miR-24-3p對(duì)豬顆粒細(xì)胞雌二醇合成的作用

時(shí)勝潔,王立光,高 磊,蔡傳江,何偉先,褚瑰燕*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,楊凌 712100;2.齊全農(nóng)牧集團(tuán)股份有限公司,遂寧 629000)

卵泡是哺乳動(dòng)物卵巢的功能單位,由膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞(GCs)和卵母細(xì)胞組成[1]。顆粒細(xì)胞作為卵巢卵泡中最大的細(xì)胞群,其雌二醇合成能力對(duì)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育是至關(guān)重要的[2]。顆粒細(xì)胞通過(guò)分泌雌二醇維持內(nèi)分泌系統(tǒng)平衡[3-4],抑制顆粒細(xì)胞凋亡,并促進(jìn)有腔卵泡發(fā)育[5]。雌二醇的合成是以膽固醇為底物經(jīng)過(guò)多種酶的催化和切割完成的[6],雌激素合成的限速步驟是StAR介導(dǎo)的膽固醇從線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體內(nèi)膜,其中細(xì)胞色素P450酶催化膽固醇側(cè)鏈的裂解,通過(guò)CYP11A1轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮[7],最后芳香化酶在顆粒細(xì)胞中將睪酮轉(zhuǎn)化為雌二醇。

microRNAs (miRNA)是長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸并具有調(diào)控基因表達(dá)功能的非編碼小RNA分子,參與許多關(guān)鍵的細(xì)胞生理過(guò)程。miRNA通過(guò)結(jié)合靶基因的3′-UTR特定序列來(lái)靶向mRNA,使其降解或抑制翻譯,從而在轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平上抑制基因表達(dá)[8]。多項(xiàng)研究表明,miRNA可以通過(guò)直接調(diào)控雌二醇合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶或蛋白從而影響雌二醇合成,例如,在豬的顆粒細(xì)胞中miR-378直接靶定CYP19A1抑制其轉(zhuǎn)錄后翻譯進(jìn)而抑制雌二醇的合成[9]。miRNA也可以通過(guò)影響促性腺激素受體或相關(guān)信號(hào)通路等生物學(xué)過(guò)程間接調(diào)控雌二醇合成,例如,miR-31和miR-143通過(guò)靶向促卵泡素受體(FSHR)抑制牛卵泡中雌二醇和孕酮的合成[10],miR-574通過(guò)靶定TIMP3抑制p-ERK1/2信號(hào)通路從而影響顆粒細(xì)胞雌二醇的合成[11]。

microRNA-24-3p (miR-24-3p)是動(dòng)物體內(nèi)高度保守的非編碼RNA,其成熟序列包含22個(gè)核苷酸,在不同物種組織和細(xì)胞的不同發(fā)育階段表現(xiàn)出特定的表達(dá)譜[12]。miR-24-3p在多個(gè)生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,其研究報(bào)道多集中在癌癥[13-14]、心臟纖維化[15]、細(xì)胞增殖凋亡[16]等方面。在動(dòng)物繁殖領(lǐng)域,miR-24-3p在產(chǎn)仔數(shù)高(>16.4 頭·窩-1)的大白母豬卵巢組織中的表達(dá)水平高于低產(chǎn)母豬(<7.4頭·窩-1)[17]。在患有多囊卵巢綜合征的女性卵泡液中miR-24-3p的水平降低[18],表明miR-24-3p對(duì)卵泡發(fā)育至關(guān)重要。優(yōu)勢(shì)卵泡顆粒細(xì)胞合成雌二醇的能力高于普通卵泡,有研究表明,從奶牛發(fā)情第7天的優(yōu)勢(shì)卵泡分離的顆粒細(xì)胞中miR-24-3p的表達(dá)高于從屬卵泡[19]。前期研究發(fā)現(xiàn),miR-24-3p在豬顆粒細(xì)胞中通過(guò)靶定P27促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡[20]。而且顆粒細(xì)胞的雌二醇合成能力能夠影響細(xì)胞增殖與凋亡,基于以上的研究基礎(chǔ),假設(shè)miR-24-3p可能調(diào)節(jié)豬顆粒細(xì)胞的雌二醇合成,本研究將明確miR-24-3p在豬顆粒細(xì)胞雌二醇合成中的作用及其調(diào)控機(jī)制,提示miR-24-3p是顆粒細(xì)胞內(nèi)分泌功能的關(guān)鍵調(diào)控因子。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM/F12(Gibco公司),10% 胎牛血清(Hyclone公司),豬的雌二醇 ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司),蛋白裂解液RIPA(碧云天生物技術(shù)),negative control (NC),miR-24-3p-mimics,miR-24-3p-inhibitor (上海吉瑪生物公司),X-tremeGENE HP DNA羅氏轉(zhuǎn)染試劑(德國(guó)羅氏公司),抗體:StAR(Cell Signaling Technology公司),CYP19A1(Gene Tex),CYP11A1(Abcam公司), TOP1(abways公司),BMAL1(Santa Cruz公司),Mouse Antibody(abways公司),Rabit Antibody(Abways公司),β-actin(Cell Signalling Technology公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和試驗(yàn)分組

