枯草芽孢桿菌細菌素的分離、表達及穩定性分析

于秀菊,張敏愛,胡燕姣,朱芷葳,王海東,楊麗華,范闊海

(1.山西農業大學動物醫學學院,太谷 030801;2.太原海關技術中心,太原 030000; 3.山西農業大學生命科學學院,太谷 030801;4.山西農業大學實驗動物管理中心,太谷 030801)

近年來,因抗生素殘留問題導致耐藥菌在衛生、食品、養殖等領域不斷出現[1],開發新型抗生素具有重要的實際意義。細菌素是由某些細菌核糖體合成的一類肽[2],乳酸鏈球菌素(Nisin)是目前研究最深入的細菌素,其在酸性環境下有很強的活性,但在中性和堿性環境時,活性喪失,這個特征限制了其應用[3]。芽孢桿菌細菌素是繼乳酸菌細菌素之后的又一大類細菌素[4],至今被發現的枯草芽孢桿菌細菌素已有幾十種[5],芽孢桿菌細菌素不僅具有無毒無害、高效抑菌、不易殘留、不易產生耐藥性[6]等特點,且與乳酸菌細菌素相比,其抗菌譜較廣,且具有耐高溫、耐酸堿特性[7-9]。加之不同細菌素的氨基酸組成、空間構象、等電點、疏水親水性存在很大的差異,細菌素多樣性特征為其在抗菌領域的應用提供了豐富的選擇材料[10]。因此,細菌素成為最有可能替代抗生素的物質之一。

細菌素是細菌的天然產物,往往與多種物質混合存在,成分復雜,存在功效不明確、機制不清楚等問題,從而限制了其應用。目前,研究者主要通過鹽析法、有機溶劑沉淀法、吸附法等從培養上清中提取細菌素粗品,隨后利用層析柱去除粗品中的雜質,用于SDS-PAGE分析純度,質譜分析獲得細菌素樣品中的全部或部分氨基酸殘基,結合數據庫和分析工具確定生物合成細菌素的基因簇[11-13]。研究表明,細菌素的分子量雖小,但其合成需要一簇基因的共同表達才可完成,還受生長條件等多種因素的影響[14-16]。因此,利用基因工程技術生產細菌素是一條高效、低成本的途徑。

羊駝原產于安第斯高原地區的惡劣環境下,具有抗寒抗旱、抗病力強且可產生天然單域抗體等優良特性[17],這些優良特性可能與其腸道特定菌群有關。面對當前我國全面禁止飼料中添加抗生素的形勢,充分發揮畜禽種質資源優勢,積極篩選高產細菌素的益生菌及其所產細菌素具有重要的意義。本研究采用牛津杯擴散法對羊駝糞便中的產細菌素芽孢桿菌進行分離和篩選,通過形態學觀察和16S rRNA對分離菌株進行鑒定,并通過蛋白分離純化和質譜分析獲得分離菌株所產細菌素的氨基酸序列,利用大腸桿菌表達、KTATMpure純化和活性鑒定獲得具有良好抑菌活性和穩定性的重組類細菌素,以期為細菌素產品的開發及其在畜牧養殖、藥物治療等方面的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 指示菌株

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CMCC26003、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)CMCC(B) 26069、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)CMCC(B) 28001,單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)ATCC19111,大腸桿菌(Escherichiacoli)CMCC 44102、沙門菌(SalmonellaparatyphiA)CMCC(B) 50001保存于山西農業大學羊駝生物工程實驗室。

1.2 產細菌素芽孢桿菌的篩選和鑒定

在山西農業大學羊駝繁育基地,隨機采取10頭羊駝的糞便,按參考文獻[9]的方法進行菌的分離,取0.2 g·頭-1用100 mL PBS將其制成懸液,37 ℃培養箱孵育1 h后,10倍梯度稀釋,取100 μL懸液涂布于LB平板上,37 ℃培養過夜,根據菌落形態、大小和顏色等特征,結合革蘭染色,挑選菌落并進行編號。劃線進化純化,牛津杯擴散法測定挑選菌株上清液的抑菌活性。

