降鈣素基因相關肽在胃潰瘍模型小鼠穴位敏化中的作用研究

楊雪,鄭璇,袁偉,,吳宇蔚,,刁志君,薛思夢,喬海法,

(1.陜西中醫藥大學,咸陽 712046;2.陜西省針藥結合重點實驗室,咸陽 712046;3.陜西省中醫藥管理局,咸陽 712046)

穴位,是臟腑-經絡之氣輸布于體表的特殊部位。其可根據機體的病理狀態[1],發生從“靜息態”向“激活態”的可塑性轉變,即穴位敏化[2-3]。研究[4]表明,降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)在神經源性炎癥和傷害性痛覺敏化過程中發揮重要作用。CGRP 是由37 個氨基酸組成的肽類神經遞質,主要表達在外周神經Aδ和C 纖維,大多數內臟感覺傳入纖維以及脊髓后角的淺層[5],其可通過影響外周和中樞敏化過程來調節穴位敏化的發生[6-8]。在外周神經系統中,背根神經節(dorsal root ganglion,DRG)神經元是合成CGRP 的主要部位[9]。這些神經元可同時接收來自皮膚、肌肉等外周體表和內臟組織傳遞的傷害性信息,并在DRG 神經元內進行信息整合,再傳遞到脊髓背角和更高級中樞,實現外周信號向中樞的傳遞[10]。當內臟病變時,內臟感覺傳導纖維將痛覺信息傳遞給DRG 神經元,使之興奮性異常升高,促使外周末梢釋放CGRP、P 物質和炎癥因子等,介導了痛覺信號的傳導敏化和體表神經源性炎性反應的發生[11],提示CGRP是參與臟腑相關體表神經源性炎性反應的主要物質。急性胃炎模型體表敏化點的CGRP 表達增加[8],CGRP 是否介導了慢性胃潰瘍介導的體表穴位敏化發生卻并不清楚。因此,本研究通過使用冰乙酸建立小鼠胃潰瘍模型,觀察胃部損傷小鼠體表穴位敏化的分布和規律,以及體表敏化點、DRG 神經元和脊髓節段CGRP 的蛋白和熒光蛋白陽性表達情況，有助于從分子生物學的角度闡明CGRP 與胃潰瘍模型小鼠體表敏化的關系、效應及機制,為解釋穴位敏化的生物學機制提供實驗證據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選用清潔級健康雄性C57BL/6 小鼠30 只,體質量(22±3)g,所有動物均購于西安交通大學醫學實驗中心,許可證號為SCXK(陜)2018-001。在陜西中醫藥大學針藥結合創新研究中心動物房飼養。動物房溫度22～24 ℃,濕度50%～60%,12 h 晝夜交替照明,小鼠自由飲食、飲水。小鼠適應性飼養1 周后,隨機將小鼠分為對照組、模型組兩組,每組15 只。

1.2 主要試劑與儀器

伊文思藍(evans blue,EB)染色液、蘇木素-伊紅染色液(hematoxylin-eosin staining,HE)(西安灝洋生物有限公司),抗CGRP 抗體(D5R8F,美國CST 公司),β-actin(AC026,武漢愛博泰克生物科技有限公司);山羊抗兔免疫球蛋白 G(H＋L),辣根過氧化物酶(EK020,西安壯志生物科技有限公司);Alexa Fluor 647 驢抗兔熒光二抗(34213ES60,上海翊圣生物科技有限公司);冰凍切片機(美國Thermo Fisher),萊卡顯微鏡(德國Leica),電泳儀、化學發光成像系統(美國BioRad);足底觸覺測痛儀(意大利Ugo Basile),足底熱痛儀(意大利Ugo Basile),電子von Frey(美國IITC)。

1.3 模型制備

小鼠術前12 h 禁食不禁水,異氟烷麻醉后于腹部切開皮膚暴露胃,以0.05 mL冰乙酸溶液于胃小彎近幽門處注射到胃壁肌層近黏膜下層,胃壁即出現圓形隆起并逐漸變為乳白色,直徑約為5 mm。逐層縫合腹壁再進行碘伏消毒,構建小鼠胃潰瘍模型[12]。對照組采用同法注射相同劑量生理鹽水溶液。模型鑒定標準為可見小鼠精神萎靡,行動緩慢,身體蜷縮,拉柏油樣便;并對小鼠胃部組織做HE 染色[13]。

