基于網絡藥理學探討藤梨根治療結直腸癌的作用機制※

吳 賽 王馨璐 陸瑋蘭 汪海慧 李海濤 閆國良△

(1.上海中醫藥大學2019級碩士研究生,上海 201203;2.上海中醫藥大學附屬市中醫醫院急診科,上海 200071;3.上海中醫藥大學2020級碩士研究生,上海 201203)

結直腸癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一,其中41%的結直腸癌發生在近端結腸,22%發生在遠端結腸,28%發生在直腸[1]。據統計顯示,全世界每年有近90萬人因結直腸癌死亡,人口老齡化、吸煙、肥胖、久坐不動及不健康飲食習慣等因素均可增加罹患結直腸癌的風險[2-3]。近年來,我國結直腸癌的發病率和死亡率逐年攀升,并有年輕化的趨勢[4]。隨著現代醫療技術的發展,對結直腸癌的認識也逐漸深入,除了傳統的手術、放療、化療等治療方法外,靶向治療、免疫治療、中醫藥治療等治療手段也日益成熟,其中中醫藥作為重要的輔助治療手段,在惡性腫瘤的治療中發揮著越來越重要的作用[5]。藤梨根又名獼猴桃根,具有清熱解毒、健胃利濕消腫的功效,臨床上多用于腫瘤的輔助治療,如食管癌、肺癌、胃癌、結直腸癌等,具有明顯的抗癌作用[6]。為了進一步研究藤梨根的抗癌作用,本文以網絡藥理學研究方法探討藤梨根治療結直腸癌相關靶點及作用機制,以期促進中醫藥在結直腸癌治療中的應用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 藥物活性成分的篩選及靶點的獲取 首先從中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)(http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/)中以“藤梨根”“獼猴桃根”為關鍵字獲取藥物活性成分,通過生物利用度(OB)和類藥性(DL)兩個指標,以OB>30%和DL>0.18為限定條件,篩選出主要活性成分,再通過中醫藥整合藥理學研究平臺(TCMIP)(http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/)篩選出藥物活性成分對應的作用靶點。

1.1.2 疾病靶點的篩選 通過GeneCard數據庫(http：//www.genecards.org/)和OMIM 數據庫(https：//omim.org/)以“colorectal cancer”為關鍵字搜索與結直腸癌相關的靶點。

1.2 研究方法

1.2.1 交集靶點的獲取 將獲取的藤梨根藥物活性成分靶點與結直腸癌疾病靶點用R語言及VennDiagram作圖數據包映射篩選得出藥物與疾病的交集靶點,繪制韋恩圖,即可得到藤梨根治療結直腸癌的潛在治療靶點。

1.2.2 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖的構建 將藤梨根治療結直腸癌的潛在治療靶點與對應活性成分匹配后,通過Cytoscape 3.7.1建立“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖,線與線連接的每個節點代表的是基因、分子或者蛋白質,節點與節點之間的連線代表著這些有效成分及分子、基因與疾病之間的相互作用關系,并得到其Degree值,根據藥物活性成分與疾病靶點連接情況,預測藤梨根與結直腸癌之間相互作用關系,篩選關鍵核心成分。

1.2.3 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建 將藤梨根治療結直腸癌的潛在治療靶點導入String數據庫中,構建藤梨根治療結直腸癌的PPI網絡。限定物種設置成為“人類”,最低相互作用閾值為“中等置信度0.4”,獲取蛋白的相互作用關系,結果保存為TSV格式,再使用Cytoscape 3.7.1軟件進行網絡拓撲分析,選擇關鍵靶點。

1.2.4 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 在David 6.8數據庫中導入藤梨根藥物活性成分與結直腸癌疾病的交集靶點,輸入靶基因名稱列表,選擇物種為“人類”,在此數據庫中將靶點基因修正為官方名稱(“official gene symbol”),設定閾值P<0.05,獲得交集靶點的GO功能富集分析中生物過程(BP)數據和KEGG通路分析數據,并利用R語言3.6.3繪制GO功能富集分析的BP氣泡圖和KEGG通路富集分析的柱狀圖。

