貓杯狀病毒單克隆抗體的制備

王 瑩,李佳康,曾 悅,史開拓,韋麗婷,彭佳佳,李秋燕,曹龍龍*,周登元,*

(1.武漢科前生物股份有限公司,武漢 430000;2.華中農業大學動物科學技術學院動物醫學院,武漢 430070)

貓杯狀病毒(feline calicivirus,FCV)屬于杯狀病毒科(Caliciviridae)水皰性病毒屬(Vesivirus),可感染所有貓科動物,目前無特效治療藥物[1]。FCV感染后主要表現為口炎、結膜炎、鼻炎等炎癥和全身性的發熱等,有時也可引起胃腸炎癥,偶爾出現皮膚潰爛、肺炎、跛行等[2]。劉健等[3]對上海市17例呼吸道癥狀的貓病例進行FCV的鑒定,陽性率達到76.47%。由于FCV感染后極難清除,康復后仍然會長期帶毒并存在持續排毒的情況,這導致FCV仍是目前貓科動物重要的傳染病之一,防控形勢嚴峻[4]。

FCV基因組全長約7.7 kb,單股正鏈RNA(ssRNA)病毒,無囊膜,直徑為35～40 nm,核衣殼為二十面體對稱結構[5]。目前,FCV只有一種血清型,根據遺傳進化關系分為2種基因型(基因Ⅰ型和Ⅱ型),但沒有明顯的地域分布,而不同毒株間存在較明顯的抗原差異性[1]。隨著經濟的不斷發展,我國寵物貓數量逐年增加,臨床急需特效治療的生物制劑以及快速鑒定FCV感染的方法來緩解我國FCV的防控及治療壓力。近年來,單克隆抗體技術已被廣泛應用于ELISA、膠體金等方向。相關研究表明,無論是以FCV全病毒還是FCV VP1衣殼蛋白作為免疫原,均可得到良好的單克隆抗體[5]。本研究基于國內FCV流行毒株,通過蔗糖梯度離心制備FCV免疫原進行單克隆抗體制備,為FCV的診斷方法優化、流行毒株篩選以及深入研究提供生物原料。

1 材料與方法

1.1 主要材料

FCV-SH192(GenBank: OM650792.1)、FCV-HB29(GenBank: OM650783.1)、FCV-JS143(GenBank: OM650785.1)、FCV-HN183(GenBank: OM650786.1)和FCV-SD348(GenBank: OM650796.1)均由本實驗室分離、鑒定和保存;FCV陽性血清和陰性血清均由本實驗室提供。

1.2 FCV蔗糖梯度離心純化及免疫原制備

將FCV-SH192病毒按照參考文獻[5]中蔗糖梯度離心純化方法進行純化,純化后滅活作為免疫原。

1.3 FCV單克隆抗體的制備

參照文獻[6]中單克隆抗體的制備方法,將純化滅活后的FCV-SH192株作為免疫原進行小鼠免疫、細胞融合、陽性雜交瘤細胞的篩選和腹水制備。

1.4 單克隆抗體的生物學特性鑒定

參照文獻[7]中單克隆抗體的鑒定方法進行雜交瘤細胞株抗體分泌穩定性的測定、單克隆抗體類型鑒定、間接免疫熒光(IFA)特異性鑒定和蛋白免疫印跡(Western blot)特異性鑒定。

1.5 單克隆抗體腹水的ELISA效價檢測

按照常規間接ELISA方法對所制備的單克隆抗體腹水進行效價檢測[7]。

1.6 單克隆抗體腹水與不同毒株反應性

取單克隆抗體腹水(1∶500稀釋),采用IFA和Western blot測定其與5株FCV毒株(FCV-SH192、FCV-HB29、FCV-JS143、FCV-HN183和FCV-SD348)的特異反應性。