本試驗(yàn)中所用的顆粒細(xì)胞取樣自楊凌本香集團(tuán)生豬屠宰場(chǎng)的180日齡健康母豬的卵巢組織。從生殖系統(tǒng)中剪掉連接的子宮和韌帶分離出健康的卵巢,立即放入含有100 IU·mL-1雙抗(青、鏈霉素)的37 ℃生理鹽水中,1 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用75%酒精快速清洗3遍(酒精浸泡時(shí)間不要超過(guò)20 s),用含有雙抗的37 ℃生理鹽水清洗3遍,待用。在卵巢中選擇直徑為3～5 mm的健康卵泡,用10 mL注射器吸取卵泡中卵泡液;在1 500 g下離心10 min,棄去卵泡液上清;加入適量含有雙抗37 ℃的PBS輕輕吹打離心后的沉淀,清洗其中的顆粒細(xì)胞,1 500 g離心10 min,棄去PBS上清;加入含有10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,反復(fù)輕輕吹打,直至細(xì)胞完全散開(kāi)、混勻;將適量混勻的細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中,置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);接種24 h后觀察顆粒細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況,吸去培養(yǎng)基及未貼壁的顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞;使用含有雙抗37 ℃的PBS清洗貼壁的顆粒細(xì)胞,輕輕吹洗3遍,盡量將未貼壁的顆粒細(xì)胞及雜質(zhì)清除干凈;吸取PBS,更換新培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)。試驗(yàn)對(duì)照組為mimics-NC/inhibitor-NC,處理組為mimics-miR-24-3p/inhibitor-miR-24-3p/mimics-miR-24-3p+TOP1,使用X-tremeGENE HP DNA羅氏轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染,24 h后細(xì)胞密度為80%時(shí)收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)[21]。

1.3 ELISA檢測(cè)雌二醇濃度

按照ELISA試劑盒(貨號(hào):YJ002366)說(shuō)明書(shū)檢測(cè)培養(yǎng)基中的雌二醇水平,450 nm處的吸光度值表示在Multiskan TM FC (賽默飛世爾科技有限公司)上測(cè)量的激素的相對(duì)濃度,不同處理的培養(yǎng)基樣品在2 000 g離心20 min,將稀釋后的上清加入預(yù)先包被雌二醇特異性抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)條帶板,然后在37 ℃下用酶標(biāo)結(jié)合的雌二醇抗體孵育30 min。洗滌后,加入底物溶液以觸發(fā)顯色反應(yīng)。使用Multiskan TM FC分光光度計(jì)在450 nm處測(cè)量(賽默飛世爾科技有限公司)吸光度[22]。

1.4 總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用TRIzol試劑 (TaKaRa公司)提取GCs中的總RNA,并使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)(賽默飛世爾科技有限公司)測(cè)定其濃度,將總RNA (500 ng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。StepOne Real-Time PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)(引物序列見(jiàn)表1),用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量,檢測(cè)基因表達(dá)水平時(shí)將β-actin基因作為內(nèi)參進(jìn)行歸一,檢測(cè)miR-24-3p水平時(shí),U6小RNA作為內(nèi)參。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequences

1.5 總蛋白提取及Western blot檢測(cè)