2 結果

2.1 藥物活性成分及靶點的篩選 通過TCMSP數據庫,以OB>30%、DL>0.18為篩選條件,共得到藤梨根藥物主要活性成分6個,再通過TCMIP平臺對藥物活性成分的作用靶點進行預測并去重,得到藥物作用靶點154個。見表1。

表1 藤梨根藥物主要活性成分

2.2 疾病靶點篩選及潛在治療靶點的獲取 從 GeneCards和OMIM數據庫中去重后檢索到結直腸癌相關靶點10 622個。將藤梨根藥物活性成分靶點與結直腸癌疾病靶點取交集得到藤梨根治療結直腸癌的潛在治療靶點145個。

2.3 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖的構建及分析 利用Cytoscape 3.7.1 軟件將上述得到的藤梨根治療結直腸癌的145個潛在治療靶點構建成“藥物-成分-靶點-疾病”的可視化網絡圖。藤梨根的6個主要活性成分蘆薈大黃素(aloe-emodin)、ent-表兒茶素(ent-Epicatechin)、(+)-兒茶素[(+)-catechin]、槲皮素 (quercetin)、谷甾醇 (sitosterol)及β-谷甾醇 (beta-sitosterol)均為治療結直腸癌的關鍵核心成分。見圖1。

圖1 “藥物-成分-靶點-疾病”的可視化網絡圖

2.4 PPI網絡的構建及關鍵靶點篩選 將藤梨根治療結直腸癌的145個潛在治療靶點導入String 數據庫中進行PPI網絡構建,顯示靶點之間的互作關系,再通過Cytoscape 3.7.1軟件進行網絡拓撲分析,得到的關鍵靶點有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、白細胞介素6(IL-6)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、JUN、胱天蛋白酶3(CASP3)、IL-1B、表皮生長因子受體(EGFR)、ESR1等。見圖2。

圖2 藤梨根治療結直腸癌潛在治療靶點的PPI圖

2.5 GO功能富集分析及KEGG 通路富集分析 將藤梨根治療結直腸癌的145個潛在治療靶點進行GO功能富集分析及KEGG 通路富集分析。因為考慮到BP是藥物發揮治療功效的主要因素,故本研究只觀察了BP數據。GO功能富集分析結果顯示,共得到BP條目141個,主要涉及DNA 結合轉錄因子活性、轉錄因子活性、細胞因子活性、血紅素結合抗氧化活性、核激素受體結合、過氧化物酶活性、轉錄共調節因子結合泛素樣蛋白連接酶等生物過程。KEGG通路富集分析結果顯示,主要涉及晚期糖基化終末產物-晚期糖基化終末產物受體(AGE-RAGE)信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、IL-17信號通路、缺氧誘導因子-1(HIF-1)信號通路等。見圖3、4。

圖3 GO功能富集分析BP氣泡圖

圖4 KEGG通路富集分析柱狀圖

3 討論

結直腸癌是一種常見的胃腸道惡性腫瘤,同時也是全球癌癥死亡的主要原因之一,由于其早期缺乏明顯的癥狀,一旦出現便血、腹痛等癥狀,病程已經達到中晚期[7]。西醫對于結直腸癌的治療手段主要是采用手術清除病灶組織,以及聯合放化療等,雖能延長患者生存期,但是術后較容易復發。中醫藥在治療結直腸癌方面具有經濟、多靶點、高效、毒副作用低等優點,近年來已成為結直腸癌患者主要的輔助治療方案之一。藤梨根是中醫臨床治療結直腸癌時較為常用的一味中藥,具有清熱利濕、健脾和胃、解毒祛邪的功效,但其具體作用機制尚未研究透徹。

