臭氧處理對哈密瓜采后腐爛與細胞壁代謝影響

古麗丹·塔勒達吾，王雪，王新宇，畢瑩，李慧，馮雨蝶，吾孜木·馬那爾別克，王靜

（新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830052）

新疆哈密瓜（CucumismeloL.）屬葫蘆科甜瓜屬，厚皮甜瓜類，哈密瓜作為新疆主產水果之一，營養豐富、形態各異，具有增強身體免疫力、保護肝臟、延緩衰老等多種功效，近年來，備受消費者青睞。隨著果實的成熟，其細胞壁結構和組成發生改變，使其貯藏期縮短，對哈密瓜果實的經濟價值造成很大影響。許多學者對哈密瓜果實的軟化問題進行研究：陳新艷[1]研究表明，對哈密瓜進行1-甲基環丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）處理，能夠抑制多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、纖維素酶（cellulase，Cx）、果膠甲酯酶（pectin methylesterase，PME）、β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，β-Glu）等細胞壁代謝酶活性的升高和細胞壁物質的降解，從而延緩并抑制采后哈密瓜果實的軟化；曾媛媛等[2]采用1.5%羧甲基殼聚糖和1.5%海藻酸鈉2 種復合涂膜處理哈密瓜能夠保持較高果實硬度，維持較低PG 和Cx 活性，降低脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）活性，抑制哈密瓜果實軟化；呂雙雙等[3]以“網紋甜瓜”為原料，采用采前噴鈣和采后浸鈣的方法使鈣離子抑制細胞壁的降解、提高果實硬度，能夠有效延緩果實軟化的速度；但是關于臭氧處理延緩“西州蜜25 號”哈密瓜軟化方面的研究較少，據研究表明，150 mg/m3臭氧處理哈密瓜并在6 ℃低溫下貯藏，發現與對照組相比，處理組哈密瓜從貯藏3 d 時α-吡喃阿拉伯糖苷酶（α-LArabinofuranosidase，α-L-Af）、β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal）、PG 酶活性出現降低，說明臭氧處理能夠延緩哈密瓜果實采后軟化[4]。

臭氧（O3）是一種由3 個氧原子組成的氣體，因其有難聞的青草味而被熟知，從1840年被命名為Ozone 到現在應用到實際生產中已有180 多年的歷史。有研究表明，采用10 μL/L 臭氧處理番茄10 min 后發現處理組水溶性果膠較對照組減少20%，表明短期臭氧處理有助于減少果實軟化損傷[5]；另有研究表明，以“河套蜜瓜”為原料，采用5 ℃低溫貯藏結合150 μL/L 臭氧處理1.5 h 能夠使PG 酶活性降至較低水平，由此說明臭氧對果實PG 酶活性有一定的抑制作用[6]；但采用10 mg/m3臭氧處理對細胞壁代謝的影響研究較少。因此，本試驗以“西州蜜25 號”哈密瓜為試材，探究經臭氧處理哈密瓜果實軟化與細胞壁的關系，以期為臭氧在抑制哈密瓜果實采后軟化方面的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

哈密瓜：“西州蜜25 號”，新疆維吾爾自治區五家渠市商品瓜基地。采用臭氧發生器，在常溫（22.0±0.5）℃、濕度為45%的條件下測定指標。

3，5-二硝基水楊酸：上海科峰實業有限公司；結晶酚：天津市風船化學試劑科技有限公司；羧甲基纖維素鈉、碳酸鈉：天津市福晨化學試劑廠；亞硫酸鈉、一水合檸檬酸、二水合檸檬酸鈉：上海國藥集團化學試劑有限公司；水楊苷：上海素培生物科技中心；β-半乳糖苷、對硝基苯酚：北京索萊寶科技有限公司。以上所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

電子天平（PTT-A+200 型）：福州華志科學儀器有限公司；硬度計（GY-3 型）：上海精密儀器儀表有限公司；紫外分光光度計（752N 型）：上海儀電分析儀器有限公司；DW-25L92 低溫保存箱：海爾電器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DZKW-S-4 型）、電爐（FL-1 型）：北京市永光明醫療儀器有限公司；高速分散器（XHF-DY型）：寧波新芝生物科技股份有限公司；冷凍離心機（D3024R 型）：上海珂淮儀器有限公司；玻璃儀器氣流烘干器（C 型）：河南省予華儀器有限公司；臭氧發生器（HY-004S-4A）：廣州佳環科技有限公司；手持式折光儀（WZ-108 Brix）：上海亮研智能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 處理方法