使用RIPA裂解液提取顆粒細(xì)胞中的總蛋白,用BCA法(Cwbio)測(cè)定蛋白濃度,蛋白定量后取20 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉,用目的蛋白稀釋好的一抗進(jìn)行4 ℃過(guò)夜孵育,將一抗孵育完的膜用TBST洗膜4次,每次5 min,將膜置于稀釋好的的二抗中,室溫孵育1 h,TBST洗膜4次,將Milipore的化學(xué)發(fā)光液滴加到膜上利用FluorChemRSystem(ProteinSimple)成像軟件系統(tǒng)分析蛋白條帶。曝光完成后,利用Image Lab軟件對(duì)蛋白結(jié)果進(jìn)行定量分析。

1.6 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)

使用target Scan 6.2和RNAhybrid網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-24-3p的靶基因。熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(psi-CHECK2)購(gòu)于通用生物公司,將miR-24-3p-NC或miR-24-3p-mimics與CHECK2-TOP1報(bào)告載體或突變載體共轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24 h后收取細(xì)胞。采用雙熒光素酶測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定熒光素酶活性(Promega, Madison, WI, USA)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prime 8.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均以3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的“means ± SEMs”表示。采用雙尾非配對(duì)學(xué)生t檢驗(yàn)對(duì)兩個(gè)試驗(yàn)組進(jìn)行比較。P<0.05、P<0.01、P<0.001、P<0.000 1分別用星號(hào)(*)、(**)、(***)、(****)表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的值。

2 結(jié) 果

2.1 過(guò)表達(dá)miR-24-3p促進(jìn)顆粒細(xì)胞的雌二醇合成

雌二醇合成是豬顆粒細(xì)胞重要的內(nèi)分泌功能,隨著卵泡腔的增大雌二醇的水平逐漸升高。miR-24-3p在豬小、中、大有腔卵泡中的表達(dá)水平有逐漸升高的趨勢(shì)(圖1A)。miR-24-3p-NC及miR-24-3p-mimics處理顆粒細(xì)胞后,試驗(yàn)結(jié)果表明在miR-24-3p-mimics處理組miR-24-3p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.001,圖1B),并且促進(jìn)了StAR、CYP11A1、CYP19A1的轉(zhuǎn)錄(P<0.05,圖1D)。ELISA結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)miR-24-3p后,培養(yǎng)基中的雌二醇含量顯著升高(P<0.01,圖1C)。此外過(guò)表達(dá)miR-24-3p可以顯著促進(jìn)StAR、CYP19A1及CYP11A1的蛋白表達(dá)水平(P<0.05,圖1E&F)。這些結(jié)果表明miR-24-3p可以通過(guò)上調(diào)雌二醇合成關(guān)鍵基因的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)雌二醇的合成。

2.2 干擾miR-24-3p抑制顆粒細(xì)胞的雌二醇合成

為了反向驗(yàn)證miR-24-3p對(duì)豬卵巢顆粒細(xì)胞雌二醇合成的作用,在顆粒細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-24-3p-inhibitor達(dá)到抑制miR-24-3p表達(dá)的作用(P<0.000 1,圖2A),ELISA結(jié)果表明干擾miR-24-3p后雌二醇的含量顯著降低 (P<0.05,圖2B)。干擾miR-24-3p可以顯著下調(diào)CYP19A1、CYP11A1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平(P<0.05,圖2C-E)。以上結(jié)果表明干擾miR-24-3p可通過(guò)抑制雌二醇合成關(guān)鍵基因的表達(dá)進(jìn)而抑制雌二醇的合成。

2.3 TOP1是miR-24-3p的直接靶基因

為了闡明miR-24-3p在顆粒細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制,在前期研究中使用miRDB、miRWalk、miRTarBase和TargetScan網(wǎng)站預(yù)測(cè)了miR-24-3p的靶基因,篩選出17個(gè)交集基因,試驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)miR-24-3p mimics抑制TOP1、CDC38、P27的mRNA水平,而miR-24-3p inhibitor增加其表達(dá)[20]。已有研究發(fā)現(xiàn)TOP1通過(guò)降低Bmal1水平抑制雌二醇合成[23]。通過(guò)BiBiServ軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-24-3p的種子序列可以與TOP1 mRNA 3′UTR的序列完全匹配(圖3A)。接下來(lái)構(gòu)建了TOP1野生型與突變型的雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(圖3B)并與miR-24-3p mimics共轉(zhuǎn)染HEK293 T細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)miR-24-3p可以顯著抑制野生型TOP1的活性(P<0.000 1),但對(duì)突變型的TOP1無(wú)顯著影響(圖3C)。這些結(jié)果表明TOP1是miR-24-3p的直接靶基因。