1.4 胃潰瘍模型小鼠體表敏化部位檢測

造模前1 d將小鼠全身輕柔脫毛,造模完成后尾靜脈注射0.5% EB 溶液(0.1 mL/10 g)。注射2 h 后觀察小鼠體表EB 滲出點[14],并記錄敏化點的數量和分布位置,在小鼠體表圖中標記。

1.5 脊髓神經節段參與慢性胃潰瘍引起體表痛敏行為學實驗

為研究慢性胃潰瘍是否可以引起脊髓節段的體表牽涉痛敏,通過體表機械壓力痛[15]、足底機械痛、熱痛來檢測小鼠對照組和模型組的壓痛閾變化[16]。機械壓力痛檢測時先用記號筆標記小鼠T1～T13脊髓節段,使用測痛儀按壓各組小鼠脊髓節段處的敏化點;足底機械痛檢測時用測痛儀在小鼠左右后足按壓;熱痛檢測時將光源放置在小鼠左右后足下方。分別于造模后1、3、6 d 進行測試,并觀察小鼠有明顯躲避樣行為時記錄壓痛閾值,每個敏化點或后足部位測3 次取平均值。

1.6 小鼠胃組織病理學觀察

每組隨機抽取5 只小鼠在術后6 d 取材,0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛溶液灌流。取胃組織放入4%多聚甲醛后固定 24 h,OCT 包埋組織,常規冰凍切片(厚度16 μm),HE 染色。HE 染色步驟為先將切好的組織的載玻片架子置于1 000 mL 的燒杯中,用自來水沖洗干凈,滴加蘇木素1 min,純水沖洗干凈,接著滴加伊紅2 min,震蕩后沖洗干凈,75%乙醇震蕩1 min,85%乙醇震蕩 1 min,95%乙醇震蕩 1 min,無水乙醇浸泡2×2 min,二甲苯固化3×2 min,最后中性樹膠封片,在顯微鏡下觀察胃組織形態。

1.7 蛋白質印跡(Western blot,Wb)法觀察穴位敏化后脊髓、DRG 及皮膚中CGRP 蛋白相對表達量

造模后6 d,隨機抽取每組5 只小鼠麻醉,背部剃毛,剪開小鼠皮膚和肌肉,暴露出胸椎段,剪除棘突和椎板,在冰上操作,迅速剝離T9～T11脊髓和DRG,并取皮膚,分別加入RIPA裂解液,用BCA法蛋白定量,20 ℃保存蛋白樣本備用。選用15% SDS-PAGE 凝膠電泳分離,然后將蛋白質轉移到PVDF 膜上;用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h;一抗(CGRP1:1 000,β-actin1:1 000)4 ℃過夜孵育;二抗(1:20 000)室溫孵育2 h;使用ECL 顯影。采用Image J 讀取灰度值進行分析測定。

1.8 免疫熒光染色法觀察穴位敏化后脊髓、DRG 及皮膚中CGRP 陽性表達

造模后6 d,各組剩余5 只小鼠麻醉,0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛灌流。取脊髓T9～T11節段、DRG 及皮膚組織放入4%多聚甲醛后固定24 h,用OCT 包埋,常規冰凍切片(厚度16 μm)。驢血清封閉2 h,CGRP 抗體(1:500)4 ℃過夜,二抗(1:500)室溫孵育2 h,抗熒光衰減封片劑(含DAPI)封片,熒光顯微鏡下拍照,Image J 進行整理和分析視野陽性細胞熒光強度。

1.9 統計學方法

采用GraphPad Prism 9 和SPSS25.0 統計軟件進行分析。符合正態分布的計量資料用均數±標準差表示,比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠胃組織形態學比較

HE 染色后對照組小鼠胃組織比較完整,病理切片未見明顯異常,而模型組小鼠胃組織水腫,炎性細胞增多,表面上皮分界明顯加重,上皮細胞丟失。結果表明慢性胃潰瘍模型小鼠造模成功。詳見圖1。

圖1 兩組小鼠胃組織形態學比較(×40)

2.2 兩組小鼠體表穴位敏化結果比較

對照組小鼠體表EB 滲出點分布稀疏分散,無主要集中區域。而模型組小鼠EB 滲出點分布涉及脊髓T1～T13節段體表支配區域,其中以T9～T11節段體表支配區域中膽俞、脾俞、胃俞和脊中穴位分布最為集中。提示,小鼠體表EB 滲出點數目與胃部炎性程度成正比,且其分布規律與內臟組織損傷部位所對應的體表支配區域一致。詳見圖2。

圖2 兩組小鼠體表滲出點分布比較(n＝10)

