雙特異性抗體藥物細菌內毒素檢查法的建立

段 穎，李肖肖，秦國宏

南京正大天晴制藥有限公司，江蘇 南京 210046

雙特異性抗體憑借其靶點結合的特殊性，作用機制靈活，相應的藥物在疾病治療領域中發揮了超越天然抗體的優勢[1]。從安全用藥角度考慮，將其應用于臨床試驗中時，必須嚴格控制藥物中細菌內毒素的含量[2]。

細菌內毒素存在于革蘭氏陰性菌外膜中。細菌在死亡或自溶后就會釋放出內毒素，隨著給藥進入體內后可引發嚴重的不良副作用[3]。基于內毒素可以特異性激活負責鱟血液凝固的蛋白酶原這一原理，憑借操作簡單的優勢，凝膠法被廣泛應用于藥物的內毒素污染控制中。鑒于鱟資源的稀缺性，并且該方法本身容易受到的干擾因素眾多，加之其僅能作為定性方法被應用，在多方面因素的作用下，建立穩健替代方法迫在眉睫[4-5]。

重組C 因子法在內毒素檢測方面具有高度特異性[6]。重組C 因子作為改造的穩定蛋白，與內毒素結合后識別并催化下游底物發出熒光信號。信號強度與內毒素含量呈正相關，因此可以定量檢測內毒素含量。該方法無需用到天然鱟變形細胞，保護了鱟資源。本研究建立了雙抗藥物的細菌內毒素質量控制方法，并開展了方法學研究[7]。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器

生化培養箱(上海一恒公司)，生物安全柜（蘇州安泰公司），多功能酶標儀（Molecular Devices 公司）。

1.2 試藥

細菌內毒素工作標準品（批號202088，規格60 EU/支，中國食品藥品檢定研究院）；細菌內毒素檢查用水（批號2012220，湛江安度斯生物有限公司）；鱟試劑（批號22022412，靈敏度0.25 EU/mL，規格0.1 mL，福州新北生化工業有限公司）；重組C 因子試劑盒（批號RF010210401，RF010220201，Adamas life 公司）；原液（批號20211102，內毒素限值低于15 EU/mL，南京正大天晴制藥有限公司）。

2 方法與結果

2.1 凝膠法檢測

取一支細菌內毒素工作標準品，加入1 mL 檢查用水復溶，渦旋15 min 后即得到濃度為60 EU/mL 的內毒素標準品溶液。后續不同濃度的內毒素標準品溶液均由該溶液稀釋得到。

參照中國藥典中最大有效稀釋倍數計算公式，確定原液最大稀釋倍數為60。取原液用檢查用水配制成60 倍稀釋濃度的供試品溶液。取0.1 mL 供試品溶液向其中加入鱟試劑0.1 mL，平行制2 管作為供試品陰性對照組；用60 倍稀釋濃度的供試品溶液同比例稀釋1 EU/mL 的內毒素工作標準品，并取0.1 mL 稀釋后的溶液向其中加入鱟試劑0.1 mL，平行制2 管作為供試品陽性對照組；分別取0.1 mL 檢查用水和0.5 EU/mL 內毒素工作標準品向其中加入鱟試劑0.1 mL，分別作為陰性對照和陽性對照組，每組平行制2 管。將配制完成的溶液樣品用封口膜封口，渦旋混勻后于37 ℃培養箱中反應60 min。

依據中國藥典凝膠限度試驗中的結果判定規則對檢測結果進行分析。

2.2 重組C 因子法建立

2.2.1 樣品制備

在無熱原玻璃試管中用檢查用水將60 EU/mL的內毒素標準品溶液進行梯度稀釋。稀釋后濃度分別為2.5、1.5、0.5、0.1 EU/mL，作為線性標準溶液。

根據供試品的內毒素限值確定其對應的稀釋倍數。對于原液，選定稀釋倍數為30。

2.2.2 試液加入

分別取100 μL 檢查用水、線性標準溶液、稀釋后的樣品加入96 孔無菌酶標板相應孔中，每組做2復孔。檢測樣品均設置加標樣品組，向100 μL 稀釋后的樣品中加入10 μL 濃度為5 EU/mL 的內毒素標準品溶液，同步做2 復孔。

將加樣后的酶標板放置在37 ℃培養箱中預熱15 min。將試劑盒中的熒光底物溶液、測定緩沖液和重組C 因子酶溶液按照5∶4∶1 的比例混合后按照100 μL/孔的量加入檢測孔中。加入底物試劑后將酶標板放置在37 ℃培養箱中反應1 h。分別在0 h 和1 h 時讀取熒光值。酶標儀設置激發和發射波長分別為380 nm 和440 nm，熒光增益強度設為中等，每個孔掃描6 次。

