桔梗提取物木犀草素聯合磺胺嘧啶銀治療淺Ⅱ度燙傷作用研究

鄒正渝 胡龍嬌 許洲松 于倩 趙常亮

【摘 要】目的 探討桔梗成分木犀草素與磺胺嘧啶銀聯合治療淺Ⅱ度燙傷的協同作用，為優化治療方案提供新的理論基礎。方法 構建SD大鼠淺Ⅱ度燙傷模型，依據給藥情況分為五組：A組為模型組，B組為磺胺嘧啶銀組，C組為木犀草素組，D組為磺胺嘧啶銀和木犀草素聯用組，N組為正常對照組。根據給藥第4天和第7天的創面愈合率評價不同給藥組的療效。通過測量大鼠燙傷區域傷口直徑，采用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察創面皮膚組織的病理變化，采用Western blot檢測大鼠創面皮膚組織血管內皮生長因子（VEGF）、基質金屬蛋白酶2（MMP-2）和Ⅰ型膠原蛋白（Coll-Ⅰ）表達，采用ELISA檢測大鼠的腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素10（IL-10）水平。結果 B組、C組第7天燙傷創面愈合率均高于A組（P<0.05）；D組第7天燙傷創面愈合率均高于A組、B組、C組（P<0.05）。D組皮膚層完整，角質層、表皮和真皮結構正常，皮膚毛囊及附屬結構基本完整，恢復程度優于B組和C組。B組、C組VEGF、Coll-Ⅰ水平高于A組，MMP-2水平低于A組（P<0.05）；B組和C組VEGF、Coll-Ⅰ、MMP-2水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）；D組VEGF、Coll-Ⅰ水平均高于A組、B組、C組，MMP-2水平均低于A組、B組、C組（P<0.05）。B組、C組TNF-α水平均低于A組（P<0.05）；B組、C組TNF-α水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）；A組、B組、C組IL-10水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）；D組TNF-α水平均低于A組、B組、C組，IL-10水平均高于A組、B組、C組（P<0.05）。結論 磺胺嘧啶銀聯合木犀草素治療淺Ⅱ度燙傷的效果優于單獨用藥，其潛在機制之一可能是通過下調MMP-2表達，上調VEGF、Coll-Ⅰ和IL-10表達，抑制TNF-α等因子的表達，以減輕組織炎癥，改善燙傷創面皮膚組織環境，促進愈合。

【關鍵詞】木犀草素；磺胺嘧啶銀；淺Ⅱ度燙傷；創面愈合

中圖分類號：R285 文獻標識碼：A 文章編號：1004-4949（2023）24-0114-05

基金項目：九龍坡區科技計劃項目（編號：2021-02-011-Y）

Study on the Effect of Luteolin Extracted from Platycodon Grandiflorum Combined with Silver Sulfadiazine in the Treatment of Superficial Degree Ⅱ Scalds

ZOU Zheng-yu1，2， HU Long-jiao3， XU Zhou-song1， YU Qian4， ZHAO Chang-liang5

（1.Medical Laboratory of Chongqing Jiulongpo Peoples Hospital， Chongqing 400050， China； 2.Jiulongpo District Yangjiaping Street Community Health Service Center， Chongqing 400050， China； 3.Pharmacy department of Chongqing Jiulongpo Peoples Hospital， Chongqing 400050， China；4.Institute of Life Sciences， Chongqing Medical University， Chongqing 400021， China；5.Rehabilitation Medicine Department of Chongqing Jiulongpo Peoples Hospital， Chongqing 400050， China）