通過抑菌活性的比較,得到抑菌活性最佳的1株菌,將其送至北京六合華大基因科技有限公司進行16S rRNA 菌種鑒定。運用NCBI的BLAST進行核苷酸序列的比對,使用Cluster Omega 在線分析軟件,構建系統發育樹,分析目標菌株的同源性和菌種歸屬。

1.3 細菌素的分離純化和質譜分析

按照前期研究的方法[18],對B.subtilisSXAU18的無細胞培養液中的細菌素進行分離純化,獲得細菌素溶液。步驟如下:1)室溫下,用飽和度為30%～70%的硫酸銨對上清液進行鹽析后,10 000×g、4℃離心20 min,PBS重懸蛋白沉淀;2)將蛋白重懸液與氯仿按照1∶1體積比進行混合,震蕩15 min,靜止15 min,4 500×g、4℃離心10 min,收集中間相,真空濃縮儀干燥,PBS重懸氯仿抽提物;3)將抽提后的重懸液通過10 ku和3 ku超濾離心管進行分子截留,獲得>10 ku以上、3～10 ku和<3 ku的蛋白液。以金黃色葡萄球菌為指示菌,檢測分離純化過程細菌素的抑菌活性。蛋白液通過4%～20% SDS-PAGE電泳進行分析,一個泳道進行考馬斯亮藍染色,另4個泳道用0.1% Tween 80清洗3次,30 min·次-1,MilliQ水清洗30 min除去SDS,兩個泳道的整膠和兩個泳道的條帶膠放置到LB固體平板上,分別在上層傾倒含有107CFU·mL-1金黃色葡萄球菌或單增李斯特菌的0.75%TSA軟固體培養基,37℃培養過夜,測定其抑菌活性。

將具有抑菌活性的SDS電泳條帶送至華大基因進行質譜分析。通過UltiMate3000 (Dionex)和Q Exactive (Thermo Fisher Scientific, Millipore, Massachusetts, USA) LC-MS/MS 質譜儀系統進行蛋白序列分析。獲得序列運用Mascot軟件(Matrix Science)進行UniProt分析。通過NCBI、APD數據庫和ExPASy-ProtParam tool對質譜結果進行分析,預測細菌素的氨基酸序列。

1.4 重組蛋白的表達與純化

重組質粒的構建:根據大腸桿菌密碼子偏好性,將獲得的細菌素氨基酸序列進行優化合成,并設計構建原核表達載體的特異性引物,上游和下游引物分別引入HamH I和SalI酶切位點(下劃線所示)。BLIS SXAU181引物序列為:F:5′-TAACGGGATCCCCGGTGGATAATACCGCCGT-3′,R:5′- TTGATGTCGACTGCCTGCGGATGAATCATAT-3′;BLIS SXAU182引物序列為:F:5′-TAACGGGATCCGTTGATCCGTATATGTTCGC-3′,R:5′-TTGATGTCGACGAAGCTGCAGCTCACCACAT-3′。以優化序列質粒為模板,PCR擴增目的基因并進行膠回收,用HamH I和SalI分別對膠回收產物和pCold-I表達質粒進行雙酶切后進行連接反應,將連接產物轉化至DH5α細胞中,通過含Amp的LB平板培養獲得陽性單克隆,隨機挑取單克隆進行基因測序,將鑒定為陽性的單克隆接種于含有Amp的LB中,培養后提取重組質粒。

蛋白表達:將重組質粒轉入BL21(DE3)感受態細胞中,并通過菌液PCR鑒定陽性轉化子。將陽性菌按1∶100的體積比轉接至含Amp的LB培養基中,37 ℃培養至OD600≈0.6時,加入誘導劑IPTG,同時設定對照組,15 ℃,150 r·min-1,誘導培養12 h。離心收集菌體,用PBS重懸菌體,吹打均勻,超聲破碎,離心收集超聲后的上清和沉淀,進行SDS-PAGE分析。