2.2.3 結果分析

線性標準溶液和樣品的熒光信號值均扣去陰性對照信號值以排除本底干擾，得到相對熒光信號值（Relative Fluorescence Unit，RFU）。以線性標準溶液的凈相對信號的對數值logδRFU 為縱坐標，內毒素濃度為橫坐標進行線性擬合，擬合線性方程如下。線性相關系數r 不應小于0.950。

通過擬合的線性方程計算樣品加標回收率，回收率在50%～200%范圍內就可判定供試品對檢測無干擾。計算加標回收合格的稀釋后供試品溶液的內毒素含量，再根據稀釋倍數計算未稀釋的供試品中內毒素含量。

2.3 重組C 因子法驗證

2.3.1 專屬性

鱟試劑凝集系統中存在G 因子反應旁路，可以被β-葡聚糖激活產生細菌內毒素檢查的“假陽性”，因此會干擾凝膠法的專屬性。所以還需考察β-葡聚糖是否會對重組C 因子法也產生干擾，對此，本研究制備0.1 μg/mL 的β-葡聚糖溶液進行重組C 因子法檢測，并計算相應的加標回收率。

該方法下并未檢出β-葡聚糖，加標回收率為71.4%，滿足回收率要求。結果表明重組C 因子法專屬性強，C 因子未與β-葡聚糖發生交叉反應。

2.3.2 線性

配制系列濃度為2.5、1.5、0.5、0.1 EU/mL 的內毒素線性標準溶液開展重組C 因子法檢測。以logδRFU 為縱坐標，內毒素濃度為橫坐標進行線性回歸并分析其相關系數。重復線性實驗3 次，3 次的相關系數r 均需滿足不小于0.950 的要求。結果表明內毒素含量在0.1～2.5 EU/mL 范圍內時，該方法的線性關系良好。

2.3.3 準確度

平行制備0.5、1.0、1.5 EU/mL 的內毒素標準品溶液各3 份進行檢測。代入線性方程中計算內毒素含量，將內毒素含量實測值與理論值進行比較計算回收率。計算得到0.5 EU/mL 標準品溶液的回收率為88%～120%；1.0 EU/mL 的回收率為88%～97%；1.5 EU/mL 的回收率為97%～104%。結果表明該方法的準確度較高。

2.3.4 精密度

由2 位實驗人員于不同日期分別平行制備0.5、1.0、1.5 EU/mL 的內毒素標準品溶液各3 份進行檢測。代入線性方程中計算內毒素含量。實驗人員1 測得的3 種濃度內毒素含量的SRSD作為重復性結果，SRSD均不超過15.7%。2 實驗人員測得的3 種濃度6次結果的SRSD均在24.2%～32.7%之間。結果表明該方法的精密度良好。

2.3.5 耐用性

反應時間出現微小波動（57 min 和63 min）時測得1.0 EU/mL 標準溶液內毒素含量的SRSD為12.1%。2 個批次試劑盒檢測3 份1.0 EU/mL 標準溶液共6 次結果的SRSD為8.3%。表明該方法耐用性較強。

2.4 內毒素檢測

分別采用兩種方法對20211102 批原液進行內毒素檢查。凝膠法測得原液符合低于15 EU/mL 的內毒素限定標準。重組C 因子法測得原液內毒素含量為3.9 EU/mL。相比于凝膠法，重組C 因子法可以給出定量結果。

3 討論

藥品中含有大量的內毒素會對人體造成嚴重的危害，因此檢測內毒素含量是包括雙特異性抗體在內的生物制品質量控制的重要環節。鑒于對鱟資源的保護和凝膠法的專屬性，重組C 因子法越來越有替代凝膠法的趨勢。市面上試劑盒種類繁多，如何基于項目特性和現有的儀器狀態建立穩健的重組C因子法需要進行進一步探究。

本研究針對雙特異性抗體藥物建立了重組C因子內毒素檢查法，經驗證該方法具有可實用性。重組C 因子法對β 葡聚糖無反應，同時線性范圍、準確度、精密度和耐用性均能夠符合要求。2 種方法的內毒素檢測結果表明重組C 因子法可以作為定量法準確提供內毒素含量，更利于研發團隊對內毒素水平進行控制。

綜上所述，本文建立的方法適用于雙特異性抗體藥物的內毒素定量檢測，對其他抗體藥的重組C因子檢查法的建立具有借鑒意義。