【Abstract】Objective To investigate the synergistic effect of luteolin extracted from platycodon grandiflorum and silver sulfadiazine in the treatment of superficial degree Ⅱ scalds， providing new theoretical basis for optimizing the treatment plan. Methods SD rat model of superficial degree Ⅱ scald was constructed and divided into five groups according to the administration ： group A was the model group， group B was the sulfadiazine silver group， group C was the luteolin group， group D was the sulfadiazine silver and luteolin combination group， and group N was the normal control group. The efficacy of different administration groups was evaluated according to the wound healing rate on the 4th and 7th day of administration. The wound diameter in the scalded area of rats was measured. The pathological changes of wound skin tissue were observed by hematoxylineosin （HE） staining. The expressions of vascular endothelial growth factor （VEGF）， matrix metalloproteinase 2 （MMP-2） and type I collagen （Coll-Ⅰ） in wound skin tissue of rats were detected by Western blot. The levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-10 （IL-10） in rats were detected by ELISA. Results The healing rate of scald wounds in group B and group C was higher than that in group A on the 7th day （P<0.05）. The healing rate of scald wounds in group D was higher than that in group A， group B and group C on the 7th day （P<0.05）. The skin layer of group D was intact， the structure of stratum corneum， epidermis and dermis was normal， and the skin hair follicles and accessory structures were basically intact， the degree of recovery was better than that of group B and group C. The levels of VEGF and Coll-Ⅰ in group B and group C were higher than those in group A， and the level of MMP-2 was lower than that in group A （P<0.05）. There was no significant difference in the levels of VEGF， Coll-Ⅰ and MMP-2 between group B and group C （P>0.05）. The levels of VEGF and Coll-Ⅰ in group D were higher than those in group A， group B and group C， and the levels of MMP-2 were lower than those in group A， group B and group C （P<0.05）. The levels of TNF-αin group B and group C were lower than those in group A （P<0.05）. There was no significant difference in the level of TNF-αbetween group B and group C （P>0.05）. There was no significant difference in IL-10 level among group A， group B and group C （P>0.05）. The level of TNF-α in group D was lower than that in group A， group B and group C， and the level of IL-10 was higher than that in group A， group B and group C （P<0.05）. Conclusion The effect of silver sulfadiazine combined with luteolin in the treatment of superficial degree Ⅱ scalds is better than that of single drug. One of the potential mechanisms may be to down-regulate the expression of MMP-2， up-regulate the expression of VEGF， Coll-I and IL-10， and inhibit the expression of TNF-α and other factors， so as to reduce tissue inflammation， improve the skin tissue environment of scald wounds and promote healing.

【Key words】Luteolin； Sliver sulfadiazine； Superficial degree Ⅱ scald； Wound healing

桔梗是桔梗科植物桔梗的干燥根，含有皂苷、黃酮類、甾醇類、脂肪酸等多種化合物，具有鎮咳、抗炎、降血糖、降血壓等作用[1]。木犀草素（luteolin）廣泛存在于桔梗等藥用植物中，具有抗氧化、抗炎、抗菌等生物活性，常被用來制作藥物以預防和治療疾病[2]。磺胺嘧啶銀（sliver sulfadiazine）屬于磺胺類抗菌藥物，是臨床燒燙傷的常用外用藥物之一[3]。有研究發現[4]，桔梗提取物木犀草素是桔梗促進皮膚燙傷大鼠創面愈合的有效成分，可減少炎癥因子釋放，促進血管生成。本研究旨在通過聯合使用木犀草素和磺胺嘧啶銀干預大鼠淺Ⅱ度燙傷模型的愈合過程，以期尋找一種更為有效的燙傷綜合治療方案，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和藥品 選取20只成年雄性清潔級SD大鼠，體重220～250 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供[許可證號：SCXK（湘）2019-0004]。大鼠飼養和建模過程在重慶威斯騰生物醫藥科技有限責任公司進行，分籠飼養，室內溫度23 ℃～25 ℃，自由飲水進食，動物進入動物房適應性飼養1周后進入實驗。木犀草素購自北京索萊寶科技有限公司，磺胺嘧啶銀購自美國MedChemExpress公司。