以“西州蜜25 號”哈密瓜為試材，采摘2.0 kg 左右的果實，經手持式折光儀測得可溶性固形物含量為10%～12%。將每個果實套上泡沫網袋，每4 個果實裝入一個紙箱，及時運至專用冷庫（4～6 ℃）進行預冷12 h 后篩選出大小均一、無機械損傷、無病害、表面光澤的果實作為試驗原料。

哈密瓜洗凈后自然晾干，將瓜分為2 組，一組未用臭氧處理作為對照組，另一組為10 mg/m3臭氧處理組。處理時，將哈密瓜分批置于50 L 具有上通氣口的塑料桶中（塑料密封蓋用塑料膜和多層膠帶封口），開啟臭氧發生器，用濃度為10 mg/m3臭氧連續充氣4 h，一次放入10 個果實，對照組和臭氧處理組分別處理15 次，每組分別為150 個果實，每次處理間隔10 min。然后將2 組果實置于溫度為（22.0±0.5）℃、相對濕度為45%的常溫環境中。每3 d 取樣觀察并測定相關指標，每次取樣后不進行臭氧處理。測定相關指標時，每次每組隨機取3 個瓜，每個瓜重復測定3 次，每個指標重復測定3 次，共取樣6 次。

瓜皮處理：分別從臭氧處理組和對照組的每組瓜果實中心圈圍削取約2 cm 的瓜皮組織，迅速剁碎后立即用液氮冷凍，并在-40 ℃冰箱中保存備用，每個指標重復3 次。

1.3.2 腐爛相關指標測定

腐爛癥狀：從各組果實中分別隨機取10 個果實作為觀察果，觀察腐爛癥狀。

腐爛指數：參照陳存坤等[7]的方法測定，計算公式如下。

式中：W為腐爛指數；s為級數；n為該級數果實個數；T為總瓜數；H為最高等級數。

腐爛率計算公式如下。

式中：W為腐爛率，%；n為腐爛個數；T為總瓜數。

1.3.3 硬度

參照曹建康等[8]方法，用刀削去哈密瓜果皮后使用硬度計進行測定，單位kg/cm2。

1.3.4 原果膠含量的測定

采用曹建康等[8]的咔唑比色法。稱取1 g 的瓜皮組織于離心管中，加入95% 乙醇煮沸1 h，取出冷卻后，8 000×g離心15 min，倒掉上清液；含量測定按照半乳糖醛酸標曲的方法進行，得到半乳糖醛酸標準曲線方程為y= 0.190 4x- 0.020 4（R2= 0.998 5），半乳糖醛酸含量計算公式如下。

式中：L為半乳糖醛酸含量，%；m′為從標準曲線查得的半乳糖醛酸質量，μg；V為樣品提取液總體積，mL；VS為測定時所取樣品提取液體積，mL；m為樣品質量，g。

W=w1-w2

式中：W為原果膠含量，%；w1為果膠含量，%；w2為可溶性果膠含量，%。

1.3.5 可溶性果膠含量的測定

向1.3.4 剩余沉淀中加入5 mL 蒸餾水，水浴鍋加熱1 h，冷卻放置室溫22 ℃，8 000×g離心15 min 后，留存上清液。測定含量步驟同1.3.4。

1.3.6 多聚半乳糖醛酸酶活力的測定

采用曹建康等[8]的比色法測定。

1.3.7 β-半乳糖苷酶活力的測定

采用曹建康等[8]的方法測定β-半乳糖苷酶（β-Gal）活力。

1.3.8 纖維素酶活力的測定

采用曹建康等[8]的方法，稱取10 g 果皮組織，加入預冷的95% 乙醇研磨均勻，于4 ℃、12 000×g離心20 min，靜置10 min；倒掉上清液，繼續加入80%乙醇，12 000×g離心20 min 后靜置10 min；倒掉上清液，加入5 mL 提取液，12 000×g離心20 min 后靜置20 min，保留上清液。測得標準曲線為y= 2.266 1x+ 0.023 4（R2= 0.999 1）。

