參苓白術散通過Linc01615/miR-491-5p對結直腸癌細胞的影響

鐘麗婭 趙建政 毛昀 肖佑

摘要：目的 探索參苓白術散通過Linc01615/miR-491-5p對結直腸癌細胞凋亡、細胞周期和侵襲作用的影響。方法 通過細胞轉染構建分組：空白對照組、參苓白術散組、參苓白術散組+siRNA Linc01615、參苓白術散組+oe Linc01615、參苓白術散組+miR-491-5p mimics、參苓白術散組+miR-491-5p抑制劑組、參苓白術散組+miR-491-5p mimics+oe Linc01615，加入相應的血清進行干預。經相應的血清處理后，Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞儀檢測細胞凋亡、細胞周期分布情況，transwell實驗檢測細胞侵襲情況。結果 參苓白術散處理細胞后，抑制細胞增殖、侵襲及細胞周期的G0/G1期并促進凋亡，在分別加入siRNA Linc01615和 miR-491-5p mimics后效果更為顯著，差異具有統計學意義（P<0.05）。結論 參苓白術散可能通過Linc01615/miR-491-5p 抑制LoVo細胞的侵襲，促進凋亡并將細胞周期阻滯于G0/G1期。

關鍵詞：參苓白術散；Linc01615；miR-491-5p；結直腸癌

中圖分類號：R735.3+7

文獻標志碼：A

文章編號：1007-2349（2024）01-0079-06

Effect of Shenling Baizhu Powder on Colorectal Cancer Cells via Linc01615/miR-491-5p

ZHONG Li-ya，ZHAO Jian-zheng，MAO Yun，XIAO You

（1. 921 Hospital of Joint Logistic Support Force，Changsha 410000，China;

2. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410005，China）

【Abstract】Objective： To study the effect of Shenling Baizhu Powder on apoptosis，cell cycle and invasion of colorectal cancer via Linc01615/miR-491-5p. Methods： Groups were constructed by cell transfection and divided blank control group，Shenling Baizhu Powder group，Shenling Baizhu Powder group+siRNA Linc01615，Shenling Baizhu Powder group+oe Linc01615，Shenling Baizhu Powder group+miR-491-5p mimics，Shenling Baizhu Powder group+miR-491-5p inhibitor group，Shenling Baizhu Powder group+miR-491-5p mimics+oe Linc01615. All groups were added to the corresponding serum for intervention. After treatment with the corresponding serum，Annexin V-FITC/PI double staining flow cytometry was used to detect apoptosis and cell cycle distribution，and transwell assay was used to detect cell invasion. Results： Shenling Baishu Powder inhibited cell proliferation，invasion and G0/G1 phase of cell cycle，and promoted apoptosis，and the effect was more significant after the addition of siRNA Linc01615 and miR-491-5p mimics. The difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion： Shenling Baizhu Powder may inhibit the invasion of LoVo cells through Linc01615/miR-491-5p，promote apoptosis and block the cell cycle in G0/G1 phase.

【Key words】Shenling Baizhu Powder; Linc01615; miR-491-5p; Colorectal Cancer

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種常見消化系統癌癥，且有越來越多的數據顯示，結直腸癌的發病趨向年輕化發展，因此，積極探究結直腸癌發生和發展過程中的異常分子機制，提高患者生存期顯得至關重要。參苓白術散應用于CRC治療領域取得了良好的效果，大量的臨床研究顯示參苓白術散在增強患者食欲，抑制癌細胞功能，增強機體免疫力等方面占據了重要地位。參苓白術散在腫瘤領域的研究越來越廣泛，臨床應用療效頗豐，但在CRC中的實驗研究并不多見。

Linc01615在多種腫瘤中作為促癌基因對腫瘤細胞生物學行為進行調控。然而在CRC中，Linc01615的表達情況研究尚少。miR-491-5p是一種腫瘤抑制因子，miR-491-5p參與對鼻咽癌、前列腺癌、乳腺癌腫瘤細胞的生物學功能的調節。課題組在前期已對Linc01615/miR-491-5p調控軸進行了研究，發現Linc01615及miR-491-5p 基因表達呈負相關，Linc01615在CRC中作為促癌基因發揮作用，而miR-491-5p作為抑癌基因發揮作用，Linc0165通過調節 miR-491-5p 的表達調控結直腸癌細胞的生物學功能。結合科室臨床觀察及國內外同行研究成果發現參苓白術散具有抗腫瘤作用，本研究推論參苓白術散可能通過Linc01615/miR-491-5p 途徑調控結直腸癌的生物學功能，并深入探索參苓白術散治療CRC的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 SD雄性大鼠28只，SPF級，體重（235±15）g，許可證號：SCXK（湘）2019-0014，購買于長沙市天勤生物技術有限公司，動物飼養于湖南省中醫藥研究院。實驗通過湖南省中醫藥研究院實驗動物倫理委員會批準（編號：2021-0039）。