蛋白純化:Ni-IDA-Sepharose Cl-6B親和層析柱用Ni-IDA Binding-Buffer預平衡后,將超聲上清液進行上樣,首先,用平衡緩沖液(20 mmol·L-1Tris-HCl,20 mmol·L-1咪唑,0.15 mol·L-1NaCl,pH=8.0)洗脫雜蛋白,之后,用洗脫緩沖液(20 mmol·L-1Tris-HCl,250 mmol·L-1咪唑,0.15 mol·L-1NaCl,pH=8.0)洗脫目的蛋白。收集洗脫峰的蛋白溶液加入透析袋后,PBS透析過夜。純化樣品進行SDS-PAGE和Western blot分析。

1.5 重組細菌素的活性鑒定

以金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌作為指示菌,采用牛津杯擴散法對重組細菌素的活性進行鑒定。同時設定氨芐青霉素為陽性對照,PBS為陰性對照。分別在孔中加入180 μL的待測樣品,將平板放入培養箱培養過夜,觀察并分析抑菌效果。

1.6 重組BLIS SXAU182對溫度、pH、人工胃液和人工腸液的耐受性測定

將重組BLIS SXAU182(recombinant-BLIS SXAU182,r-BLIS SXAU182)溶液,分別在70、80、90、100 ℃和121 ℃高壓處理30 min,4 ℃條件下放置6 個月。通過牛津杯擴散法測定冷卻后的各處理組溶液的抑菌活性,并以未經處理的r-BLIS SXAU182溶液作為對照。

將r-BLIS SXAU182溶液pH分別調至2.0～12.0,37 ℃處理6 h后,將其pH調至7.0,通過牛津杯擴散法檢測其處理后溶液的抑菌活性,以pH=7.0的r-BLIS SXAU182溶液作為對照。

參考中華人民共和國獸藥典的方法[19],配置人工胃液(simulated gastric fluid, SGF)和人工腸液(simulated intestinal fluid, SIG)[20]。取10 mL的r-BLIS SXAU182溶液分別與90 mL的不同pH的人工胃液或不同濃度膽鹽的人工腸液混合,37 ℃條件下處理6 h,通過牛津杯擴散法測定其處理后溶液的抑菌活性,r-BLIS SXAU182溶液與PBS按照體積比1∶9混合作為對照。

2 結 果

2.1 產細菌素芽孢桿菌的篩選和鑒定

通過菌落形態特征和革蘭染色初篩到20株疑似芽孢桿菌菌株(編號為F1～20),其無細胞上清液的抑菌活性顯示:F15對大腸桿菌具有抑制作用,但作用不顯著;F2、F3、F8、F18和F20對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黃微球菌和單增李斯特菌均具有不同程度的抑制活性。F18與F20的抑菌圈直徑均大于15 mm,且F18的抑菌效果優于F20(表1)。因此,將F18作為分離細菌素的目標菌株進行研究。

表1 分離菌的抑菌活性測定Table 1 Quantification of the antibacterial activity of isolated strains

經劃線培養獲得的F18的單克隆菌落呈乳白色,菌落邊緣較整齊、扁平、菌落表面光滑不透明,干燥、中等大小,形成“皺醭”,且在液體培養時也會有皺醭形成,為需氧菌(圖1A)。革蘭染色菌體呈紫色的短桿狀,單個或成對排列(圖1B)。經16S rRNA通用引物擴增的PCR產物大小為1 446 bp(圖1C),與預期的大小一致;F18在系統發育進化樹上與枯草芽孢桿菌為同一簇(圖1D),且相似度高達99.57%。因此,將其命名為枯草芽孢桿菌SXAU18(B.subtilisSXAU18)。

