX1陽性細(xì)胞表達(dá)個數(shù)比較

2.2 電針預(yù)處理對MCAO大鼠缺血區(qū)皮層NCX1蛋白表達(dá)的影響

3組間0 h時相NCX1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);模型組NCX1蛋白表達(dá)于1 h后開始降低,1 h、2 h和24 h均低于同時相假手術(shù)組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);電針組NCX1蛋白表達(dá)于1 h、2 h顯著高于同時相模型組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),24 h時與同時相模型組,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);提示電針預(yù)處理可上調(diào)缺血區(qū)皮層1 h、2 h時相NCX1蛋白表達(dá)。見圖4、表2。

表2 各組大鼠缺血區(qū)皮層NCX1蛋白表達(dá)比較

圖4 各組大鼠不同時相缺血區(qū)皮層NCX1蛋白表達(dá)電泳圖

2.3 電針預(yù)處理對MCAO大鼠非缺血區(qū)皮層NCX1陽性細(xì)胞表達(dá)的影響

由圖5可見NCX1在細(xì)胞膜陽性表達(dá),3組間0 h時相NCX1蛋白陽性表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與同時相假手術(shù)組比較,模型組2 h、24 h時相NCX1蛋白陽性表達(dá)顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);電針組2 h、24 h時NCX1蛋白陽性表達(dá)明顯高于同時相模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);提示電針預(yù)處理可上調(diào)非缺血區(qū)皮層2 h、24 h時相NCX1蛋白陽性表達(dá)。見圖5、表3。

表3 各組大鼠不同時相非缺血區(qū)皮層NCX1陽性細(xì)胞表達(dá)個數(shù)比較

圖5 各組大鼠不同時相缺血區(qū)皮層NCX1陽性細(xì)胞分布(400×)

2.4 電針預(yù)處理對MCAO大鼠非缺血區(qū)皮層NCX1蛋白表達(dá)的影響

3組間0 h時相NCX1蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與同時相假手術(shù)組比較,模型組NCX1蛋白表達(dá)于2 h、24 h顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),電針組可上調(diào)2 h、24 h時NCX1蛋白表達(dá),與同時相模型組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);提示電針預(yù)處理可上調(diào)非缺血區(qū)皮層2 h、24 h時相NCX1蛋白表達(dá)。見圖6、表4。

表4 各組大鼠非缺血區(qū)皮層NCX1蛋白表達(dá)比較

圖6 各組大鼠不同時相非缺血區(qū)皮層NCX1蛋白表達(dá)電泳圖

3 討論

Ca2+水平的時空控制對于細(xì)胞結(jié)局至關(guān)重要[12]。腦缺血發(fā)生后,血流受阻,氧和葡萄糖供應(yīng)不足,細(xì)胞三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)降低,Na+/K+ATPase難以維持正常的電化學(xué)梯度,導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞去極化,細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)失衡,Ca2+濃度升高[8],觸發(fā)下游神經(jīng)毒性級聯(lián),最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而促進(jìn)Ca2+外排有助于神經(jīng)元存活并減輕腦缺血損傷[13]。NCX是細(xì)胞質(zhì)膜上負(fù)責(zé)Ca2+外排的主要途徑,維持Ca2+外排,以平衡細(xì)胞去極化或細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放過程中引起的Ca2+瞬變[12],通過調(diào)控其表達(dá)及活性可以改善腦缺血損傷。NCX1是NCX中最重要的亞型,與腦保護(hù)效應(yīng)密切相關(guān)。本研究通過構(gòu)建永久性腦缺血模型,以細(xì)胞質(zhì)膜Ca2+外排關(guān)鍵通道NCX1為切入點,分別從時間、空間角度探討電針預(yù)處理調(diào)控NCX1應(yīng)答的作用機制。

針灸治療缺血性腦卒中療效確切[14],電針作為傳統(tǒng)針灸與現(xiàn)代電刺激的結(jié)合,具有簡便、穩(wěn)定和安全等特點,在缺血性腦卒中的臨床治療中應(yīng)用廣泛[15]。百會穴位于巔頂,屬督脈,有升補人體陽氣、調(diào)神醒腦的作用,是治療中風(fēng)的常用穴位[16]。內(nèi)關(guān)穴為手厥陰心包經(jīng)絡(luò)穴,是醒腦開竅針法的主穴。三陰交穴屬于足太陰脾經(jīng),為足三陰經(jīng)交會穴,具有調(diào)理肝脾腎三臟功能,可以滋補肝腎,調(diào)理氣血。卒中前進(jìn)行電針預(yù)處理旨在鼓舞正氣以抗邪,達(dá)“正氣存內(nèi),邪不可干”之效,治宜調(diào)神、滋補肝腎和調(diào)理氣血。

