亮氨酸通過PI3K-AKT信號通路促進(jìn)牛成肌細(xì)胞的增殖

苗 舒,安濟(jì)山,王 祚,肖定福,蘭欣怡,劉 磊,沈維軍*,萬發(fā)春*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長沙 410128;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,長沙 410128)

2022年我國牛肉進(jìn)口314萬噸,高居全球第一,表明我國牛肉市場存在巨大缺口[1]。骨骼肌是肉牛軀體占比最高的組成部分,與產(chǎn)肉性能直接相關(guān)。動物出生后,成肌細(xì)胞的增殖、分化與融合被看作是參與骨骼肌發(fā)育的重要途徑[2]。Leu是參與動物機(jī)體多種細(xì)胞和生理過程的關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì),同時也是骨骼肌中不可缺少的支鏈氨基酸[3]。大量研究表明,Leu對刺激蛋白質(zhì)合成、抑制蛋白質(zhì)降解、增強(qiáng)蛋白質(zhì)活性和真核起始因子的有效性等過程具有重要的意義[4-5]。在骨骼肌生長發(fā)育方面,研究發(fā)現(xiàn)Leu可不同程度的促進(jìn)C2C12[6]、鼠衛(wèi)星細(xì)胞[7]、豬成肌細(xì)胞[8]以及綿羊成肌細(xì)胞[9]的增殖與分化。目前,關(guān)于Leu對牛成肌細(xì)胞影響的研究尚未見報道,其對成肌細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。PI3K-AKT通路是一條關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)信號通路,可調(diào)控多種生物學(xué)過程。研究報道,PI3K-AKT通路在骨骼肌的生長發(fā)育中具有重要的調(diào)控作用。如王琴[10]研究發(fā)現(xiàn)睪酮可激活PI3K-AKT通路促進(jìn)雞胚成肌細(xì)胞的增殖;付玉瑩[11]發(fā)現(xiàn),WDR13調(diào)控PI3K-AKT通路促進(jìn)牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的分化。于歡等[12]研究發(fā)現(xiàn),胰島素可通過PI3K-AKT通路增強(qiáng)大鼠骨骼肌成肌細(xì)胞的增殖;也有研究表明,鋅可通過PI3K/AKT促進(jìn)肌源性細(xì)胞的增殖和激活[13]。近年來研究表明,營養(yǎng)素可通過信號通路發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞發(fā)育的作用,因此推測Leu可能通過 PI3K-AKT信號通路調(diào)控牛成肌細(xì)胞的增殖。

本試驗以牛成肌細(xì)胞為研究對象,探究外源性補(bǔ)充Leu對牛成肌細(xì)胞增殖的影響,同時利用RNA-Seq和生物信息學(xué)分析明確Leu對牛成肌細(xì)胞增殖的作用機(jī)理,旨在為Leu對肉牛肌肉發(fā)育的影響及其機(jī)制研究提供重要的理論基礎(chǔ),同時也為Leu在畜牧生產(chǎn)中調(diào)控肉品質(zhì)方面的作用研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗細(xì)胞來源 試驗所用細(xì)胞為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院南方草食動物研究中心分離鑒定并保存的原代牛成肌細(xì)胞。

1.1.2 主要試劑和儀器 DMEM/F12培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶、雙抗(PS)、I型膠原酶購自Gibco公司;不含Leu的DMEM/F12培養(yǎng)液購自博士德生物公司;胎牛血清(FBS)購自PAN公司;Leu購自Solarbio公司;EdU檢測試劑盒購自 Beyotime公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)、PAGE凝膠超快速配制試劑盒購自大連美侖生物公司;LY294002購自MCE公司;反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時熒光定量試劑盒購自TaKaRa公司;抗體PAX7(A12740)購自Abclonal公司;抗體P-AKT(4060)購自CST公司;抗體Tubulin(380628)購自成都正能生物公司;倒置熒光顯微鏡(型號Axio Vert.A1)購自ZEISS公司;實(shí)時熒光定量PCR儀(型號CFX96)購自BIO-RAD公司;多功能成像系統(tǒng)(JS-1070P)購自上海培清科技公司;RNA-Seq服務(wù)由諾禾致源生物有限公司提供。