本研究從網絡藥理學的角度出發,發現藤梨根治療結直腸癌的主要的活性成分是蘆薈大黃素(aloe-emodin)、ent-表兒茶素(ent-Epicatechin)、(+)-兒茶素[(+)-catechin]、槲皮素 (quercetin)、谷甾醇 (sitosterol)及β-谷甾醇 (beta-sitosterol)。蘆薈大黃素是一種小分子羥基蒽醌類化合物,越來越多的證據表明蘆薈大黃素有抗腫瘤活性[8]。相關實研究表明,蘆薈大黃素可通過抑制AKT和細胞外受體激酶(ERK)磷酸化來抑制人食管癌細胞長,蘆薈大黃素還可通過誘導內質網應激依賴性細胞凋亡、抑制結直腸癌細胞活力、誘導HCT116結腸癌細胞凋亡而治療結直腸癌[9-11]。表兒茶素和兒茶素屬于酚類化合物,有研究已經證明,兒茶素可以通過抑制VEGF的誘導來抑制腫瘤生長、癌細胞侵襲及腫瘤血管生成等[12-13]。另有報道稱兒茶素具有很好的抗氧化活性,可以通過直接或間接的抗氧化作用抑制過度氧化應激,促進谷胱甘肽過氧化物酶(GPO)和谷胱甘肽(GSH)等抗氧化物質的活化,減少對結腸的氧化損傷[14]。此外,兒茶素還能調節免疫相關細胞的浸潤和增殖,如中性粒細胞、結腸上皮細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞,幫助減少炎癥反應[15]。此外,兒茶素可以通過調節炎癥相關和氧化應激相關細胞信號通路的激活或失活來發揮其抗炎特性,例如核因子κB (NF-κB)通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)通路、轉錄因子核因子樣2 (Nrf2)通路、信號轉導和轉錄1/3 (STAT1/3)通路等[16-19]。最后,兒茶素還可以通過促進腸道有益菌的增殖,調節腸道菌群的平衡來穩定胃腸微生態環境的結構,從而緩解結直腸癌癥狀[20]。槲皮素是一種黃酮醇類化合物,具有抗氧化、抗炎、抗病毒的作用,有研究表明交替攝入β-葡聚糖和槲皮素可顯著降低TNF-α水平,并下調與炎癥和癌癥相關的基因[21]。有報道指出,槲皮素可以降低大腸桿菌、變形菌、腸球菌、梭桿菌的數量,促進雙歧桿菌、擬桿菌、梭菌、乳酸桿菌數量,從而促進腸道穩態[22-23]。最近的一項研究報道稱,向小鼠補充槲皮素可改善檸檬酸桿菌引起的結腸炎的影響,抑制包括IL-17、IL-6、TNF-α在內的促炎細胞因子的產生,并增加IL-10在結腸組織中的含量,還可通過降低血清二胺氧化酶(DAO)活性和血清D-乳酸含量來改善腸道屏障功能[24]。此外,槲皮素還可以通過調節細胞凋亡和自噬的能力發揮抗癌作用[25]。谷甾醇是一種植物固醇,研究表明其可降低膽固醇水平,增加纖溶酶原激活劑的產生,并具有抗癌的作用[26]。在動物實驗中還發現,β-谷甾醇可以濃度依賴性方式降低實驗性結腸炎小鼠腸道組織中TNF-α、IL-6、IL-1β水平[27],β-谷甾醇還可通過抑制乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)的表達,來恢復耐藥性結直腸癌細胞對奧沙利鉑的敏感性[28]。

PPI網絡篩選結果顯示,藤梨根治療結直腸癌的關鍵靶點有AKT1、IL-6、VEGFA、JUN、CASP3、IL-1B、EGFR、ESR1等。AKT是鼠胸腺瘤病毒癌基因v-AKT的同源物,位于人類染色體14q32.32,編碼 480個氨基酸的蛋白質[29]。AKT1是一種在大多數癌癥中過度活躍的原癌基因,是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路的重要效應因子,這種蛋白質的基因突變或異常表達可能會改變與癌癥發生和進展相關的各種細胞過程[30]。報道稱,PI3K/AKT/mTOR通路中的rs10138227 AKT1 基因變異可能與結直腸癌的風險有關[31]。IL-6、IL-1β是一種在免疫細胞和非免疫細胞中均具有多功能的炎性細胞因子,其表達水平與癌癥患者的疾病預后呈負相關,可激活STAT3并上調結腸腫瘤細胞中DNA甲基轉移酶1(DNMT1)和DNMT3b的表達,從而促進結直腸癌的進展[32]。血管生成是腫瘤的標志并且參與實體瘤的發生,研究表明VEGFA的過度表達與結直腸癌的血管分布、轉移和增殖相關,結直腸癌組織中VEGFA可顯著上調,其中VEGFA121a/b 和VEGFA165a/b 是主要的亞型[33]。JUN 是一種原癌基因,異位積累時可促進細胞增殖,但可被干細胞因子(SCF)FBXW7泛素化,導致其降解。FBXW7是JUN的E3泛素連接酶,在結腸癌中表現出抑癌作用[34]。Caspases 是一個 15 個成員的半胱氨酸蛋白酶家族,在程序性細胞死亡和炎癥中發揮重要作用。研究表明,CASP3不僅有助于抗藥性和抗輻射性,還參與調節結腸癌細胞的遷移、侵襲和轉移,促進上皮間質轉化(EMT)[35]。EGFR是一種在結直腸癌細胞表面過度表達的蛋白質,它可以刺激癌細胞增殖和生存[36]。ESR1是雌激素受體β(ERβ)在惡性結腸上皮中表達的主要雌激素受體形式,與正常組織相比,在結腸腫瘤發生過程中ERβ的表達降低,ESR1表達升高[37]。