1.3.9 β-葡萄糖苷酶活力的測定

采用水楊苷水解法測定[8]，酶液提取步驟同1.3.8。

1.4 數據處理與分析

采用WPS Office 2020 軟件進行數據統計，Origin 2019 進行制圖，并使用SPSS 17 作顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 臭氧處理對哈密瓜腐爛癥狀和腐爛指數、腐爛率的影響

臭氧處理對哈密瓜腐爛癥狀和腐爛指數、腐爛率的影響見圖1～圖3。

圖1 哈密瓜常溫貯藏6 d 和15 d 的腐爛癥狀Fig.1 Symptoms of rot in Hami melon after 6 days and 15 days at room storage

圖2 臭氧處理對哈密瓜的腐爛指數的影響Fig.2 Effect of ozone treatment on decay index in Hami melon fruit

圖3 臭氧處理對哈密瓜的腐爛率的影響Fig.3 Effect of ozone treatment on decay rate of Hami melon fruit

腐爛可以直接反映臭氧處理對哈密瓜的貯藏保鮮效果，也是影響其品質評價的重要指標[9]。從圖1a 可以看出，哈密瓜常溫貯藏6 d 時，對照組的腐爛癥狀明顯比臭氧處理組嚴重；對照組果實的表皮出現小面積的腐爛，而臭氧處理組沒有出現腐爛；貯藏至15 d，對照組的腐爛情況加劇，果實表面出現皺縮、下陷等癥狀，而臭氧處理組果實腐爛情況較輕，只出現果實表皮皺縮的現象，未出現腐爛。

由圖2 可知，對照組果實的腐爛指數始終高于臭氧處理組；在貯藏第6 天，對照組果實開始出現腐爛，而臭氧處理組果實腐爛指數為0，未出現腐爛；貯藏第9 天對照組的腐爛指數逐漸上升，臭氧處理組也開始出現腐爛；貯藏9～18 d，對照組腐爛指數顯著高于臭氧處理組（P＜0.05）；結果表明，臭氧處理可顯著抑制哈密瓜腐爛指數上升。

由圖3 可知，臭氧處理組與對照組果實腐爛率逐漸上升，且貯藏過程中，對照組果實腐爛率始終高于臭氧處理組；臭氧處理組在貯藏第6 天腐爛率為0%，且從第6 天開始出現腐爛，隨貯藏時間延長，腐爛率上升幅度較小；對照組果實腐爛率呈上升趨勢，貯藏第3 天出現腐爛，隨后不斷上升，果實貯藏至6、9、12、15、18 d時，分別較臭氧處理組高30%、50%、60%、60%、90%，且存在顯著差異性（P＜0.05）；由此說明，臭氧處理對哈密瓜果實腐爛率具有抑制作用。

2.2 臭氧處理對哈密瓜硬度的影響

臭氧處理對哈密瓜硬度的影響見圖4。

圖4 臭氧處理對哈密瓜硬度的影響Fig.4 Effect of ozone treatment on hardness of Hami melon fruit

哈密瓜果實硬度是衡量哈密瓜成熟度和貯藏品質的重要指標，硬度下降主要是由水分的減少和細胞壁中果膠物質的降解引起[10]。由圖4 可以看出，隨著貯藏時間的延長，兩組哈密瓜在貯藏中期（6～9 d）、貯藏中后期（12～18 d）均呈快速下降的趨勢。在貯藏初期，哈密瓜果實的硬度為5.82 kg/cm2，貯藏結束時，對照組和臭氧處理組果實的硬度分別為2.12 kg/cm2和2.83 kg/cm2，較貯藏初值分別下降了63.6%和51.3%，臭氧處理組的硬度極顯著高于對照組（P＜0.01），表明臭氧處理可以有效延緩哈密瓜果實硬度的下降，減緩果實軟化速度。