1.1.3 Leu及完全生長培養(yǎng)液配制 100 mmol·L-1的Leu母液:稱取0.393 g的Leu加入到30 mL的(不含Leu)DMEM/F12培養(yǎng)液中,37 ℃加熱混勻,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

完全培養(yǎng)基:84% DMEM/F12+15%FBS+1%PS,混勻,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 牛成肌細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 于長沙紅星屠宰場采取16月齡健康雄性利木贊牛背最長肌肌肉組織,牛成肌細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定參照王亞寧[14]和王曉剛[15]的操作方法。剛分離出的細(xì)胞于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2 h,此時大量的成纖維細(xì)胞貼壁,將未貼壁細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),重復(fù)此步驟2次,即為細(xì)胞純化過程。每48 h 換液,細(xì)胞密度達(dá)80%左右進(jìn)行傳代和凍存。通過對成肌增殖標(biāo)志因子PAX7的免疫熒光染色鑒定成肌細(xì)胞,參考孫金魁等[16]的方法進(jìn)行操作,利用倒置熒光顯微鏡拍照,檢測染色結(jié)果。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞活力 待細(xì)胞密度達(dá)到80%時,將細(xì)胞用0.25%胰酶消化下來,加入完全培養(yǎng)液重懸后,使用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行計數(shù),以每孔5×103個細(xì)胞接種于96孔板中,加入100 μL完全培養(yǎng)基,待細(xì)胞生長達(dá)到合適的密度(約50%)后,更換含不同濃度(0、0.25、0.50、0.75和1 mmol·L-1)的Leu培養(yǎng)基處理細(xì)胞,每個處理5個重復(fù),置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μL的CCK-8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,利用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定OD值(測定過程應(yīng)避光操作)。

1.2.3 EdU染色法檢測細(xì)胞增殖 將細(xì)胞以5×103個·孔-1接種于96孔板中,設(shè)置對照組(0 mmol·L-1Leu)和最佳濃度Leu組,每組3個生物學(xué)重復(fù),在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,按照EdU試劑盒說明書進(jìn)行操作,在倒置熒光顯微鏡下觀測DAPI標(biāo)記的細(xì)胞總數(shù)與EdU標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù),并進(jìn)行EdU陽性細(xì)胞率的統(tǒng)計分析。

1.2.4 實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR) Trizol法提取細(xì)胞總RNA,利用RNA反轉(zhuǎn)試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,熒光定量試劑盒對目的基因進(jìn)行實(shí)時定量檢測。NCBI primer-BLAST設(shè)計目的基因的引物,所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成,qRT-PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,循環(huán)40次。引物信息序列見表1。