2.3 兩組小鼠體表痛敏行為學實驗結果比較

與對照組比較,模型組小鼠在造模后6 d的體表敏化區機械痛閾值、后足機械痛閾值和熱痛閾值均顯著降低(P＜0.01)。提示慢性胃潰瘍小鼠會出現牽涉性痛敏化現象,其脊髓T9～T11節段體表支配區域痛覺閾值降低、興奮性增強、感受野擴大,可能與胃部損傷引起的體表神經源性炎性反應有關。詳見圖3。

圖3 兩組小鼠體表痛敏行為學實驗結果比較(±s,n＝10)

2.4 兩組小鼠脊髓中CGRP蛋白含量和CGRP熒光蛋白陽性表達比較

與對照組比較,模型組小鼠脊髓T9～T11節段中的CGRP 蛋白含量顯著升高(P＜0.01)。免疫熒光結果顯示,與對照組比較,模型組小鼠脊髓中的CGRP 熒光蛋白陽性表達也顯著高于對照組(P＜0.01)。詳見圖4。

圖4 兩組小鼠脊髓中CGRP 蛋白含量和CGRP 熒光蛋白陽性表達比較(±s,n＝5)

2.5 兩組小鼠DRG 中CGRP 蛋白含量和CGRP 熒光陽性表達比較

Wb 結果顯示,與對照組比較,模型組小鼠DRG 中的CGRP 蛋白含量顯著升高(P＜0.01)。免疫熒光結果顯示,與對照組比較,模型組小鼠DRG中的CGRP熒光蛋白陽性表達顯著高于對照組(P＜0.01)。詳見圖5。

圖5 兩組小鼠DRG 中CGRP 蛋白含量和CGRP 熒光蛋白陽性表達比較(±s,n＝5)

2.6 兩組小鼠皮膚中CGRP蛋白含量和CGRP熒光陽性表達比較

Wb 結果顯示,與對照組比較,模型組小鼠皮膚中的CGRP 蛋白含量顯著升高(P＜0.01)。免疫熒光結果顯示,與對照組比較,模型組小鼠皮膚中的CGRP 熒光蛋白陽性表達也顯著高于對照組(P＜0.01)。詳見圖6。

圖6 兩組小鼠皮膚中CGRP 蛋白含量和CGRP 熒光蛋白陽性表達比較(±s,n＝5)

3 討論

胃潰瘍是常見的消化系統疾病之一[17],臨床多表現為節律性反復發作的胃脘部疼痛。本研究通過在小鼠胃壁注射冰乙酸,誘使其胃部組織水腫,炎性細胞增多,表面上皮分界明顯加重,上皮細胞丟失,構建了符合胃潰瘍典型病理特征的動物模型。研究結果表明,小鼠胃部損傷后,可誘導其內臟所對應的體表支配區域產生神經源性炎性反應,使敏化點顯著增多,痛覺閾值下降,并使其脊髓T9～T11節段、DRG 神經元和體表敏化區域中的CGRP 陽性表達和蛋白水平顯著升高。提示,外周和脊髓的CGRP 表達改變,可能是內臟損傷病理狀態下介導穴位敏化的重要分子基礎。

體表-內臟反射具有確切的節段性構筑特性[18]。當內臟病變時,體表相應部位會出現節段性的陽性反應,如結節、凹陷、瘀點、皮疹等[19-20]。在動物實驗中,通過尾靜脈注射EB染料,觀察到內臟疾病引起EB在體表滲出[21-23],滲出點呈現神經節段分布并與穴位具有規律性聯系,與敏化穴位穴區的血管通透性增加相關[24],這些結果均提示穴位與內臟疾病引起的體表敏化存在高度相關性,即穴位的敏化現象[25]。EB 滲出點的出現表明內臟病變時,穴位處體表局部血管通透性改變,導致神經源性炎性反應[6],這一反應在外周主要是由于C類多型性傷害性感受器的激活引起的,導致局部致痛物質的釋放,引起周圍血管擴張,進一步引起傷害性感受器敏感性增強,局部出現痛敏點或者痛敏區域。這些痛敏區域和穴位的分布密切相關[26]。同時,EB 滲出的多少可代表C 類纖維末梢的密度[27],穴位和非穴位區的EB滲出點都有C類纖維傷害性反應引起的局部炎性反應,但可能穴位處C 類纖維末梢更加集中,能夠激發較多的C 類纖維機械刺激感受器或溫度感受器[28],因此敏化狀態下穴位較非穴區能夠更好地引起機體的反應及治療效應。動物研究表明,腸炎大鼠的EB 滲出點主要分布在T12～L2節段[29];心肌缺血大鼠的EB 滲出點出現在其左側背部,并在脊髓T1～T5節段體表支配區域發生規律性的牽涉性的“敏化”反應[30]。急性胃黏膜損傷大鼠的EB 滲出點主要集中在背部T6～T11節段[6,31],而刺激大鼠背部相應的體表皮膚可引起同節段支配的十二指腸和腸道血管運動變化[18]。可見,體表穴位與內臟器官之間具有節段性分布的密切聯系,這些敏化反應點的功能狀態可能與“穴位”的形成有關。本研究結果顯示,胃潰瘍小鼠脊髓T9～T11節段體表支配區域出現多個EB 滲出點,而這一敏化區又包括膽俞、脾俞、胃俞、脊中穴等與治療胃部疾病相關的功能穴位。臨床研究表明,壓痛反應是腧穴敏化的一種表現,如膝關節骨關節炎患者在鶴頂、梁丘及曲泉穴壓痛敏感[32];胃病可在胃俞等穴位觸及結節或條索狀改變,按壓這些穴位均可出現疼痛感[33]。在本研究中,與胃部損傷前相較,小鼠脊髓T9～T11節段體表支配區域及相應穴位敏化點的痛閾值顯著降低,興奮性水平顯著升高。說明模型小鼠的胃部炎性反應,可能通過神經源性炎性反應反映在體表相應部位[34-35],并通過體表敏化點興奮性閾值改變使穴位向激活態發生功能遷移。