1.1.2 藥物 人參（批號20201201），白術（批號041104），茯苓（批號211001），山藥（批號210401），薏苡仁（批號031201），蓮子肉（批號211202），陳皮（批號211001），白扁豆（批號210330），砂仁（批號112205），桔梗（批號122404），甘草（批號2110101）。由湖南中醫藥大學第二附屬醫院新匯藥房提供，質量均符合《中國藥典》2020年版標準。

1.1.3 試劑 人結直腸癌細胞系LoVo（GENINK），RPMI-1640培養基（Gibco），胰酶Trypsin-EDTA（0.25%）（Gibco），FBS（Gibco），F-12K（Gibco），Lipofectamine2000（invitrogen），Opti-MEM（Gibco），Transwell小室（Corning），Matrigel基質膠（BD），結晶紫染色液（Biosharp），Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（Beyotime），細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒（Beyotime），異氟烷（江蘇恒豐強）。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠含藥血清的制備 參苓白術散成人臨床使用劑量：人參15 g，白術15 g，茯苓15 g，山藥15 g，薏苡仁9 g，蓮子肉9 g，陳皮9 g，白扁豆12 g，砂仁6 g，桔梗6 g，甘草9 g。根據大鼠與人的劑量換算系數6.3，大鼠給藥劑量10.8 g/kg，熬制參苓白術散藥液為2 g/mL濃縮液后冰箱內保存，每日使用時提前復溫。將28只大鼠隨機分為7組，1組為空白組（4只），另6組為給藥組（24只）。待適應性喂養3 d后，按照上述計算劑量，給藥組每日予參苓白術散灌胃，空白組予等量生理鹽水，連續灌胃1周后提取血清。大鼠末次給藥1 h后，異氟烷吸入麻醉后經腹主動脈取血，室溫靜置1 h后，3000rpm離心15 min，置于-80℃冰箱保存備用。

1.2.2 細胞轉染與分組 取對數生長期LoVo細胞分別用 Lipofectamine 2000 轉染oe Linc01615、siRNA Linc01615及miR-491-5p mimics、抑制劑以人為地增強或抑制這些RNA 的表達水平，oe Linc01615 和siRNA Linc01615由賽默飛世爾科技公司提供，miR-491-5pmimics及抑制劑由上海吉凱基因公司提供，轉染過程嚴格按照Lipofectamine 2000試劑說明書進行，再用大鼠血清處理轉染后的LoVo細胞溶液24h。轉染細胞分組：A：空白對照組；B：參苓白術散組；C：參苓白術散組+siRNA Linc01615；D：參苓白術散組+oe Linc01615，E：參苓白術散組+miR-491-5p mimics，F：參苓白術散組+miR-491-5p抑制劑組，G：參苓白術散組+miR-491-5p mimics+oe Linc01615。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞的凋亡和周期改變 在LoVo細胞中加入 Annexin V-FITC結合液，碘化丙啶（PI）染色液；室溫下使用鋁箔避光孵育15min，隨后置于冰中；染色結束后即刻流式細胞儀檢測凋亡情況。另取LoVo細胞加入預冷70%乙醇，4℃保存，固定過夜；樣品中加入PI染色液，充分重懸細胞，室溫避光孵育30min；流式細胞儀檢測，分析細胞周期。

1.2.4 Transwell法檢測細胞的侵襲情況 提前拿出Matrigel膠融化，變為液態使用；加入到transwell小室底膜的上室面，培養箱中靜置2h成膠；取細胞懸液加入到小室中，再在下層小室中加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基；結晶紫染色20min，洗去結晶紫，棉簽輕緩擦拭小室內側；顯微鏡拍照并記錄，取3個視野。計算侵襲過基底膜的LoVo細胞數量。

1.3 統計學方法 實驗數據由SPSS 26統計分析，計量資料用均數±標準差表示，多組間比較若符合正態分布且方差齊時用方差分析，兩兩比較用LSD檢驗，方差不齊時用Dunnett’s T3檢驗；反之用非參數檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LoVo細胞形態學的改變 參苓白術散處理細胞后（圖1B），細胞數目減少，抑制了細胞生長；在分別加入siRNA Linc01615和 miR-491-5p mimics后抑制效果更為顯著（圖1C、圖1E），說明參苓白術散可以促進LoVo細胞的死亡，抑制linc01615和過表達miR-491-5p會加重細胞死亡進程。詳見圖1。