表1 qRT-PCR引物信息序列Table 1 Primer information sequence of qRT-PCR

1.2.5 蛋白免疫印跡(Western blot) 將細(xì)胞接種于6孔板中,每組3個生物學(xué)重復(fù),提取各組的細(xì)胞總蛋白。采用BCA法檢測蛋白濃度,統(tǒng)一濃度后對蛋白進(jìn)行變性。WB試驗檢測目的蛋白的相對表達(dá)量,將變性后的蛋白樣品上于10% SDS-PAGE膠,80 V電泳30 min后,調(diào)電壓至120 V,直至樣品跑到最底部,最后400 mA恒流30 min進(jìn)行快速電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)結(jié)束后用5%的脫脂奶粉封閉液于搖床上封閉2 h,加入對應(yīng)的一抗,4 ℃過夜孵育。次日,加入對應(yīng)的二抗孵育,ECL試劑盒顯色,利用凝膠成像儀顯影拍照,并利用image j軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.2.6 轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序分析 為探究Leu對牛成肌細(xì)胞增殖的作用機(jī)理,以最佳濃度Leu為處理組、0 mmol·L-1Leu為對照組進(jìn)行RNA-Seq,每組3個生物學(xué)重復(fù),加入Trizol刮取細(xì)胞收集于1.5 mL離心管中,低溫保存運(yùn)輸,樣品交于北京諾禾致源生物有限公司進(jìn)行測序分析。主要試驗過程包括:①RNA提取與檢測;②文庫構(gòu)建與質(zhì)檢;③上機(jī)測序;④數(shù)據(jù)質(zhì)控;⑤序列比對到參考基因組;⑥篩選差異基因;⑦差異基因GO和KEGG富集分析。GO-KEGG富集分析通過clusterProfiler (3.8.1)軟件進(jìn)行。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 數(shù)據(jù)分析與作圖使用SPSS 21.0和 GraphPad 8.0軟件。熒光定量PCR以GAPDH為內(nèi)參使用2-ΔΔct計算基因相對表達(dá)量;利用獨(dú)立樣本t檢驗對兩組試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理;利用單因素方差分析對多組試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理,DUNCAN檢驗進(jìn)行多重比較。所有結(jié)果以”平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)”表示。不同字母標(biāo)注表示各組之間具有顯著差異(P<0.05)。

2 結(jié) 果

2.1 牛成肌細(xì)胞的鑒定

通過免疫熒光染色檢測成肌增殖標(biāo)志因子PAX7蛋白的表達(dá)情況,DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色,如圖1顯示,細(xì)胞核外周及胞漿均呈現(xiàn)綠色熒光,表明PAX7呈陽性表達(dá),使用image j合并DAPI和PAX7后發(fā)現(xiàn)每個細(xì)胞核外周均呈現(xiàn)出綠色熒光,表明本試驗成功分離了牛成肌細(xì)胞,且細(xì)胞純度較高,可滿足后續(xù)試驗需求。

圖1 牛成肌細(xì)胞PAX7免疫熒光染色(200×)Fig.1 PAX7 immunofluorescence staining of bovine myoblasts (200×)

2.2 Leu對牛成肌細(xì)胞增殖的影響

由圖2可知,Leu處理后牛成肌細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生改變,處于成肌細(xì)胞增殖期。與對照組(0 mmol·L-1Leu)相比,各處理組均可顯著提高牛成肌細(xì)胞活力(P<0.05),且細(xì)胞活力先隨著Leu濃度的增加呈上升趨勢,后隨著濃度的增加有所下降。其中,0.5 mmol·L-1Leu極顯著高于對照組(P<0.01),因此選擇0.5 mmol·L-1為牛成肌細(xì)胞增殖期的最佳濃度,進(jìn)行后續(xù)試驗。0.5 mmol·L-1Leu處理牛成肌細(xì)胞24 h后,采用EdU染色法檢測牛成肌細(xì)胞的增殖狀態(tài)。如圖3所示,與對照組相比,0.5 mmol·L-1Leu組EdU陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多,其EdU陽性細(xì)胞率顯著增加(P<0.05)。

2.3 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計

測序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)(raw data),通過Fastp軟件過濾掉不合格的序列后得到有效數(shù)據(jù)(clean data),分別進(jìn)行統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)符合過濾條件的reads(PF)大于97%以上,過濾后reads大于Q20、Q30的比例在97%、93%以上,6個樣品的序列數(shù)據(jù)中GC含量約為52%,表明數(shù)據(jù)質(zhì)量符合進(jìn)一步生物信息分析的需求(表2),其中A組表示對照組,B組表示Leu處理組。

A. Leu濃度篩選細(xì)胞光鏡圖(40×);B. CCK-8細(xì)胞活力測定圖:不同字母標(biāo)注表示各組之間具有顯著差異(P<0.05),下同 A. Light microscope image of cells selected by Leu concentration (40 ×); B. Plot of CCK-8 cell viability assay: Different letter marks indicate significant differences between groups (P<0.05), the same as below圖2 Leu對牛成肌細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effect of leucine on the viability of bovine myoblasts