2.4 miR-24-3p抑制TOP1 mRNA和蛋白的表達(dá)

以上結(jié)果表明,miR-24-3p的種子序列能直接靶定TOP1的3′UTR區(qū),接下來(lái)進(jìn)一步探究miR-24-3p對(duì)TOP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響,將miR-24-3p mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染進(jìn)顆粒細(xì)胞,結(jié)果表明過(guò)表達(dá)miR-24-3p可顯著抑制TOP1的轉(zhuǎn)錄與翻譯,促進(jìn)BMAL1的表達(dá)(P<0.05,圖4A-C),而抑制miR-24-3p則可顯著提高TOP1的mRNA和蛋白水平,抑制BMAL1的表達(dá)(圖4D-F)。

2.5 過(guò)表達(dá)TOP1可減弱miR-24-3p對(duì)顆粒細(xì)胞雌二醇合成的促進(jìn)作用

為了進(jìn)一步證明TOP1在促進(jìn)miR-24-3p合成雌二醇中的作用,通過(guò)構(gòu)建TOP1的過(guò)表達(dá)載體,并將其與miR-24-3p-mimics共轉(zhuǎn)染到豬顆粒細(xì)胞中,pcDNA-TOP1處理組的TOP1 mRNA水平顯著升高(P<0.05,圖5A)。與pcDNA-3.1+miR-24-3p-mimics處理組相比,pcDNA-TOP1+miR-24-3p-mimics共轉(zhuǎn)染組雌二醇濃度顯著下降(P<0.05,圖5B)。已有研究表明,BMAL1可以促進(jìn)豬顆粒細(xì)胞的雌二醇合成[23],而TOP1能夠抑制BMAL1轉(zhuǎn)錄[24],因此對(duì)BMAL1在不同處理組的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),CYP11A1、CYP19A1和BMAL1蛋白水平顯著下降(P<0.05,圖5C&D),表明過(guò)表達(dá)TOP1可減弱miR-24-3p對(duì)顆粒細(xì)胞雌二醇合成的促進(jìn)作用。

3 討 論

顆粒細(xì)胞作為卵泡發(fā)育必需的細(xì)胞類(lèi)型,雌二醇合成是顆粒細(xì)胞重要的內(nèi)分泌功能[25]。大量研究表明,miRNA參與到雌二醇的合成調(diào)控過(guò)程。在豬卵巢顆粒細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-31可以抑制FSHR和HSD17B14的表達(dá)進(jìn)而抑制雌二醇合成,miR-20b可靶向并抑制HSD17B14的表達(dá)進(jìn)而抑制雌二醇的合成[26],miR-495-3p能夠刺激類(lèi)固醇激素分泌從而影響山羊卵泡的發(fā)育[27]。目前大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn),miRNA在卵巢顆粒細(xì)胞雌二醇的合成過(guò)程中發(fā)揮著負(fù)調(diào)控作用,但仍有少部分miRNA發(fā)揮正相關(guān)的調(diào)控作用,例如miR-132參與cAMP信號(hào)通路,并通過(guò)抑制卵巢顆粒細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)核受體相關(guān)1(Nurr1)的翻譯促進(jìn)雌二醇合成[28],此外,miR-133b通過(guò)靶向Foxl2介導(dǎo)StAR和CYP19A1的負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)來(lái)從而刺激雌激素的產(chǎn)生[29]。已有研究表明,miR-24-3p的表達(dá)水平與母豬產(chǎn)仔數(shù)[17]、卵泡發(fā)育能力相關(guān)[18-19],前期研究基礎(chǔ)也證明miR-24-3p促進(jìn)豬顆粒細(xì)胞的增殖并抑制細(xì)胞凋亡[20],而且顆粒細(xì)胞的增殖凋亡等生理功能與雌二醇合成的內(nèi)分泌功能息息相關(guān)[30]。因此,為了探究miR-24-3p對(duì)顆粒細(xì)胞雌二醇合成的影響,通過(guò)在顆粒細(xì)胞中過(guò)表達(dá)和抑制miR-24-3p的水平,發(fā)現(xiàn)miR-24-3p促進(jìn)雌二醇的合成。在顆粒細(xì)胞雌二醇合成過(guò)程中,CYP11A1將膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮,這是類(lèi)固醇激素合成過(guò)程中的第一個(gè)限速反應(yīng)[31],CYP19A1編碼的芳香化酶將睪酮轉(zhuǎn)化為雌二醇[32],本研究結(jié)果也表明,miR-24-3p通過(guò)顯著上調(diào)雌二醇合成關(guān)鍵基因CYP11A1和CYP19A1的mRNA和蛋白水平來(lái)促進(jìn)雌二醇合成。