本研究GO功能富集分析顯示,藤梨根治療結直腸癌的作用機制主要與轉錄因子活性、細胞因子活性、血紅素結合抗氧化活性、核激素受體活性、轉錄共調節因子結合泛素樣蛋白連接酶等生物過程有關,這表明藤梨根可能通過影響核受體的結合、轉錄因子活性、激素受體等反應來起到治療結直腸癌的作用。KEGG通路富集結果分析得到涉及的信號通路主要有AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等。AGEs 是晚期糖基化終產物的一種高反應性分子,當葡萄糖或其他還原糖與氨基酸、核苷酸堿基或脂肪酸反應時,內源性或外源性形成AGEs的細胞內功能是通過與RAGE結合來介導的,RAGE是一種跨膜受體,是免疫球蛋白家族的成員[38]。研究表明,RAGE的表達在癌癥進展過程中成倍增加,AGE-RAGE 信號的激活也會擾亂細胞氧化還原平衡并調節各種細胞死亡途徑,程序性細胞死亡信號導致結直腸癌[39]。HIF可由一些細胞因子和生長因子誘導表達,研究顯示抑制HIF-1α的表達可以抑制結直腸癌的發展[40]。同時HIF-α能夠激活VEGF促進腫瘤血管的生成,同時在缺氧環境下HIF-1α有助于腫瘤的侵襲性和對放化療的抵抗力[41],其可能在血管生成和腫瘤進展中通過調節人結直腸癌中的VEGF起作用[42]。前沿研究表明,脂質過氧化過程導致4-羥基壬烯醛(4-HNE)的形成,這是一種上調前列腺素E2(PGE2)活性的化合物,與CRC發展的風險增加直接相關[43]。脂肪組織的高危轉化能力是由于產生不同的促炎細胞因子,如TNF-α、IL-6、IL-1β等,研究表明IL-6、IL-1β能改變腫瘤微環境來促進結直腸癌細胞增殖[44],IL-6和TNF-α能夠協同激活STAT3及NF-κB 促進結直腸癌細胞的增殖[45]。IL-17的主要來源是輔助型 T淋巴細胞 17 (Th17)的CD4+亞群[46],Th17 細胞的分化和穩定需要多種物質,其中視黃酸孤兒受體-γ(RORγ)和STAT3是負責Th17分化和穩定的轉錄因子,研究數據顯示在結直腸癌患者的血清和腫瘤組織中 IL-17 水平升高[47]。此外,多項研究表明,IL-17在結直腸癌的轉移和預后中具有重要作用[48-49],IL-17抑制趨化因子9/10(CXCL9/10)介導的CD8+細胞毒性T淋巴細胞和調節性T淋巴細胞向結直腸腫瘤的募集,IL-17可激活HT-29人結腸癌細胞中的ERK1/2信號通路,增加IL-17下游基因如基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、MMP-7、MMP-2等表達[50]。

總之,藤梨根治療結直腸癌具有多成分、多靶點、多通路的整體調節作用的特點,本研究通過預測藤梨根治療結直腸癌的潛在作用機制,以期為其活性成分研究以及實驗研究提供科學依據。