A. EdU染色圖(100×);B. EdU陽性細(xì)胞率統(tǒng)計圖 A. EdU staining diagram(100×); B. Statistical plot of EdU-positive cell rate圖3 Leu處理牛成肌細(xì)胞后EdU增殖檢測Fig.3 EdU proliferation detection of bovine myoblasts treated with leucine

表2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估Table 2 Quality assessment of sequencing data

2.4 Leu處理增殖期牛成肌細(xì)胞的差異基因分析

如圖4所示,經(jīng)Leu處理增殖期牛成肌細(xì)胞24 h后,以|log2foldchange|>0、校正后P值(padj)<0.05作為閾值,共篩選出1 290個差異表達(dá)基因,其中688個基因相對上調(diào)和602個基因相對下調(diào),對差異基因進(jìn)行聚類分析,可觀察到明顯的差異表達(dá)基因分組模式。

2.5 差異表達(dá)基因的功能注釋

為了探究所篩選差異基因的生物學(xué)功能,對差異基因進(jìn)行GO富集分析,按照分子功能(molecular function,MF)、生物過程(biological process,BP)和細(xì)胞組分(cellular component,CC)進(jìn)行GO分類,挑選每個GO分類中padj值最小即富集最顯著的前10個GO條目進(jìn)行展示(圖5)。與對照組相比,Leu組的差異表達(dá)基因參與了多種生物過程,包括肽的代謝合成過程、酰胺的代謝合成過程等;在分子功能類別上,大多數(shù)基因功能與核糖體的結(jié)構(gòu)成分、氧化還原酶活性、NADH脫氫酶活性等相關(guān);在細(xì)胞組分范疇內(nèi),大部分的基因被富集到核糖體、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器等。

A. 差異表達(dá)基因分析的火山圖:紅色點(diǎn)表示上調(diào)基因,綠色點(diǎn)表示下調(diào)基因,藍(lán)色點(diǎn)表示變化不顯著基因。B. 差異表達(dá)基因的聚類分析熱圖:橫坐標(biāo)代表不同樣品,縱坐標(biāo)代表不同樣品對比的差異表達(dá)基因;不同位置色塊代表對應(yīng)位置基因的相對表達(dá)量,紅色代表高表達(dá),綠色代表低表達(dá) A.The volcano plot of differentially expressed genes analysis, with red dots indicating up-regulated genes, green dots indicating down-regulated genes, and blue dots indicating genes with insignificant changes. B. The heat map of the cluster analysis of differentially expressed genes: The abscissa represents different samples, and the ordinate represents the differentially expressed genes compared between different samples; The color blocks at different positions represent the relative expression levels of genes at corresponding positions, red represent high expression, green represent low expression圖4 Leu處理增殖期牛成肌細(xì)胞的差異表達(dá)基因Fig.4 Differentially expressed genes in bovine myoblasts treated with leucine during proliferative phase

圖5 Leu處理增殖期牛成肌細(xì)胞差異基因的GO富集氣泡圖Fig.5 GO enrichment bubble plots of differential genes after leucine treatment of proliferating bovine myoblasts

將篩選到的差異基因映射到KEGG數(shù)據(jù)庫中。Leu組有644個差異表達(dá)基因得到注釋,其中309個上調(diào)基因涉及47條顯著富集通路(padj<0.05),其中將前20條通路以氣泡圖進(jìn)行展示(圖6)。與骨骼肌生長發(fā)育相關(guān)的通路有粘著斑、AMPK、PI3K-AKT、肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、胰島素信號等通路,其中PI3K-AKT信號通路最為富集,包含34個上調(diào)基因。

圖6 Leu處理增殖期牛成肌細(xì)胞差異基因的KEGG富集氣泡圖Fig.6 KEGG enrichment bubble plots of differential genes in bovine myoblasts treated with leucine during proliferative phase