2 結 果

2.1 FCV單克隆抗體的制備、效價測定與抗體類型鑒定

經4次亞克隆,獲得1株分泌FCV抗體的雜交瘤細胞,命名為3B11。將其連續傳代至40代,每5代上清抗體效價檢測基本穩定。抗體類型鑒定顯示,3B11單抗重鏈為IgG1亞類,輕鏈為κ鏈。

2.2 單克隆抗體的特異性鑒定

IFA結果顯示:MAb 3B11可與FCV-SH192株產生特異性熒光,熒光強度與陽性對照一致(圖1A)。Western blot結果顯示:MAb 3B11可與FCV-SH192株發生特異性反應,條帶與陽性對照一致,與F81細胞無反應(圖1B)。

A. IFA鑒定MAb 3B11的特異性;B. Western blot鑒定MAb 3B11特異性。M. 蛋白質相對分子質量標準 A. IFA identified the specificity of MAb 3B11;B. Western blot identified the specificity of MAb 3B11. M. Protein marker圖1 單克隆抗體3B11的特異性鑒定Fig.1 Specificity identification of monoclonal antibody 3B11

2.3 單克隆抗體腹水的ELISA效價檢測

3B11雜交瘤細胞所制備腹水對5株FCV毒株ELISA效價為1∶12 800～1∶51 200(圖2)。

圖2 單克隆抗體腹水3B11對5株FCV毒株的ELISA效價檢測Fig.2 ELISA assay of monoclonal antibody ascites 3B11 against 5 FCV strains

2.4 單克隆抗體腹水與不同毒株反應性

腹水MAb 3B11與5株FCV均可產生IFA特異性熒光,其中FCV-HB29熒光稍弱,其余熒光強度與陽性對照一致(圖3A);腹水MAb 3B11與5株FCV均可發生Western blot特異性反應,且條帶大小一致,與F81細胞無反應(圖3B)。

3 討 論

A. 不同FCV毒株的IFA反應性;B. 不同FCV毒株的Western blot反應性。M. 蛋白質相對分子質量標準 A. IFA reactivity of different FCV strains;B. Western blot identification results of different FCV strains. M. Protein marker圖3 單克隆抗體腹水3B11與不同FCV毒株的IFA和Western blot反應性Fig.3 IFA and Western blot reactivity of monoclonal antibody ascites 3B11 with different FCV strains

FCV的高變異性使得其疫苗有效性較差。據劉健等[3]報道,上海分離株與FCV-F9疫苗株遺傳關系較遠,他們認為這是當前疫苗對貓的免疫效果不佳的主要原因。因此“早發現、早診斷、早治療”是FCV防控的主要措施之一[8]。目前臨床上快速診斷FCV感染以qRT-PCR為主[9],近年來ERA、NanoPCR等方法也研究、開發出來,但存在較大的局限性——需特殊專業儀器及場地[10-11]。目前,針對貓泛白細胞減少癥病毒的單克隆抗體的臨床應用已相對成熟,而FCV的相關研究卻相對薄弱[9-11]。因此本研究為了優化當前診斷方法,將FCV滅活后作為免疫原進行單克隆抗體制備,成功篩選到的1株FCV單克隆抗體。研究表明該抗體具有良好的特異性,并對5株國內流行FCV毒株均具有IFA、Western blot結合特性。這與先前所報道的FCV雖然變異較大但單一毒株作為免疫原篩選的抗體對不同毒株之間仍具有一定結合特性的相關研究結果相符[6]。目前FCV基因的多樣性是抗原檢測和疫苗免疫失敗的主要原因,但本研究的抗體對多株流行且遺傳關系較遠的毒株具有廣泛的結合特性,因此可為國內FCV流行毒株分離、鑒定、篩選以及診斷方法的優化提供生物原料。

4 結 論

本研究成功制備的MAb 3B11對FCV具有良好的特異性、免疫反應性及廣譜識別性,可作為FCV免疫學診斷的工具,為FCV的診斷方法優化、流行毒株篩選以及深入研究提供生物原料。