北京黑豬GREB1L和MIB1基因多態性與肋骨數及胴體性狀的關聯分析

牛乃琪,趙潤澤,宗文成,劉先策,劉 海,石國華,井西濤*,張龍超*

(1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所,北京 100193;2.北京黑六牧業科技有限公司,北京 102211)

脊椎動物的脊椎經歷復雜而有序的發育過程,通過體節發育形成。而軸向骨骼是脊椎動物體內體節發育的典型。主要分為頸部、軀干和尾部,軀干主要由脊椎和肋骨組成[1-3]。這些都源自一個重復的組織結構——體節。體節是受分割時鐘控制(分割時鐘會產生一系列周期性的信號,這些信號會逐漸擴散和傳播到胚胎中不同部位的細胞。這些信號會調控細胞的基因表達和細胞分化),在脊索兩側按順序成對形成的中胚層組織塊狀結構,是脊椎軸向骨骼形成必不可少的瞬時元件[4-5]。體節在機體發育中發揮著重要的作用,受到多種信號通路和轉錄因子(Notch、FGF、Wnt、RA、BMP、Hox、brachyury (T) 和Tbx6)相互作用的網絡調控[6-10],信號分子必須在正確的位置和正確的時間以恰當的方式分布在胚胎中,調控不同的細胞命運和協調模式。體節的形成是動物胚胎發育的一個組成部分,它是脊椎動物軸向骨骼正確形成的基礎元件,軸向骨骼是脊椎動物脊柱的基礎。最終形成具有復雜特征的枕骨、頸椎、胸椎、腰椎、薦椎和尾椎[11-12]。每個域中的椎骨數量在物種內是固定的,在物種之間各不相同,從而產生了物種特定的軸向公式[13]。而豬是為數不多的胸腰椎數可變的經濟動物之一[14]。研究表明豬胸腰椎數每增加一節,會使其胴體長增加80 mm[15],胴體重[16]也會隨之增加。

由于豬的肋骨數有著重要的經濟價值,因此,對于肋骨數的研究也持續了很多年,篩選到了一些候選基因,如:VRTN、NR6A1、PROX2、LTBP2、Hoxc8、PLAG1、LCORL基因等。而前期本團隊基于北京黑豬群體,通過GWAS在豬6號染色體(SSC6)上篩選到了與肋骨數相關的兩個基因GREB1L和MIB1[17]。而北京黑豬(Beijing black pig)是中國典型的復合型黑豬品種,是1960年代由巴克夏、大白和中國地方豬種雜交形成的一個培育豬種[18],它完美地結合了中國地方豬品種肉質優良、抗病能力強、繁殖性能好等特點和商品豬品種生長速度快、瘦肉率高、飼料轉化率高等特點。在北方豬肉市場中占有重要地位,但是北京黑豬在GREB1L和MIB1基因的多態性與性狀的關聯分析尚未見報道。本研究對GREB1L和MIB1基因所有外顯子區進行PCR及測序檢測突變位點并將其與表型進行關聯分析,以期探索影響性狀變異的候選基因功能位點,為性狀變異遺傳機理的闡釋奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗群體

本試驗收集317頭北京黑豬個體,均飼養在北京黑六牧業科技有限公司,飼養過程和管理方式均一致,在豬飼養至215日齡時,健康狀況均良好。將317頭豬提前運輸至北京二商集團有限責任公司進行屠宰,在屠宰中記錄耳號并采集耳組織樣本,同時一一對應并記錄肋骨數和胴體性狀(胴體重、胴體長[19]、胴體斜長和胴體直長[20-21])。

1.2 DNA提取及檢測

本試驗使用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒的提取步驟進行耳組織樣品DNA提取,使用IMPLEN超微量分光光度計進行DNA濃度檢測(ng·μL-1),同時用2%瓊脂糖凝膠進行DNA質量檢測,檢測合格的DNA樣品以備后期突變位點篩選試驗的使用。

1.3 引物設計及合成

本試驗的引物均使用Primer Premier 5.0軟件設計,使用Ensembl數據庫中Sscrofa11.1參考基因組,引物序列均由北京六合華大基因科技有限公司合成。本研究設計了2個基因GREB1L(ENSSSC-G00000003699)、MIB1 (ENSSSCG00000025478),共64對引物,其中在本群體中檢測到SNPs的5對引物見表1。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

1.4 聚合酶鏈式反應(PCR)

本試驗使用諾唯贊(Code: P505-d1,Vazyme)的高保真酶進行PCR,本試驗對317頭北京黑豬個體采用25 μL反應體系(2×Phanta Max Buffer 12.5 μL,0.5 μL 聚合酶,0.5 μL dNTP,1 μL 上游引物,1 μL 下游引物,8.5 μL 無菌水,1 μL 模板)進行PCR(ABI, Singapore),程序如下:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,57～63 ℃退火30 s,72 ℃延伸45～60 s,35個循環;72 ℃延伸2 min。PCR產物通過切膠回收單一條帶在北京六合華大基因科技有限公司平臺進行雙向Sanger測序。