1.2 試劑 多聚甲醛和水合氯醛購自生工生物工程（上海）股份有限公司；脫毛膏購自廣州露韓秀生物技術有限公司；蘇木素-伊紅染液（hematoxylin-eosin，HE）購自碧云天；中性樹脂購自國藥集團；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素10（interleukin-10，IL-10）ELISA試劑盒購自達科為；血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）兔抗體購自HUABIO公司；基質金屬蛋白酶-2（matrix metallopeptidase-2，MMP-2）兔抗體和Ⅰ型膠原蛋白（collagen type Ⅰ，Coll-Ⅰ）兔抗體購自美國Affinity公司；GAPDH兔抗體購自華安公司；HRP標記山羊抗兔IgG購自碧云天。

1.3 建模方法 建模前12 h禁食，腹腔注射7%水合氯醛（5 ml/kg），待充分麻醉后，使用脫毛膏脫去背部待燙傷區域被毛，將直徑15 mm、重量0.5 kg的金屬板塊置于水浴鍋中加熱至65 ℃，將其均勻地放在大鼠背部脫毛區域3 s，造成約10%的燙傷創面以構建淺Ⅱ度燙傷模型。大鼠背部兩側均進行建模。

1.4 給藥方法 根據給藥處理將燙傷大鼠模型分為五組：A組為模型組，B組為磺胺嘧啶銀組，C組為木犀草素組，D組為磺胺嘧啶銀和木犀草素聯用組，N組為正常對照組，每組3只大鼠，另5只大鼠備用。每天上午9點和下午3點給藥。在給藥之前，用生理鹽水清洗傷口以去除殘余物質，然后將相應的軟膏按照說明書要求涂抹在傷口上，厚度約為1.5 mm[3]，D組每次先涂抹磺胺嘧啶銀待藥物充分吸收后再涂抹木犀草素，A組不做任何給藥，N組不予任何處理。

1.5 觀察指標

1.5.1創面愈合率 分別在給藥后第4天和第7天測量燙傷創面區域的直徑，計算創面面積和創面愈合率。創面愈合率=（原始創面面積-觀察創面面積）/原始創面面積×100%。創面面積越小說明創面愈合越快。

1.5.2組織檢測 在給藥后第8天，取兩側燙傷區域的皮膚，一側皮膚使用4%多聚甲醛固定，4 ℃冰箱保存，用于HE染色，另一側皮膚于-80 ℃冰箱保存，用于蛋白質印跡法（Western blot，WB）檢測。HE染色評估燙傷區域表皮組織，WB檢測燙傷創面皮膚組織的MMP-2、Coll-Ⅰ和VEGF的表達。

1.5.3血清檢測 在給藥后第8天，進行腹主動脈采血，收集血清，置于-20 ℃冰箱保存，采用ELISA方法檢測TNF-α、IL-10水平。

1.6 統計學方法 使用SPSS 20.0統計學軟件分析本研究數據，正態分布的計量資料以（x-±s）表示，進行方差分析，兩組組間比較采用SNK法；非正態分布的計量資料以[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗；以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 五組燙傷創面愈合率比較 四組第4天燙傷創面愈合率比較，差異無統計學意義（P>0.05）；B組、C組第7天燙傷創愈合率均高于A組（P<0.05）；D組第7天燙傷創面愈合率均高于A組、B組、C組（P<0.05），見表1。

2.2 五組創面皮膚組織的病理變化 A組表皮結構破壞，組織水腫壞死，炎性細胞增多；B組、C組表皮修復良好，其中B組部分上皮再生修復，有散在炎性滲出，上皮下有瘢痕增生；C組上皮部分缺失，瘢痕樣增生明顯，表面有部分炎性滲出；D組皮膚層完整，角質層、表皮和真皮結構正常，皮膚毛囊及附屬結構基本完整，恢復程度優于B組和C組；N組皮膚表皮完整，角質層、表皮和真皮結構正常，皮膚毛囊及附屬結構完整，見圖1。

2.3 五組VEGF、MMP-2、Coll-Ⅰ蛋白表達水平比較 B組和C組VEGF、Coll-Ⅰ水平高于A組，MMP-2水平低于A組（P<0.05）；B組和C組VEGF、Coll-Ⅰ、MMP-2水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）；D組VEGF、Coll-Ⅰ水平均高于A組、B組、C組，MMP-2水平均低于A組、B組、C組（P<0.05），見圖2、表2。