2.6 PI3K-AKT信號通路分析

為了檢驗RNA-Seq數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,隨機(jī)挑選PI3K-AKT信號通路中6個差異表達(dá)基因進(jìn)行熒光定量PCR驗證。結(jié)果如圖7 顯示,Leu可提高牛成肌細(xì)胞增殖過程中PIK3R1、FOXO3、IRS1、RPTOR、MTOR和MET的基因表達(dá)水平,這與RNA-Seq的結(jié)果一致,表明測序結(jié)果是可靠的。為了進(jìn)一步研究Leu對PI3K-AKT信號通路的調(diào)控作用,采用PI3K特異性抑制劑LY294002和Leu共同處理牛成肌細(xì)胞,24 h后收取細(xì)胞總蛋白和總RNA。采用WB檢測PI3K-AKT信號通路中P-AKT和牛成肌細(xì)胞增殖標(biāo)志因子PAX7的蛋白表達(dá)水平,qRT-RCR檢測牛成肌細(xì)胞增殖標(biāo)志因子PAX7、CDK1和PCNA的基因表達(dá)水平。結(jié)果如圖8所示,與對照組相比,P-AKT和PAX7的蛋白水平在Leu組顯著增加(P<0.05),當(dāng)LY294002和Leu共同處理時,P-AKT和PAX7的蛋白水平比Leu單獨(dú)處理顯著降低(P<0.05);在基因表達(dá)水平上,PAX7、CDK1和PCNA的表達(dá)量經(jīng)Leu處理后顯著增加(P<0.05),當(dāng)LY294002和Leu共同處理時,CDK1和PCNA的表達(dá)量比Leu單獨(dú)處理顯著降低(P<0.05),而PAX7表達(dá)量無顯著變化(P>0.05)。以上結(jié)果表明,抑制PI3K-AKT信號通路后,可阻斷Leu對牛成肌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用,這說明Leu可通過調(diào)控PI3K-AKT信號通路促進(jìn)牛成肌細(xì)胞的增殖。

3 討 論

成肌細(xì)胞,又稱肌肉干細(xì)胞。哺乳動物成體骨骼肌是一種相對穩(wěn)定的組織,在正常的生理狀態(tài)下很少發(fā)生細(xì)胞死亡或核裂變[17]。成肌細(xì)胞的增殖在骨骼肌生長發(fā)育中起著重要作用。目前,Leu對牛成肌細(xì)胞增殖的影響尚未見報道。本試驗利用不同濃度Leu處理增殖期牛成肌細(xì)胞后,牛成肌細(xì)胞活力顯著上升,并篩選出0.5 mmol·L-1Leu為最佳濃度,同時,經(jīng)Leu處理后EdU陽性細(xì)胞率顯著提高,表明Leu可促進(jìn)牛成肌細(xì)胞的增殖。

為了進(jìn)一步探究Leu對牛成肌細(xì)胞增殖的作用機(jī)理,進(jìn)行RNA-Seq和生物信息學(xué)分析,旨在篩選出Leu調(diào)控牛成肌細(xì)胞增殖的差異基因和關(guān)鍵信號通路。本試驗共篩選到1 290個差異表達(dá)基因,對所有差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋發(fā)現(xiàn),顯著富集到59個條目,BP共23條,占比37.9%;MF共20條,占比34.5%;CC共16條,占比27.6%,這表明所篩選的差異基因在生物過程中具有重要影響,包括肽的代謝合成過程、酰胺的代謝合成過程等,這可能與Leu促進(jìn)骨骼肌中蛋白質(zhì)的合成有關(guān)。KEGG富集分析中,有644個差異表達(dá)基因得到注釋,其中309個上調(diào)基因涉及47條顯著富集通路,與骨骼肌生長發(fā)育相關(guān)通路有粘著斑、AMPK、PI3K-AKT、肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、胰島素信號等通路。PI3K-AKT通路是細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的信號通路之一,調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)過程,包括細(xì)胞生存、代謝、分化和增殖。大量研究表明,PI3K/AKT通過調(diào)控下游靶蛋白如mTOR[18]、NF-κB[19]、P70S6K[20]的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞增殖。在本試驗中,PI3K-AKT通路是骨骼肌生長發(fā)育相關(guān)通路中最顯著富集的信號通路,包含34個差異表達(dá)基因。這也符合前期的推測,即Leu與PI3K-AKT通路之間可能存在調(diào)控關(guān)系。因此,重點(diǎn)關(guān)注PI3K-AKT信號通路。