A. 菌落形態;B. 革蘭染色;C. 16S rRNA 擴增電泳圖;D. 系統發育進化樹 A. Growth morphology; B. Gram staining morphology; C. 16S rRNA amplification electrophoresis; D. Evolutionary tree圖1 分離株的鑒定結果Fig.1 The identification of the isolate strain

2.2 B. subtilis SXAU18細菌素的分離純化和氨基酸序列預測

B.subtilisSXAU18無細胞上清液用飽和30%～70%硫酸銨進行鹽析后,30%、30%～50%、50%～70%分段蛋白粗提液均具有抑菌活性(圖2A、2B);蛋白粗提液通過氯仿抽提和分子截留,分子量>10 ku的蛋白液產生明顯的抑菌圈(圖2C);將>10 ku的蛋白液進行SDS-PAGE分析,結果顯示,在15 ku左右產生明顯的抑菌區域(圖2D)。具有抑菌活性的SDS膠通過LC-MS/MS質譜分析得到2 447個肽,通過Mascot軟件(Matrix Science)對獲得的序列進行UniProt分析獲得71種蛋白質,結合SDS-PAGE電泳和膠條的抑菌活性鑒定對應的蛋白分子量(10～20 ku),進一步篩選出3種與其分子量大小相符的蛋白質。

將預測的3種蛋白序列在抗菌肽數據庫(the Antimicrobial Peptide Database, APD)進行比對,其中兩種蛋白沒有與其匹配的序列,為未知蛋白,一種蛋白與DarA蛋白(c-di-AMP receptor A)序列一致,DarA蛋白晶體結構已經被解析,該蛋白會形成同源三聚體,從而結合三個環二腺嘌呤核苷酸(PDB: 4RLE)[21]。前期研究證明,DarA蛋白具有抑制金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌等革蘭陽性菌的活性[18]。根據細菌素分子結構特點,芽孢桿菌細菌素可分為3類[4]:I類為修飾后細菌素,又稱羊毛硫細菌素,為小分子多肽(<5 ku);II類為無修飾細菌素,為線性小分子多肽(0.77～10 ku);III類為蛋白質樣細菌素(>10 ku),為高分子質量的無修飾蛋白質,其中包括由于遺傳、分子或氨基酸結構等方面數據不全,無法進行分類的抗菌蛋白(即類細菌素)。按照芽孢桿菌細菌素的分類方法,這兩種未知抑菌蛋白屬于芽孢桿菌III類細菌素中類細菌素的范疇,因此將它們命名為類細菌素SXAU181(BLIS SXAU181)和類細菌素SXAU182(BLIS SXAU182)。運用ExPASy-ProtPara工具對這兩種未知蛋白進行預測分析,結果顯示:BLIS SXAU181有203個的氨基酸殘基,預測分子量為22.414 ku,等電點為4.33,分子式為C1 009H1 559N243O321S7,該蛋白較穩定,氨基酸序列為:MKKTFVKKAMLTTAAMTSAALLTFGPDAASAKTPVDNTAVQLQHQAS-TNEDLNTFIDILNQCIYEQDGVYYFDSEKAVE-LGMTKEEAQVIATLWESTSEFFSIVSQCVYLE-DGNYKFDTEKAVELGFTEKEALALEQFFSAV-SLKIHILQAAIVLQDDVYSYDKDAALQAGAT-PLQADVYEKLFSALSQEQLAAIYDMIHPQA;BLIS SXAU182有196個氨基酸殘基,預測分子量為20.059 ku,等電點為8.95,分子式為C932H1335N241O251S4,該蛋白較穩定。氨基酸序列為:MYYVDPYMFAGHFYEPWPAFEYEYRYPWPGIGSGAVPGSGGGSGPGIGGGAVPGFGGG-SGPGIGGGAVPGFGGGSGPGIGGGAVPGFGG-SSGPGIGSGASPGFGGAPQGPPPSQIPAKPPKP-QGSQGAVLLVEPITIRPCLFRFTYVWLTNGR-SFWFYPIILGRRSVGGFYWDSSRRRWVYFAL-DTNHIDVVSCSF。