A. miR-24-3p在豬小、中、大卵泡中的表達(dá)水平;B. 轉(zhuǎn)染miR-24-3p mimics后的過(guò)表達(dá)效率;C. ELISA檢測(cè)miR-24-3p過(guò)表達(dá)24 h后上清中雌二醇的濃度;D. 轉(zhuǎn)染miR-24-3p mimics 24 h后雌二醇合成相關(guān)基因StAR、CYP19A1、CYP11A1、FSHR和LHCGR mRNA的相對(duì)水平;E. 轉(zhuǎn)染24 h后雌二醇合成相關(guān)基因StAR、CYP19A1、CYP11A1的相對(duì)蛋白水平;F. StAR、CYP19A1、CYP11A1定量蛋白分析。結(jié)果為3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”;*.P<0.05,**. P<0.01,****.P<0.000 1,ns表示差異不顯著,下同 A. The levels of miR-24-3p in porcine small, medium and large follicles; B. The overexpression efficiency of miR-24-3p mimics; C. The concentration of E2 in the supernatant after overexpression of miR-24-3p is detected by ELISA for 24 h; D. Relative levels of steroid synthesis-related genes StAR, CYP19A1, CYP11A1, FSHR and LHCGR mRNA after transfection of miR-24-3p mimics for 24 h; E. Relative protein levels of steroid synthesis-related genes StAR, CYP19A1, CYP11A1 after transfection for 24 h; F. Quantification proteins analysis of StAR, CYP19A1 and CYP11A1. Results are “means ± SEMs” of 3 independent experiments; *.P<0.05,**.P<0.01,****.P<0.000 1, ns indicate no significant difference, the same as below圖1 過(guò)表達(dá)miR-24-3p促進(jìn)顆粒細(xì)胞中雌二醇的合成Fig.1 Overexpression of miR-24-3p promotes E2 synthesis in granulosa cells

A. miR-24-3p-inhibitor與NC的干擾效率比較;B. ELISA檢測(cè)miR-24-3p干擾24 h后上清中雌二醇的濃度;C. 轉(zhuǎn)染miR-24-3p inhibitor 24 h后,雌二醇合成相關(guān)基因StAR、CYP19A1、CYP11A1、FSHR和LHCGR mRNA的相對(duì)水平;D. 轉(zhuǎn)染miR-24-3p inhibitor 24 h后雌激素合成相關(guān)基因StAR、CYP19A1、CYP11A1的相對(duì)蛋白水平;E. StAR、CYP19A1、CYP11A1定量蛋白分析 A. Interference efficiency of miR-24-3p inhibitor compared with NC; B. The concentration of E2 in the supernatant after interference of miR-24-3p for 24 h is detected by ELISA; C. Relative levels of steroid synthesis-related genes StAR, CYP19A1, CYP11A1, FSHR and LHCGR mRNA after transfection of miR-24-3p inhibitor for 24 h; D. Relative protein levels of steroid synthesis-related genes StAR, CYP19A1 and CYP11A1 after transfection of miR-24-3p inhibitor for 24 h; E. Quantification proteins analysis of StAR, CYP19A1 and CYP11A1圖2 干擾miR-24-3p抑制顆粒細(xì)胞中雌二醇的合成Fig.2 Interfering with miR-24-3p reduced E2 synthesis in granulosa cells

A. miR-24-3p與TOP1 mRNA 3′ UTR序列結(jié)合能預(yù)測(cè);B. TOP1野生型和突變型雙熒光素酶載體構(gòu)建的序列;C. 共轉(zhuǎn)染的后的雙熒光素酶活性 A. Prediction of the binding energy of miR-24-3p to TOP1 mRNA 3′ UTR sequence; B. Sequence constructed by TOP1 wild-type and mutant dual-luciferase vectors; C. Dual-luciferase activity after co-transfection圖3 TOP1是miR-24-3p的直接靶基因Fig.3 TOP1 is a direct target gene of miR-24-3p

