CTAB 反膠束體系中脂肪酶催化合成山梨酸乙酯的研究

唐 功

(阿壩師范學院資源與環境學院,四川 阿壩藏族羌族自治州 623002)

山梨酸乙酯是山梨酸系列產品的一種,其對霉菌、細菌有滅活作用[1],可用于解決山梨酸解決不了的微生物高度污染的環境消毒及防腐問題。湯健[2]報道了一種制備山梨酸乙酯原液的仿自然衍生法,山梨酸乙酯得率為85%。鄧繼勇等[3]以氯化亞錫水合物為催化劑,催化山梨酸合成了山梨酸乙酯,但山梨酸乙酯的分離步驟較復雜。上述合成山梨酸乙酯的化學法,存在反應條件較苛刻、副反應多和產物分離復雜等缺點。目前,關于反膠束體系及脂肪酶促催化反應合成日化產品的研究較廣泛[4-5]。脂肪酶具有界面活化現象,在反膠束體系中其催化活性既與酶和底物有關,也受反應介質影響[6]。曾家豫等[7]在陰離子 AOT 反膠束體系中利用脂肪酶催化合成了乙酸薄荷酯。目前關于在陽離子十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)反膠束體系中的酶促催化合成反應的研究較少。鑒于此,作者在構建的CTAB反膠束體系中,用脂肪酶催化山梨酸和乙醇合成山梨酸乙酯,采用單因素實驗對合成條件進行優化,并通過 GC-MS對產物進行鑒定。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

脂肪酶 (CRL,酶活700 U·mg-1),Sigma 公司;山梨酸(98%)、乙醇(99%)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB),高新區博鰲興旺實驗器材經營。

7980-5977B型GC-MS 氣質聯用儀,美國安捷倫公司;IS-RDS6 系列疊加式恒溫振蕩器,智祥(廣東)生物工程技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CTAB反膠束體系的構建

稱取 0.364 4 g CTAB溶于 10 mL 正庚烷中,制成 0.05 mol·L-1的CTAB溶液,加入一定 pH 值的緩沖溶液,振蕩至CTAB全部溶解,溶液呈透明狀,即為CTAB反膠束體系。

1.2.2 山梨酸乙酯的合成

將一定量的脂肪酶加入CTAB反膠束體系中,并按物質的量比5∶1加入乙醇和山梨酸,置于恒溫搖床上, 37 ℃、150 r·min-1反應36 h,得到反應液。

1.2.3 轉化率的測定[8]

采用酸堿滴定法分析反應液中山梨酸的剩余量。移取2.0 mL反應液加入25 mL錐形瓶中,滴加1滴酚酞指示劑,用0.05 mol·L-1氫氧化鈉溶液滴定,測定消耗的氫氧化鈉溶液體積(V1);移取2.0 mL未進行酯化反應的溶液,同法測定消耗的氫氧化鈉溶液體積(V0)。按下式計算酯化反應轉化率：

1.2.4 山梨酸乙酯的分離純化

將反應液抽濾去除酶粉;再向濾液中加入一定濃度的碳酸氫鈉溶液,用分液漏斗過濾,取上層液,重復操作,去除未反應的山梨酸和乙醇;采用硅油浴加熱蒸餾,使正庚烷(760 mmHg下沸點98.5 ℃)與目標產物山梨酸乙酯(760 mmHg下沸點195.5 ℃)分離,得到山梨酸乙酯。

1.2.5 色譜條件

采用7980-5977B型GC-MS氣質聯用儀,色譜柱(0.25 mm×30 m,0.25 μm);柱溫升溫程序：起始溫度60 ℃,保持 1 min;以20 ℃·min-1的速率升至220 ℃,保持 1 min;以10 ℃·min-1的速率升至280 ℃,保持3 min。進樣口溫度280 ℃,離子源溫度230 ℃,電子轟擊源(EI),掃描質量范圍30～500 amu。

2 結果與討論

2.1 反膠束體系中含水量W0的選擇

固定CTAB 反膠束濃度為0.05 mol·L-1、pH 值為7.0、山梨酸濃度為0.5 mol·L-1、n(乙醇)∶n(山梨酸)為5∶1、脂肪酶加量為5 mg、酶解溫度為37 ℃、反應時間為36 h,考察反膠束體系中含水量W0(反膠束體系中水與表面活性劑CTAB的物質的量比)對轉化率的影響,結果見圖 1。

由圖1可知,隨著反膠束體系中含水量W0的增加, 酯化反應轉化率先升高后降低;當含水量W0為10時,轉化率最高,為90%。這是因為,當含水量較少時,體系中自由水含量低,不能使脂肪酶處在活性構象狀態,導致酶活性不高,轉化率低;隨著含水量的增加,維持酶活性的水得到補充,酶活性升高,轉化率相應升高;而當含水量過多時,油水界面減小,一部分酶難與底物接觸,影響酶活力。因此,選擇反膠束體系中含水量W0為10。

圖1 反膠束體系中含水量W0對轉化率的影響Fig.1 Effect of water content W0 in reverse micelle system on conversion rate

2.2 pH值的選擇

固定CTAB反膠束濃度為0.05 mol·L-1、反膠束體系中含水量W0為10、山梨酸濃度為0.5 mol·L-1、n(乙醇)∶n(山梨酸)為5∶1、脂肪酶加量為5 mg、酶解溫度為37 ℃、反應時間為36 h,考察 pH 值對轉化率的影響,結果見圖 2。