A～B. 硫酸銨鹽析后的抑菌活性;C. 氯仿抽提和超濾后各個組分的抑菌活性;D. >10 ku蛋白液的SDS電泳和抑菌活性分析:a.SDS條帶對金黃色葡萄球菌(1)和單增李斯特菌(2)具有明顯的抑菌活性;b. SDS-PAGE:3. 低分子蛋白marker (40～1.7 ku);4. >10 ku蛋白樣品。c. 10～15 ku大小的條帶對金黃色葡萄球菌(5)和單增李斯特菌(6)具有明顯的抑菌活性 A-B. Antibacterial activity of ammonium sulfate precipitation; C. Antibacterial activity of Chloroform extraction and ultrafiltration collection; D. SDS-PAGE analysis of purified >10 ku protein solution and detection of antibacterial activity on gel: a. Gel overlaid with S. aureus (1) or L. monocytogenes (2) showing a clearing inhibitory zone indicating antibacterial activity associated with over>10 ku band. b. SDS-PAGE: 3. Low-range protein ladder (40-1.7 ku); 4. >10 ku protein sample. c. SDS Gel overlaid with S. aureus (5) or L. monocytogenes(6) showing a clearing inhibitory zone indicating antibacterial activity associated with over 10-15 ku band圖2 枯草芽孢桿菌SXAU18所產抑菌物質在分離純化過程中的抑菌活性檢測Fig.2 Antibacterial activity assay of purification process of bacterocin-like substance produced by B. subtilis SXAU18

2.3 類細菌素SXAU181和182的原核表達和純化

密碼子優化合成的基因序列經擴增、酶切、連接構建重組表達質粒。對重組質粒進行雙酶切和測序檢測目的基因成功連接至pCold-I載體。將陽性重組質粒轉化至BL21(DE3),低溫條件下經IPTG誘導表達,表達產物經SDS-PAGE分析得出:BLIS SXAU181和182均可通過原核表達系統實現重組表達,裂解后獲得的上清和沉淀物中均含有目的蛋白,且產物大部分以可溶性蛋白的形式存在,少量形成包涵體(圖3A和圖4A)。r-BLIS SXAU181和182大小分別約為25和19 ku;利用鎳柱對重組蛋白進行純化,純化后的r-BLIS SXAU181和182經SDS-PAGA檢測無雜帶,均為單一條帶,具有較高的濃度和純度(圖3B和圖4B)。Western blot分析表明,r-BLIS SXAU181和r-BLIS SXAU182可與鼠抗His單克隆抗體特異性結合,其蛋白大小均與預計大小大致相符(圖3C和圖4C)。

A. 重組BLIS SXAU181蛋白原核表達SDS電泳圖:M. 蛋白marker;1. 未誘導組;2. 誘導組;3. 誘導組超聲波破碎后上清;4.誘導組超聲波破碎后沉淀。B. 重組BLIS SXAU181純化的SDS電泳圖:M. 蛋白marker;1. 超聲波破碎后的樣品;2. 流出;3. 洗脫。C. 純化后r-BLIS SXAU 181的Western blot結果:M. 蛋白marker;1. 純化樣品 A. SDS-PAGE of r-BLIS SXAU 181 expression: M. Protein marker; 1. Non-induced group; 2. Induced group; 3. Supernatant after induction of fragmentation; 4. Precipitation after induction of fragmentation. B. SDS-PAGE analysis of r-BLIS SXAU181 purification: M. Protein Marker; 1. Samples after Ultrasonic breaking; 2. Flow-through; 3. Elution. C. Western blot analysis of r-BLIS SXAU181 purification: M. Protein Marker; 1. Purified sample圖3 r-BLIS SXAU181表達純化的SDS-PAGE和Western blot分析Fig.3 SDS-PAGE and Western blot analysis of r-BLIS SXAU181 protein expression and purification