針刺所引起機體機能活動的改變可以視作一種人體的負(fù)反饋調(diào)控現(xiàn)象。在正常狀態(tài)下針刺預(yù)處理并不會改變機體的機能狀態(tài),針刺的負(fù)反饋是在病理損傷之后出現(xiàn),并可縮短針刺效應(yīng)潛伏期、促進(jìn)針刺效應(yīng)的發(fā)揮[17]。首先,由于尚不清楚電針預(yù)處理對NCX1蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)是始于缺血前的預(yù)處理還是缺血后的應(yīng)激反應(yīng),因此本研究設(shè)置0 h時間點用以明確電針預(yù)處理對NCX1調(diào)節(jié)起始的時間節(jié)點,結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),在缺血區(qū)及非缺血區(qū),電針預(yù)處理對缺血前NCX1蛋白表達(dá)影響并無統(tǒng)計學(xué)差異,其明顯改變始于損傷之后,原因可能在于電針預(yù)處理的作用始于缺血應(yīng)激后產(chǎn)生,表現(xiàn)為提高缺血后應(yīng)對組織損傷的能力。但值得注意的是,各個區(qū)域0 h時相電針組NCX1蛋白表達(dá)與同時相假手術(shù)組相比,仍存在一定的降低趨勢,是否可以考慮電針預(yù)處理能夠在一定程度上使腦組織適應(yīng)血流低灌注狀態(tài),促使細(xì)胞維持低Ca2+外排機能,從而提高腦組織易損傷閾值來誘導(dǎo)缺血耐受,后續(xù)可以針對此現(xiàn)象繼續(xù)探索。

由于蛋白質(zhì)合成活性的區(qū)域性差異,不同區(qū)域NCX1變化有所不同。大腦的主要動脈區(qū)域是通過側(cè)支循環(huán)連接起來的,因此在缺血區(qū)內(nèi)存在組織灌注的異質(zhì)性,腦血管的閉塞會導(dǎo)致腦內(nèi)血流量的減少,缺血組織的嚴(yán)重程度從血管供血區(qū)域的外圍向中心部分增加。缺血區(qū)距離側(cè)支血供最遠(yuǎn)且腦血流降低最嚴(yán)重,隨著ATP的迅速降低,該區(qū)域組織活性受損,大量細(xì)胞丟失,快速發(fā)展為不可逆損傷[18]。事實上,缺血事件的發(fā)生并不會只影響某單一區(qū)域,對于腦整體功能網(wǎng)絡(luò)的恢復(fù),應(yīng)關(guān)注大腦整體結(jié)構(gòu)[19-20]。大腦皮層是由高度相互關(guān)聯(lián)的神經(jīng)細(xì)胞組成,各腦區(qū)之間依靠神經(jīng)纖維聯(lián)系為緊密的腦功能網(wǎng)絡(luò),與組織損傷相連的對側(cè)非缺血區(qū)域,由于代謝不足、神經(jīng)血管解偶聯(lián)和神經(jīng)傳遞異常同樣表現(xiàn)出功能受損,其功能狀態(tài)與腦損傷程度有關(guān)[21]。卒中腦功能的恢復(fù)在一定程度上受到未受損神經(jīng)元代償連接的影響,局灶性腦損傷后,未受損神經(jīng)元連接發(fā)生變化,促使其承擔(dān)缺血損傷區(qū)域的某些功能,而通過刺激對側(cè)非缺血區(qū)功能代償,調(diào)整腦功能網(wǎng)絡(luò),可有效促進(jìn)卒中后腦功能重塑[22-23]。往常實驗研究普遍將重心關(guān)注于缺血側(cè)半腦,對于對側(cè)非缺血區(qū)在整個缺血過程中的作用及是否產(chǎn)生變化仍有待進(jìn)一步闡明。本研究基于整體出發(fā),更系統(tǒng)而全面的觀測缺血后大腦不同組織區(qū)域的病理變化及電針預(yù)處理作用機制。研究發(fā)現(xiàn),缺血區(qū)、非缺血區(qū)皮層NCX1蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)不同程度的降低,這可能是其Ca2+外排能力受損的表現(xiàn),而NCX1表達(dá)發(fā)生變化,可以體現(xiàn)細(xì)胞控制胞內(nèi)Ca2+能力的改變,其表達(dá)水平降低,影響細(xì)胞Ca2+外排效能,導(dǎo)致Ca2+超載甚至神經(jīng)元死亡[24]。電針作用的整體性特點決定電針作用的發(fā)揮重點在于調(diào)控大腦整體應(yīng)答模式。對于腦組織損傷發(fā)展迅速的嚴(yán)重缺血區(qū)域即缺血區(qū),NCX1蛋白表達(dá)于缺血后1 h開始降低,2 h即達(dá)到最低值,而電針預(yù)處理的作用只維持在2 h內(nèi),2 h后其效應(yīng)持續(xù)降低,至24 h時間點與同時相模型組相比無明顯差異。這種現(xiàn)象可能是由于缺血區(qū)病理進(jìn)展迅速,離子穩(wěn)態(tài)快速破壞,破壞該區(qū)域NCX1蛋白合成,NCX1表達(dá)快速降低,Ca2+外排受損并在胞內(nèi)堆積,而該區(qū)域組織損傷的不可逆性,可能是造成電針預(yù)處理作用短暫的主要原因。對側(cè)非缺血區(qū)皮層NCX1蛋白表達(dá)同樣發(fā)生改變,遲于缺血區(qū)域,于2 h后開始降低并持續(xù)到24 h,仍低于正常水平,可能是非缺血區(qū)失代償?shù)谋憩F(xiàn)。電針預(yù)處理可上調(diào)非缺血區(qū)皮層NCX1表達(dá),使之始終維持于正常水平,有助于缺血損傷后腦功能恢復(fù)。

綜上所述,腦缺血后NCX1蛋白隨著時間及空間的不同而呈現(xiàn)出不同的降低趨勢,電針預(yù)處理調(diào)控不同區(qū)域NCX1蛋白表達(dá)模式,可能是其腦保護(hù)作用途徑之一。