由圖2可知,隨著pH值的增大,酯化反應轉化率先升高后降低;當pH值為7.0時,轉化率最高,為89%。這是因為,酶分子結構中含有許多酸、堿性氨基酸的側鏈基團, pH值影響側鏈基團的解離狀態,或者直接影響酶與底物的結合[9],影響酶活性,從而影響轉化率;而中性條件下,側鏈基團不會受到影響。因此,選擇pH值為7.0。

圖2 pH值對轉化率的影響Fig.2 Effect of pH value on conversion rate

圖3 山梨酸濃度對轉化率的影響Fig.3 Effect of sorbic acid concentration on conversion rate

圖4 n(乙醇)∶n(山梨酸)對轉化率的影響Fig.4 Effect of n(ethanol)∶n(sorbic acid) on conversion rate

2.3 山梨酸濃度的選擇

固定CTAB反膠束濃度為0.05 mol·L-1、反膠束體系中含水量W0為10、pH 值為7.0、n(乙醇)∶n(山梨酸)為5∶1、脂肪酶加量為5 mg、酶解溫度為37 ℃、反應時間為36 h,考察山梨酸濃度對轉化率的影響,結果見圖 3。

由圖 3 可知,當山梨酸濃度為 0.5 mol·L-1時,酯化反應轉化率最高,為 91%。因此,選擇山梨酸濃度為 0.5 mol·L-1。

2.4 n(乙醇)∶n(山梨酸)的選擇

固定CTAB反膠束濃度為0.05 mol·L-1、反膠束體系中含水量W0為10、pH 值為7.0、山梨酸濃度為0.5 mol·L-1、脂肪酶加量為5 mg、酶解溫度為37 ℃、反應時間為36 h,考察n(乙醇)∶n(山梨酸)對轉化率的影響,結果見圖 4。

由圖 4可知,隨著n(乙醇)∶n(山梨酸)的增大,酯化反應轉化率先升高后降低,當n(乙醇)∶n(山梨酸)為5∶1時,轉化率最高,為 94%。這是因為,體系中山梨酸過多,可能破壞脂肪酶的構象,使脂肪酶失活;體系中乙醇過多,可能對脂肪酶有抑制作用;另外,醇分子可通過其疏水性側鏈與脂肪酶活性中心周圍的非極性氨基酸相互作用,造成酶構象的局部改變,不利于其與酸分子的結合。因此,選擇n(乙醇)∶n(山梨酸) 為 5∶1。

2.5 酶解溫度的選擇

固定CTAB反膠束濃度為0.05 mol·L-1、反膠束體系中含水量W0為10、pH 值為7.0、山梨酸濃度為0.5 mol·L-1、n(乙醇)∶n(山梨酸)為5∶1、脂肪酶加量為5 mg、反應時間為36 h,考察酶解溫度對轉化率的影響,結果見圖5。

圖5 酶解溫度對轉化率的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on conversion rate

由圖 5 可知,隨著酶解溫度的升高,酯化反應轉化率先升高后降低,當酶解溫度為37 ℃時,轉化率最高,為 93.6%。這是因為,酶解溫度過低,底物分子的熱能降低,活化分子比例減少,轉化率偏低;酶解溫度過高,酶結構被破壞,酶活性降低,導致轉化率急劇下降。因此,選擇酶解溫度為37 ℃。

2.6 反應時間的選擇

固定CTAB反膠束濃度為0.05 mol·L-1、反膠束體系中含水量W0為10、pH 值為7.0、山梨酸濃度為0.5 mol·L-1、n(乙醇)∶n(山梨酸)為5∶1、脂肪酶加量為5 mg、酶解溫度為37 ℃,考察反應時間對轉化率的影響,結果見圖6。

圖6 反應時間對轉化率的影響Fig.6 Effect of reaction time on conversion rate

由圖 6可知,隨著反應時間的延長,酯化反應轉化率逐漸升高,當反應時間為36 h時,轉化率達到96.3%;繼續延長反應時間,轉化率趨于穩定。主要是由于,反應時間過長,一方面酶活性逐漸下降,另一方面產物的抑制作用增強。因此,選擇反應時間為36 h。

2.7 驗證實驗

在上述最佳合成條件下重復進行 3 組驗證實驗,測得酯化反應轉化率分別為95.4%、97.3%、96.2%,平均值為 96.3%,實驗穩定性好。證明最佳合成條件可靠。

2.8 產物的GC-MS分析

對CTAB反膠束體系中脂肪酶催化合成的產物進行GC-MS分析,得到的GC-MS圖譜(圖7)與鄭建永等[10]采用有機相脂肪酶催化合成的山梨酸乙酯的GC-MS圖譜基本相符,其中m/z=140.1為山梨酸乙酯的分子離子峰,推測產物為山梨酸乙酯。

圖7 產物的GC-MS圖譜Fig.7 GC-MS spectrum of product

3 結論

在CTAB反膠束體系中,以山梨酸和乙醇為原料,經脂肪酶催化合成了山梨酸乙酯,確定最佳合成條件如下：CTAB 反膠束濃度為0.05 mol·L-1、反膠束體系中含水量W0為10、pH 值為7.0、山梨酸濃度為0.5 mol·L-1、n(乙醇)∶n(山梨酸)為5∶1、脂肪酶加量為5 mg、酶解溫度為37 ℃、反應時間為36 h,在此條件下,酯化反應轉化率為 96.3%。該研究為山梨酸乙酯的開發及應用提供了理論依據。