A. 重組BLIS SXAU 182蛋白原核表達SDS電泳圖:M. 蛋白marker;1. 未誘導組;2. 誘導組;3.誘導組超聲波破碎后上清;4. 誘導組超聲波破碎后沉淀。B. 重組BLIS SXAU 182純化的SDS電泳圖:M. 蛋白marker;1. 超聲波破碎后的樣品;2. 流出;3. 洗脫;C. 純化后r-BLIS SXAU 182的Western blot結果:M. 蛋白marker;1. 純化樣品 A. SDS-PAGE of r-BLIS SXAU 182 expression: M. Protein marker; 1. Non-induced group; 2. Induced group; 3. Supernatant after induction of fragmentation; 4. Precipitation after induction of fragmentation. B. SDS-PAGE analysis of r-BLIS SXAU182 purification: M. Protein Marker; 1. Samples after Ultrasonic breaking; 2. Flow-through; 3. Elution. C. Western blot analysis of r-BLIS SXAU182 purification: M. Protein Marker; 1. Purified sample圖4 r-BLIS SXAU182表達純化的SDS-PAGE和Western blot分析Fig.4 SDS-PAGE and Western blot analysis of r-BLIS SXAU182 protein expression and purification

2.4 重組類細菌素的活性鑒定

r-BLIS SXAU181沒有抑制金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌生長的活性(圖5A和5E);r-BLIS SXAU182具有抑制金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌生長的活性(圖5B和5F),r-BLIS SXAU182對金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的抑菌圈直徑分別為21.95±0.32和16.30±0.51(表2)。同時,Amp陽性對照孔周圍的細菌生長受到了明顯的抑制(圖5C和5G),Amp對金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌產生的抑菌圈直徑分別為28.05±0.14和24.71±0.39(表2);PBS陰性對照孔周圍的細菌生長未受抑制(圖5D和5H),結果表明,通過原核表達系統獲得的r-BLIS SXAU181無抑菌活性,r-BLISSXAU182具有良好的抑菌活性。

圖5 重組BLIS SXAU182蛋白的抑菌活性分析Fig.5 Antibacterial activity of r-BLIS SXAU182

表2 重組BLIS SXAU182的抑菌活性測定Table 2 Determination of the antibacterial activity of r-BLIS SXAU182

2.5 r-BLIS SXAU182對高溫、pH、人工胃液和腸液的穩定性

r-BLIS SXAU182具有較好的熱穩定性和pH穩定性(表3)。該細菌素在100 ℃條件下處理30 min后抑菌活性為75%以上,121 ℃處理30 min后抑菌活性仍達60%左右,4 ℃放置6個月對其抑菌活性基本沒有影響;該細菌素在pH=2.0～12.0條件下,抑制活性保持在60%以上,最適pH是8.0。該細菌素具有較強的耐膽堿和耐胃蛋白酶能力,在pH=2.0條件下胃蛋白酶作用6 h后抑菌活性保持45%以上,抑菌活性隨著pH的上升而增加。在0.9%膽鹽濃度條件下作用6 h后抑菌活性仍維持在30%以上,抑菌活性隨著膽鹽濃度的下降而增加。