2.3 臭氧處理對哈密瓜果實采后貯藏期間果皮原果膠含量的影響

臭氧處理對哈密瓜果實采后貯藏期間果皮原果膠含量的影響見圖5。

圖5 臭氧處理對哈密瓜果實采后貯藏期間果皮原果膠含量的影響Fig.5 Effect of ozone treatment on protopectin content of Hami melon fruit peel during storage

細胞壁物質結構是果實的重要組成部分，在果實成熟過程中能引起果實品質特性的變化，在一定程度上決定了果實的質地[11]；果膠主要存在于細胞壁的初生壁和中膠層中，對細胞壁結構的完整與穩定發揮至關重要的作用[12-13]。原果膠為非水溶性物質，含量越高，果實越堅挺。由圖5 可知，隨著貯藏時間的延長，兩組果實的原果膠含量均呈下降的趨勢，且臭氧處理組始終高于對照組，在貯藏前中期（0～9 d）兩組果實原果膠含量均下降，且貯藏第9 天臭氧處理組極顯著高于對照組（P＜0.01）；貯藏中后期（9～18 d）兩組果實整體均呈緩慢上升的趨勢，且貯藏12、15 d 臭氧處理組與對照組具有極顯著性差異（P＜0.01）；在貯藏初期果實的原果膠含量為1.17%，貯藏結束時臭氧處理組與對照組較初始分別下降38.24%和42.68%，且貯藏18 d 時臭氧處理組與對照組具有顯著性差異（P＜0.05）；由此說明，臭氧能夠有效抑制原果膠含量的降解，防止果實軟化。

2.4 臭氧處理對哈密瓜果實采后貯藏期間果皮可溶性果膠含量的影響

臭氧處理對哈密瓜果實采后貯藏期間果皮可溶性果膠含量的影響見圖6。

果實軟化最主要的原因是細胞壁結構被破壞，并隨著果實成熟，細胞壁的網狀結構不斷被瓦解，在細胞壁降解代謝過程中，果實中的原果膠含量逐漸減少，而可溶性果膠含量逐漸增加[14-15]。由圖6 可以看出，隨著貯藏時間的延長，兩組果實的可溶性果膠含量呈波浪上升的趨勢，且對照組的可溶性果膠含量始終高于臭氧處理組；兩組果實可溶性果膠含量在貯藏前中期（0～9 d）整體穩步上升，至貯藏后期（12～15 d）出現小幅度下降，且貯藏12、15 d 的對照組果實可溶性果膠含量顯著高于臭氧處理組（P＜0.05）；該結果與硬度下降得到延緩的結果一致（圖4），并與王偉等[16]得出的臭氧處理杏果實能夠降低果實可溶性果膠含量，保持果實硬度的結果相似；由此說明，臭氧能夠抑制可溶性果膠含量的增加，延緩果實軟化。

2.5 臭氧處理對哈密瓜果實采后貯藏期間果皮多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性的影響

臭氧處理對哈密瓜果實采后貯藏期間果皮PG 活性的影響見圖7。

在果蔬成熟軟化過程中，果膠降解與細胞壁降解酶存在密切聯系。多聚半乳糖醛酸酶主要通過作用于1，4-2-D-半乳糖苷鍵，使細胞壁發生解體，這可能是果實軟化過程中果實品質發生變化的重要原因[17]。由圖7 可知，兩組哈密瓜果實的PG 酶活性在貯藏前期（0～6 d）活性較低，且貯藏6～9 d 對照組出現小幅度下降，臭氧處理組出現小幅度上升；對照組果實PG 酶活性從貯藏第9 天開始明顯增強，且在貯藏第12 天出現高峰，為2 228 μg/（h·g）；貯藏末期（12～18 d），兩組果實PG 酶活性逐漸下降，貯藏第12 天和第15 天對照組PG 酶活性較臭氧處理組分別高21.8%和39.3%，且對照組果實PG 酶活性顯著高于臭氧處理組（P＜0.05）。由此說明，臭氧能夠抑制果實PG 酶活性上升，延緩果膠分解速度，維持鮮果貯藏過程中的細胞壁結構。