A. PI3K-AKT信號通路富集的差異表達(dá)基因聚類圖;B. qRT-PCR驗證隨機(jī)挑選的差異表達(dá)基因 A. The cluster map of differentially expressed genes enriched in PI3K-AKT signaling pathway; B. The randomly selected differentially expressed genes verified by qRT-PCR圖7 PI3K-AKT信號通路中富集的差異表達(dá)基因Fig.7 Differentially expressed genes enriched in PI3K-AKT signaling pathway

A. 添加LY294002后P-AKT和PAX7的蛋白表達(dá)量變化;B. 添加LY294002后PAX7、CDK1和PCNA的基因表達(dá)量變化 A. The protein expression changes of P-AKT and PAX7 after adding LY294002; B. The changes of PAX7, CDK1 and PCNA genes expression after adding LY294002圖8 Leu處理增殖期牛成肌細(xì)胞對PI3K-AKT信號通路的影響Fig.8 Effect of leucine treatment on PI3K-AKT signaling pathway in proliferating bovine myoblasts

為了檢驗RNA-Seq測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,從PI3K-AKT信號通路中隨機(jī)挑選6個差異表達(dá)基因(PIK3R1、FOXO3、IRS1、RPTOR、MTOR和MET)進(jìn)行熒光定量PCR驗證。這6個基因的表達(dá)模式與RNA-Seq的結(jié)果一致。PI3K是一種異源二聚體,由一個含SH2的調(diào)節(jié)亞基(p85)和一個催化亞基(p110)組成。PI3K的激活是由p85結(jié)合活化受體酪氨酸激酶(RTKs)誘導(dǎo)的,當(dāng)二者的結(jié)合能力降低時會抑制PI3K-AKT信號傳導(dǎo)[21]。PIK3R1基因主要編碼PI3K(p85)調(diào)節(jié)亞基,同時也是正常組織中最豐富的亞型,其可調(diào)控細(xì)胞增殖過程[22]。當(dāng)PIK3R1缺失或減少時會影響B(tài)細(xì)胞的發(fā)育和增殖,抑制細(xì)胞粘附,延緩胚體發(fā)育;而沉默PIK3R1可抑制Huh7細(xì)胞的增殖[23]。在肝臟中PIK3R1的缺失會引發(fā)胰島素刺激的PI3K活性顯著降低,導(dǎo)致肝臟糖脂平衡、肝臟大小和功能顯著改變。本試驗中,PIK3R1基因在Leu組中的表達(dá)量高于對照組,并且顯著富集到PI3K-AKT信號通路,這表明牛成肌細(xì)胞增殖與PIK3R1基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)。FOXO3基因是叉頭盒家族(Forkhead box O,FOXO)中的一員,具有廣泛的細(xì)胞功能,包括調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、凋亡、萎縮、DNA修復(fù)、能量代謝和抗氧化應(yīng)激[24]。FOXO3是PI3K-AKT信號通路的重要下游靶點(diǎn),被激活的AKT通過磷酸化FOXO3調(diào)控其從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的定位,使其失活[25]。FOXO3在骨骼肌生長發(fā)育中的作用已經(jīng)被廣泛報道,它在大多數(shù)細(xì)胞中均有表達(dá),是影響雞肌肉生長的候選因子[26]。敲低雞成肌細(xì)胞中FOXO3后,增殖標(biāo)志因子PAX7基因和蛋白的表達(dá)水平均顯著下調(diào),同時分化期的肌管融合率顯著高于未敲低組,這表明FOXO3可促進(jìn)雞成肌細(xì)胞增殖,抑制肌管分化[27]。有研究表明,MyoD是FOXO3的直接靶標(biāo),FOXO3缺失小鼠中MyoD下調(diào)會導(dǎo)致肌肉再生缺陷,這表明FOXO3在調(diào)節(jié)成肌增殖分化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[28]。本試驗中,Leu促進(jìn)牛成肌細(xì)胞的增殖可能與FOXO3的上調(diào)有關(guān)。IRS1又稱作胰島素受體底物1,其在哺乳動物骨骼肌中表達(dá)量最高。在細(xì)胞表面,胰島素樣生長因子(IGF1)與其受體相結(jié)合,以異構(gòu)二聚體的形式磷酸化IRS1,進(jìn)而激活下游的PI3K-AKT和MAPK信號通路,二者均具有促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂和生存的作用[29]。IRS1的總量或磷酸化量減少可導(dǎo)致細(xì)胞對IGF1或胰島素的反應(yīng)性降低,并導(dǎo)致PI3K/AKT和MAPK途徑的激活降低[30]。IGF1/IRS1/PI3K/AKT途徑通過增加蛋白質(zhì)合成和阻斷蛋白質(zhì)降解誘導(dǎo)骨骼肌肥大[31]。張冬杰等[32]研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)C2C12細(xì)胞IRS1基因后,成肌調(diào)節(jié)因子(Myf5、MyoD、MyoG、Myf4)和MYHC的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了顯著上調(diào),這說明IRS1可促進(jìn)肌細(xì)胞的增殖與分化。MTOR和RPTOR共同編碼MTOR蛋白復(fù)合物1(MTORC1),MTORC1主要作用是磷酸化兩個下游底物核糖體蛋白S6K1和4E-BP1調(diào)控蛋白質(zhì)合成,以促進(jìn)骨骼肌生長。已有研究表明,Leu可通過激活mTORC1促進(jìn)骨骼肌中蛋白質(zhì)的合成[33]。在本試驗中,經(jīng)Leu處理后,牛成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本MTOR和RPTOR表達(dá)量都顯著提高。