3 討 論

芽孢桿菌屬是革蘭陽性菌中一個十分多樣的菌屬,有200多個亞種[22]。芽孢桿菌屬產生的細菌素具有不同的分子大小、序列、結構和抗菌活性。芽孢桿菌細菌素是繼乳酸菌細菌素后的又一大類細菌素,由于其具有抗菌譜廣、無毒無害、耐受性強、不易引起病原菌耐藥等特征,因此,近年來芽孢桿菌細菌素的篩選和應用更加備受研究者的關注[5]。隨著蛋白質分離純化技術的快速發展,越來越多的枯草芽孢桿菌的活性物質被認知和應用。例如:Wei等[23]從B.subtilisJS-4中分離到可抑制李斯特菌生長的枯草桿菌素JS-4;Pinontoan等[24]從納豆中分離到具有纖溶活性的B.subtilisG8;Watanakij等[25]從發酵的谷物中分離到具有降解黃曲霉毒素活性的B.subtilisBCC 42005。本研究從羊駝糞便中分離到20株芽孢桿菌,其中16株菌對指示菌具有不同的抑菌活性。通過對抑菌活性的分析比較,篩選抗菌譜較廣、抑菌活性較高的枯草芽孢桿菌SXAU18進行細菌素的分離純化,質譜分析說明B.subtilisSXAU18產生多種的抑菌蛋白,與研究報道的“絕大多數細菌可產生至少一種細菌素”[26]論述一致。目前已報道的枯草芽孢桿菌細菌素有subtilin、sublancin、subtilosin A、TasA等,但仍有許多抑菌蛋白由于缺少DNA和蛋白的序列信息還沒有被分類。本研究分析預測的3種抑菌,其中一種蛋白為DarA蛋白,為已知蛋白,另外兩種為未知的蛋白。根據這兩種未知蛋白的分子量大小和氨基酸序列特點,并結合芽孢桿菌細菌素分類方法,屬于芽孢桿菌III類細菌素中的類細菌素的范疇,從而命名為細菌素SXAU181和182。

表3 溫度和pH對B. Subtilis SXAU18所產細菌素抑菌活性的影響Table 3 Effects of heat, pH on the antimicrobial activity of bactericin from B. Subtilis SXAU18

細菌素雖小,但由一簇基因編碼[14-16],且與眾多物質混合,提取困難、操作繁瑣、產量低。通過蛋白分離和質譜分獲得B.subtilisSXAU18所產細菌素的氨基酸序列,分子量大小為10～20 ku,為通過基因工程技術獲得重組細菌素提供了基因序列。加之,B.subtilisSXAU18的抗菌譜顯示,所產細菌素對金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌和單增李斯特桿菌等革蘭陽性菌具有抑制其生長的活性,但對于大腸桿菌沒有抑制活性。根據這些特點,本研究選擇大腸桿菌表達系統作為類細菌素的體外表達系統[27]。大量研究證明,根據表達體系的特性進行密碼子的優化可以提高重組蛋白的表達量[28],低溫誘導可改變折疊動力學,降低中間折疊體的產生,從而增加可溶性蛋白的表達比例[29]。因此,本研究按照大腸桿菌的密碼子偏好性對BLIS SXAU181和182的基因序列進行優化,并選擇pCold-I作為表達質粒,進行低溫誘導,實現了BLIS SXAU181和182的可溶性表達。最終獲得了抑菌活性良好的r-BLIS SXAU182。為BLIS SXAU182功能解析及其應用奠定了理論基礎。

細菌素的穩定性極大限制了其應用。乳酸鏈球菌素(Nisin)在酸性環境下有很強的活性,但在中性和堿性環境下,活性喪失[3]。Lee等[30]從貝氏芽孢桿菌BS2分離到的細菌素Bacbs2,在pH=4～9條件下完全穩定,在pH=1～3時活性減半;在80 ℃處理15 min保持完全活性,但90℃處理15 min或100℃處理10 min活性減半。r-BLIS SXAU182具有較高的穩定性,在暴露121℃高溫30 min后保持45%的抑菌活性,pH=2.0～12.0條件下,仍保持60%以上的活性,且具耐膽堿的生物特性。這些優良特性使得BLIS SXAU182在飼料加工、藥物治療等方面具有潛在的應用前景。

4 結 論

從羊駝糞便中篩選到產細菌素的枯草芽孢桿菌SXAU18,從其培養液中分離純化細菌素,預測獲得兩種類細菌素的氨基酸序列,并通過大腸桿菌表達系統獲得具有抑制金黃色葡萄球菌和單增李斯特桿菌生長且穩定性良好的r-BLIS SXAU182。