1.5 基因分型及數據統計分析

本試驗使用DNAStar中的SeqMan進行測序結果的比對和基因分型,使用Microsoft Excel 2016將分型后的結果進行基因型頻率、等位基因頻率的統計。將分型的結果進行基因型和表型個體間的一一對應,并使用SAS軟件中的Duncan’s多重檢驗進行關聯分析(P<0.05),動物模型:Y=μ+基因型+e,其中Y為表型值,μ為均值,e為隨機誤差。數據結果使用“平均值±標準誤”表示,P<0.05判定為差異顯著。

2 結 果

2.1 北京黑豬肋骨數和胴體性狀的表型統計

317頭北京黑豬個體的表型值(肋骨數和胴體性狀)見表2,肋骨數的均值為14.88節,變異系數為3.56%(變異系數=標準差/均值);胴體長的均值為98.28 cm,變異系數為4.84%;胴體直長的均值為90.11 cm,變異系數為4.45%;胴體斜長的均值為76.24 cm,變異系數為4.30%;胴體重的均值為64.30 kg,變異系數為11.35%。

表2 肋骨數和胴體性狀的表型值統計Table 2 Statistics of phenotypic values of the rib number and carcass traits

2.2 北京黑豬GREB1L和MIB1基因的多態性檢測及基因型頻率和等位基因頻率分析

本試驗通過對GREB1L和MIB1基因的mRNA序列進行變異位點檢測共發現6個SNPs(表3),在GREB1L基因中檢測到3個外顯子區的突變且均為同義突變,MIB1基因中也檢測到3個突變,其中2個是同義突變,1個是離外顯子15僅有4 bp之隔的一個內含子區的可變剪切突變(表3)。這6個突變位點的等位基因頻率變化范圍為5%～95%,其基因型頻率變化范圍為1%～90%。

表3 北京黑豬中GREB1L和MIB1的基因型頻率及等位基因頻率統計Table 3 Statistics of genotype and allele frequencies of GREB1L and MIB1 in Beijing black pigs

2.3 北京黑豬GREB1L和MIB1基因的6個SNPs與肋骨數和胴體性狀的關聯分析

本試驗將GREB1L和MIB1基因通過PCR擴增及變異檢測篩選到6個SNPs,它們與肋骨數和胴體性狀的關聯分析結果見表4。GREB1L基因上的3個同義突變6∶106574972 G>A、6∶106648540 C>T、6∶106648558 A>G與性狀關聯均不顯著;MIB1基因上的1個同義突變6∶106936590 C>T與胴體長顯著相關,其中TT基因型個體的胴體長表現出明顯優勢,與其他性狀關聯均不顯著;而內含子15～16的6∶107016475 A>G可變剪切突變與肋骨數顯著相關,且AA型個體的肋骨數表現出明顯優勢,與其他性狀均無顯著關聯;第三個同義突變6∶107028660 G>A與肋骨數和胴體性狀均無顯著相關。

3 討 論

我國作為養豬業和豬肉消費大國,豬一直是畜禽遺傳研究者關注和研究的重要畜種之一,并且豬是一個與人類相似性較高,容易獲得的優選模型。豬的脊椎包括頸椎、胸椎、腰椎、薦椎及尾椎共五部分,通常頸椎數為7節,薦椎數為4節,然而胸椎和腰椎總數存在極大的變異。豬肋骨數的變異與胴體長和產肉量之間存在關聯。具有偏多肋骨數的個體往往具有較大的體型和較高的產肉性能。然而,傳統育種方法很難改善豬的肋骨數。因此,分子標記輔助選擇成為一種有潛力的方法,可以通過分析個體的遺傳組成來選育具有期望肋骨數的豬種。這種方法可以快速、準確地提高豬種的肋骨數,從而在養豬生產中帶來重大的經濟效益。豬的肋骨數是一個高遺傳力的表型性狀,一般遺傳力估計為0.60～0.62[22]。研究者最先采用全基因組掃描方法對梅山母豬與杜洛克公豬的F2群體的180個微衛星進行研究,最終將影響豬脊椎數變異的QTL定位在豬1號(SSC1)和7號染色體(SSC7)上[23]。后來在SSC7上發現了與椎脊椎發育相關的基因,被稱為vertnin (VRTN)[24],它被認為是與椎骨數變化相關的候選基因,且在脊椎形成過程中是一個關鍵的轉錄因子[25]。在SSC1上,Mikawa等[26]發現生殖細胞核因子(NR6A1)c.748C>T發生堿基替換,導致了192位密碼子脯氨酸被取代為亮氨酸,并將其作為影響椎骨數變異的候選基因。本團隊對豬胸腰椎數和胸椎數(肋骨數)也展開了大量的研究,先后在SSC7[27],SSC12[28]和SSC6[17]均發現了與其變異顯著相關的候選基因和QTL。