2.2 流式細胞術檢測LoVo細胞的凋亡和周期改變 空白對照組、參苓白術散組、參苓白術散組+siRNA Linc01615、參苓白術散組+miR-491-5p mimics的凋亡率分別為1.2%、10.74%、11.54%、11.67%，參苓白術散組中LoVo細胞的凋亡率增加，且在分別加入siRNA Linc01615和miR-491-5p mimics后凋亡率增加更顯著。而在參苓白術散組+miR-491-5p mimics+oe Linc01615組的凋亡率為1.73%，過表達的Linc01615可部分逆轉miR-491-5p mimics對LoVo細胞的促凋亡作用。詳見圖2、3。

空白組G1期細胞占比為54.14%，參苓白術散處理細胞后，G1期細胞占比增加至57.48%，抑制了細胞周期的G0/G1期；分別加入siRNA Linc01615和 miR-491-5p mimics后G1期細胞占比上升到63.40%、65.84%，抑制效果更佳顯著。詳見圖4、5。

2.3 Tranwell實驗檢測LoVo細胞的侵襲 與空白組對比，參苓白術散處理細胞后，侵襲細胞數減少（P<0.05）；與參苓白術散組相比，分別加入siRNA Linc01615和 miR-491-5p mimics后細胞數明顯減少，抑制效果更佳顯著（P<0.05），而過表達的Linc01615可阻滯過表達miR-491-5p 對LoVo細胞侵襲功能的抑制。詳見圖6、7，表1。

3 討論

目前，CRC以手術方式為主要治療手段，術前術后的放療、化學治療等為輔助手段。但化療藥物帶來的諸如骨髓抑制、胃腸反應等毒副作用仍深深困擾著患者。中醫藥治療在促進術后患者康復、增強體質、減少腫瘤轉移和復發、減輕放化療的副作用方面有著獨特的優勢。結直腸癌患者久病體虛，加上化療等外來之邪耗傷正氣，脾胃不足，所以本虛標實為主要病機特點，健脾扶正、清熱利濕抑瘤為主要治療原則，治療上多以脾為本。參苓白術散具有健脾補氣，滲濕止瀉的療效，此治療功效也與CRC的中醫病機相符。且有實驗證明，參苓白術散能增強人結腸癌細胞株HCT116對奧沙利鉑的敏感性，并促進人結腸癌細胞株HCT116凋亡，抑制細胞增殖，改變細胞周期。

LncRNA在腫瘤進展中的作用已被廣泛研究，探尋 lncRNA 在腫瘤進展中的功能，對于腫瘤的早期診斷、靶向治療及預后評估尤為有意義。最近的一項研究驗證了臨床和細胞樣本中Linc01615在結直腸癌的高表達，Linc01615過表達的患者往往預后不良，這也與我們前期的研究結論相一致。隨著基因表達譜研究的不斷挖掘，許多生理過程和病理的結果，包括腫瘤等疾病都被發現與miRNA的調控高度相關。在CRC中，Lu等發現miR-491-5p的表達在CRC組織和細胞系中明顯下調，且miR-491-5p表達水平與患者TNM分期和總生存期差有關。

前期研究發現Linc01615和miR-491-5p在結直腸癌組織中的表達差異，這一結果符合之前的文獻報道，且探索出二者的互作具有調控結直腸癌細胞生物學功能，為進一步替該信號通路提供有效的抑制藥物，結合我科臨床經驗及對直腸癌裸鼠模型的預實驗，我們選取了參苓白術散進行干預，探索參苓白術散治療CRC的分子生物學機制。

綜上所述，本研究顯示經參苓白術散干預后，LoVo細胞的增殖被抑制、凋亡增加，細胞的G0/G1周期被阻滯，其次參苓白術散減弱LoVo細胞的侵襲能力，抑制Linc01615或過表達miR-491-5p均可促進參苓白術散對LoVo細胞的調控作用，且過表達Linc01615可部分逆轉miR-491-5p模擬劑對參苓白術散處理后的LoVo細胞的調控功能。此次的研究結果至少可以一定程度上闡明調控Linc01615/miR-491-5p信號軸可能是參苓白術散在CRC中發揮抗腫瘤活性的重要途徑之一。

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（收稿日期：2023-08-25）