A. 轉(zhuǎn)染miR-24-3p mimics 24 h后TOP1的mRNA水平;B. 轉(zhuǎn)染miR-24-3p mimics 24 h后TOP1的蛋白水平;C. 蛋白結(jié)果的定量分析;D. 轉(zhuǎn)染miR-24-3p inhibitor 24 h后TOP1的mRNA水平;E. 轉(zhuǎn)染miR-24-3p inhibitor 24 h后TOP1的蛋白水平;F. 蛋白結(jié)果的灰度分析。結(jié)果呈現(xiàn)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”,*.0.01

A. pcDNA-TOP1轉(zhuǎn)染進(jìn)顆粒細(xì)胞的過(guò)表達(dá)效率;B. ELISA檢測(cè)上清液中的雌二醇含量;C. 共轉(zhuǎn)染后的CYP19A1和CYP11A1的蛋白水平;D. 蛋白的定量統(tǒng)計(jì) A. The overexpression efficiency of pcDNA-TOP1 transfected into granulosa cells; B. ELISA to detect estradiol content in supernatant; C. CYP19A1 and CYP11A1 protein levels after co-transfection; D. Quantitative statistics of proteins圖5 過(guò)表達(dá)TOP1減弱miR-24-3p對(duì)顆粒細(xì)胞雌二醇合成的促進(jìn)作用Fig.5 Overexpression of TOP1 attenuates the promoting effect of miR-24-3p on estradiol synthesis in granulosa cells

在明確了miR-24-3p促進(jìn)顆粒細(xì)胞合成雌二醇的功能基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探究其具體的調(diào)控機(jī)制。通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)及雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-24-3p可能靶向TOP1, TOP1是拓?fù)洚悩?gòu)酶家族的一員,在DNA復(fù)制過(guò)程中斷裂,然后隨著DNA鏈的旋轉(zhuǎn)進(jìn)而催化斷裂鏈的重新連接,從而改變螺旋DNA的拓?fù)錉顟B(tài)[33]。研究表明,TOP1位于BMAL1啟動(dòng)子上的兩個(gè)RORE元件之間,TOP1結(jié)合位點(diǎn)是轉(zhuǎn)錄抑制所必需的,TOP1與遠(yuǎn)端RORE協(xié)同作用,導(dǎo)致BMAL1轉(zhuǎn)錄被TOP1抑制而下調(diào)[24]。在外周血單核細(xì)胞中,敲降Bmal1導(dǎo)致雌二醇合成顯著減少[34],在豬卵巢顆粒細(xì)胞中,Bmal1可通過(guò)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)雌二醇的合成[23]。因此,假設(shè)miR-24-3p通過(guò)靶向TOP1促進(jìn)BMAL1的合成,從而促進(jìn)雌二醇合成。通過(guò)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明過(guò)表達(dá)miR-24-3p抑制TOP1水平,同時(shí)促進(jìn)BMAL1的轉(zhuǎn)錄和翻譯,而抑制miR-24-3p則具有相反的結(jié)果。為了證明TOP1介導(dǎo)miR-24-3p對(duì)雌二醇合成的作用,在過(guò)表達(dá)miR-24-3p的基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá)TOP1,回補(bǔ)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了過(guò)表達(dá)TOP1會(huì)減弱miR-24-3p對(duì)顆粒細(xì)胞雌二醇合成的促進(jìn)作用。針對(duì)TOP1的研究多集中在DNA損傷修復(fù)[35]、癌細(xì)胞的藥物靶點(diǎn)[36]、基因表達(dá)調(diào)控[37]等方面,目前尚無(wú)其他相關(guān)報(bào)道表明miRNA通過(guò)靶定TOP1在顆粒細(xì)胞雌二醇合成過(guò)程中發(fā)揮作用,但在癌細(xì)胞中已有研究表明TOP1作為miRNA靶基因發(fā)揮作用,miR-23a介導(dǎo)的TOP1表達(dá)抑制增強(qiáng)了人肝癌細(xì)胞對(duì)依托泊苷的反應(yīng)[38],miR-149可能通過(guò)抑制TOP1發(fā)揮其在癌癥預(yù)后中的作用[39]。

4 結(jié) 論

在豬顆粒細(xì)胞中,miR-24-3p通過(guò)直接靶向TOP1抑制其mRNA和蛋白水平,從而上調(diào)BMAL1的表達(dá),提高雌二醇合成相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)而促進(jìn)雌二醇合成。