大量研究[36]表明,穴位敏化可能與炎性物質的釋放有關。石宏等[37]認為穴位敏化可能是由于內臟病變通過軸突反射影響體表,導致體表發生神經源性炎性反應,引起局部致炎致痛物質增高,促進血管擴張和滲出增加,進而出現痛覺敏化。CGRP 作為感覺神經末梢激活導致神經源性擴張反應的主要介質,是介導病理狀態下傷害感受器敏化的關鍵靶分子[38-39]。當內臟組織損傷時,CGRP 會導致傷害性神經元敏化,刺激肥大細胞活化[40-41],作用于炎癥細胞后釋放大量炎性因子,引起神經源性炎癥反應,提高致痛效應,引起血管擴張,導致血漿蛋白滲出,介導體表穴位敏化的發生。如大鼠足跖部重復微量注入CGRP 可誘發外周敏化,使大鼠傷害性機械刺激的反應閾值明顯減小[42]。足底注入CGRP受體拮抗劑則可阻斷外周神經損傷大鼠痛覺超敏的行為學表征,減輕辣椒素誘發的機械性誘發痛及痛覺過敏[43]。在脊髓水平鞘內注射CGRP 的拮抗劑h-CGRP8-37能夠降低多因素誘發的內臟痛覺過敏[44]。因此,脊髓水平CGRP 的釋放是傷害性感受信息傳遞和調控過程中一個重要環節[45],抑制脊髓水平CGRP 的表達或阻止其發揮作用可以降低機體的痛敏反應。本研究觀察到胃潰瘍小鼠脊髓T9～T11節段對應體表區域的CGRP 蛋白和熒光蛋白陽性表達升高,說明CGRP 的表達改變可能參與了胃潰瘍體表穴位微理化環境的狀態改變,而這可能與軀體-內臟牽涉痛的會聚易化有關。

牽涉痛的會聚易化理論認為,病變器官和出現牽涉痛的皮膚受到相同的脊神經后根傳入纖維支配,從而使同時支配體表和內臟的脊髓后角會聚神經元反應閾值降低、異常放電活動增加、體表感受野擴大等現象[18]。在這一過程中,內臟組織損傷可導致神經生長因子釋放并與TrkA受體結合逆行轉運至DRG神經元胞體,通過胞內信號級聯,使DRG中的CGRP上調,并提高脊髓后角的CGRP 水平[46-47]。因而,盡管CGRP 在DRG 中產生,但最高濃度的CGRP 卻出現在脊髓后角的淺層。與此相一致的,在本研究中也觀察到脊髓及DRG 中的CGPR 蛋白和陽性表達顯著升高,說明了CGRP 參與調節內臟損傷動物模型的中樞敏化過程。

綜上,本研究結果提示,慢性胃潰瘍模型在胃部對應節段的脊髓和DRG中CGRP表達顯著提升可能是導致體表敏化的重要分子基礎。本研究從分子生物學角度為闡明CGRP 在胃潰瘍小鼠穴位敏化中的作用提供了可靠的實驗依據,豐富了“穴位敏化”理論的科學內涵。