蛋白激酶B(AKT)是PI3K-AKT信號通路的另一個關(guān)鍵因子,其對于細(xì)胞新陳代謝、增殖、存活和生長具有重要意義[34]。為了進(jìn)一步明確Leu與PI3K-AKT信號通路的調(diào)控關(guān)系,本研究先用PI3K特異性抑制劑LY294002與Leu分別單獨(dú)處理增殖期的牛成肌細(xì)胞,然后檢測成肌細(xì)胞增殖期標(biāo)志因子PAX7、PCNA和CDK1的基因表達(dá)水平,以及PI3K-AKT信號通路中P-AKT和PAX7蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示,抑制PI3K-AKT信號通路后,降低了PAX7、PCNA和CDK1的基因表達(dá)水平,同時P-AKT和PAX7蛋白表達(dá)水平也有所降低,這表明抑制該通路后牛成肌細(xì)胞的增殖受到抑制;添加外源性Leu后,可提高成肌增殖期標(biāo)志因子的基因表達(dá)水平,同時P-AKT和PAX7蛋白表達(dá)水平也有所提升,這表明Leu可促進(jìn)牛成肌細(xì)胞的增殖;當(dāng)抑制劑LY294002與Leu共同處理時,與單獨(dú)Leu組相比,PAX7、PCNA、CDK1基因的表達(dá)均下調(diào),P-AKT和PAX7蛋白表達(dá)水平降低,這表明Leu對牛成肌細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用可被LY294002阻斷。本試驗結(jié)果表明Leu通過調(diào)控PI3K-AKT信號通路促進(jìn)牛成肌細(xì)胞的增殖。

4 結(jié) 論

外源性添加Leu可促進(jìn)牛成肌細(xì)胞的增殖,且0.5 mmol·L-1為增殖期的最佳濃度。添加 PI3K 抑制劑 LY294002 后阻斷了亮氨酸對牛成肌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。以上結(jié)果表明,亮氨酸可通過PI3K-AKT信號通路促進(jìn)牛成肌細(xì)胞的增殖。