2.4 五組血清TNF-α、IL-10水平比較 B組、C組TNF-α水平均低于A組（P<0.05）；A組、B組、C組IL-10水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）；D組TNF-α水平均低于A組、B組、C組，IL-10水平均高于A組、B組、C組（P<0.05），見表3。

3 討論

淺Ⅱ度燙傷常見于開水、熱湯、熱油造成的燙傷，以及持續時間比較短的火焰燒傷等，主要表現為真皮損傷，局部紅腫疼痛，創面滲液較多，有大小不等的水皰，如不及時處理或處理不佳，會加重皮膚損傷程度，不僅減慢愈合時間，還可能會留下瘢痕，對患者的身體和心理產生一定的影響[5，6]。磺胺嘧啶銀是治療燙傷的一種常用的外用藥物，其藥效也在研究中得以證實[3]，但容易造成皮膚局部刺激性、皮疹、皮炎、不良反應較多，甚至會導致創面組織脫水干燥，對燙傷后疼痛無緩解功效[7，8]。木犀草素是一種天然的黃酮類化合物，存在于桔梗、金銀花等多種中藥中，具有抗炎、抗氧化、抗過敏、抗腫瘤等多種藥理活性，通過抑制氧化自由基成為抗皮膚衰老和炎癥的調節劑[9-11]。研究發現[4]，木犀草素是促進皮膚燙傷大鼠創面愈合的有效成分。也有實驗發現[12]，木犀草素對兔耳增生性瘢痕抑制作用，局部涂抹木犀草素可以改善小鼠干燥性皮膚瘙癢，均顯示了木犀草素對于創面愈合的有益作用。為解決磺胺嘧啶銀的諸多不良反應，本研究通過磺胺嘧啶銀與木犀草素聯合應用，通過檢測創傷修復相關分泌因子以及炎癥相關信號通路關鍵因子的表達情況，尋找潛在的機制。

本研究結果顯示，D組第7天燙傷創面愈合率均高于A組、B組、C組（P<0.05）；D組VEGF、Coll-Ⅰ、IL-10水平均高于A組、B組、C組，MMP-2、TNF-α水平均低于A組、B組、C組（P<0.05），提示磺胺嘧啶銀和木犀草素聯合治療淺Ⅱ度燙傷的效果優于單獨用藥，可加快創面皮膚的結痂和愈合。分析磺胺嘧啶銀聯合木犀草素的作用機制可能是通過上調VEGF促進周圍血管形成，下調MMP-2表達，上調Coll-Ⅰ表達，抑制透明質酸酶和膠原酶的活性，導致細胞外基質更加穩定，角質形成細胞從傷口邊緣遷移，形成完整的細胞片[13]，從而緩解由磺胺嘧啶銀造成的創面組織脫水干燥、皮炎、皮疹等不良反應，增加角質形成細胞的傷口愈合能力；另一方面，通過上調IL-10表達，上調轉錄活化因子6（signal transduction and activator of transcription 6，STAT6）和抑制轉錄激活子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）[14]，從而抑制單核巨噬細胞釋放炎癥介質，進一步抑制LPS和IFN-γ導致的TNF-α等因子分泌，實現對核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）、激活蛋白1（activator protein，AP-1）等轉錄因子的調控，從而調節NF-κB信號通路，提升抗炎活性，促進傷口愈合[15]。

綜上所述，磺胺嘧啶銀和木犀草素聯合用藥可促進淺Ⅱ度燙傷的創面皮膚愈合，提高臨床有效率，可作為潛在的臨床上治療淺Ⅱ度燙傷的治療方案之一。下一步，研究團隊將對淺Ⅱ度臨床燙傷患者進行磺胺嘧啶銀和木犀草素聯合用藥的臨床試驗和進一步的機制探討，以進行臨床有效性和安全性的評估，為未來的研究提供更多的理論基礎。

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編輯 扶田