表4 GREB1L和MIB1基因6個SNPs與肋骨數和胴體性狀的關聯分析Table 4 Association of 6 SNPs of GREB1L and MIB1 genes with rib number and carcass traits

GREB1L基因是GREB1(生長調節雌激素受體結合1)的重要旁系同源物,在胚胎后腎和生殖器發育中起主要作用,并已被報道為維甲酸(RA)信號傳導的靶點。之前的研究表明,GREB1L基因與雙側腎發育不全、內耳畸形和耳聾有關[29-31]。并與RA(維甲酸)信號通路[30]和Wnt信號通路[32]相關。在脊椎動物胚胎的近軸中胚層內,RA、Wnt和FGF信號通路的活性呈現分級分布。具體而言,Wnt和FGF信號在后部未分段的近軸中胚層中顯示出最高的活性。而RA信號則在體節中建立了具有最高活性的反梯度作用。這意味著在胚胎發育過程中,這些信號的活性在近軸中胚層內呈現一定的空間分布模式,其中Wnt和FGF信號在胚胎的后部未分段區域活躍,而RA信號在體節區域活躍,并且其活性隨著體節的增加而逐漸增強。這些信號的相互作用和調控有助于體節的形成,體節在脊椎動物形成脊椎的過程中起著重要作用[33]。雖然GREB1L基因在豬肋骨數變異方面的研究還相對較少,但是基于其在胚胎發育中的重要作用,可以將其定義為候選基因。進一步的研究可以幫助驗證GREB1L基因在豬肋骨數變異中的確切作用機制。

MIB1是MIB E3泛素蛋白連接酶1,是一種大的多結構域環狀 E3連接酶[34]。MIB被認為是Notch發育的重要調節因子[35]。MIB1 在 Notch 信號通路中的激活作用十分廣泛,可以直接與各種 Notch配體(jagged 1、jagged 2、Dll1、Dll3 和 Dll4)結合促進 Notch 配體泛素化和內吞作用[36]。在MIB1 敲除小鼠中,Notch 信號通路相應表現出缺陷,Notch 信號減少,表現為 Notch 活性形式 Notch 胞內結構域(NICD)的生成受到抑制、下游靶基因表達降低以及體節發生、心臟發生等受損[36]。在斑馬魚中,MIB1 突變體也表現出類似的現象[37]。除此之外,MIB1 在 Wnt 信號通路中也發揮重要作用,主要是通過與 RYK 結合形成復合物來激活Wnt/β-catenin 信號通路[38]。之后有研究顯示,MIB1 還與 Wnt 通路中的其他成分 Catenin 家族成員(α、β、delta1 和 delta2)、幾個 MAP/微管親和力調節激酶(Mark1、Mark 3和Mark 4)和酪蛋白激酶家族成員等存在相互作用。MIB1 在 Notch 信號通路和 Wnt 信號通路之間的潛在連接因子是內吞作用[39]。因此,將MIB1基因定義為候選基因,但還需進一步驗證它的作用機制。

對于本試驗的GREB1L和MIB1基因也在別的方向上進行了多態性的探索與研究。GREB1L基因作為一個與腎發育相關的基因,它的突變會引起腎發育不良。研究發現GREB1L基因的一個錯義突變c.4507C>T會導致患者單側缺腎[40]。研究發現,MIB1基因變異與左心室心肌致密化不全相關,但攜帶MIB1基因中c.376C>T變異的患者s31表現為典型的左心室心律失常性心肌病,伴有廣泛的纖維-脂肪替代左心室游離壁,左心室增大但無小梁形成[41-42]。本試驗主要是對兩個基因的多態性進行探索,在群體中未發現GREB1L基因中突變位點與性狀的顯著相關。MIB1基因外顯子3中的同義突變6∶106936590 C>T位點與胴體長性狀顯著相關;在內含子15～16的6∶107016475 A>G可變剪切突變與肋骨數顯著相關。但是,在位點鑒定方面的結果還需要進一步進行試驗驗證。雖然本研究已經進行了嚴格的數據分析和統計處理,但為了確保研究結果的準確性和可靠性,需要進行更多的試驗驗證,以確認所鑒定的顯著位點在肋骨數和胴體性狀中的真實功能和作用機制。

4 結 論

在北京黑豬群體中,MIB1基因上的6∶106936590 C>T位點與胴體長性狀顯著相關,內含子15～16的6∶107016475 A>G可變剪切突變與肋骨數顯著相關。這兩個位點對于豬肋骨數和胴體長性狀的分子標記輔助選育工作提供了基礎。