2.6 臭氧處理對哈密瓜果實采后貯藏期間果皮β-半乳糖苷酶（β-Gal）活性的影響

臭氧處理對哈密瓜果實采后貯藏期間果皮β-Gal活性的影響見圖8。

圖8 臭氧處理對哈密瓜果實采后貯藏期間果皮β-Gal 活性的影響Fig.8 Effect of ozone treatment on β-Gal activity of Hami melon fruit peel during storage

在果實成熟過程中，β-半乳糖苷酶（β-Gal）的活性易受到抑制，使細胞壁降解酶的活性隨之升高，細胞壁降解酶與β-Gal 之間存在一定的相互作用關系[18]。由圖8 可知，在整個貯藏期間，對照組果實β-Gal 活性始終高于臭氧處理組。貯藏前期（0～6 d）對照組果實β-Gal 活性逐漸增強，而臭氧處理組果實貯藏0～3 d 下降，隨后貯藏第3 天后活性開始增強；隨著貯藏時間延長，兩組果實β-Gal 活性在貯藏6～18 d 處于平緩趨勢，對照組貯藏6、9、12、15 d 的β-Gal 活性較處理組分別高0.39%、1.14%、0.92%、1.53%，且對照組在貯藏9～15 d 與臭氧處理組具有極顯著差異（P＜0.01）；由此說明，臭氧能夠抑制β-Gal 活性增強，達到延緩果實細胞壁分解速度的目的。

2.7 臭氧處理對哈密瓜果實采后貯藏期間果皮纖維素酶（Cx）活性的影響

臭氧處理對哈密瓜果實采后貯藏期間果皮Cx 活性的影響見圖9。

圖9 臭氧處理對哈密瓜果實采后貯藏期間果皮Cx 活性的影響Fig.9 Effect of ozone treatment on Cx activity of Hami melon fruit peel during storage

纖維素是細胞壁的骨架物質，能催化纖維素分解為葡萄糖和半纖維素，加速細胞壁的解體過程，促使果實成熟軟化[19]。Cx 可降解細胞壁中的纖維素，使細胞壁成分發生改變，進而影響果實的軟化。由圖9 可知，隨著貯藏時間的延長，貯藏前期（0～6 d）對照組Cx 活性下降，臭氧處理組Cx 活性增強；貯藏6～12 d 臭氧處理組Cx 活性逐漸減弱，隨后Cx 活性緩慢上升；而貯藏中后期（9～18 d）對照組Cx 活性整體升高，且貯藏9、12、15、18 d 較臭氧處理組分別高出19.1%、34.2%、22.9%、19.3%，具有極顯著差異（P＜0.01）；與張曉睛[20]所得出的采用2.4 mg/m3臭氧處理藍莓能夠抑制Cx 酶活性，延緩果實軟化的結果相似。由此說明，臭氧能夠降低Cx活性，并降低果實纖維素降解速度，維持細胞壁結構。

2.8 臭氧處理對哈密瓜果實采后貯藏期間果皮β-葡萄糖苷酶（β-Glu）活性的影響

臭氧處理對哈密瓜果實采后貯藏期間果皮β-Glu活性的影響見圖10。

圖10 臭氧處理對哈密瓜果實采后貯藏期間果皮β-Glu 活性的影響Fig.10 Effect of ozone treatment on β-Glu activity of Hami melon fruit peel during storage

β-Glu 屬于纖維素酶類，對果實細胞壁的降解與穩定產生重要影響[21]。由圖10 可知，整個貯藏期間，對照組β-Glu 活性始終高于臭氧處理組；對照組β-Glu活性整體呈逐漸增強的趨勢，而臭氧處理組β-Glu 活性變化波動較大；貯藏前期（0～6 d）臭氧處理組β-Glu活性較低，在貯藏第9 天和第15 天出現高峰，貯藏第9 天對照組β-Glu 活性較處理組高9.3%，貯藏后期（15～18 d）對照組β-Glu 活性逐漸降低。對照組β-Glu活性在貯藏3～12 d 極顯著高于臭氧處理組（P＜0.01），由此說明，臭氧可以抑制β-Glu 活性的上升，延緩纖維素降解速度，保持果實細胞壁堅固，防止軟化，該結論能夠在果實硬度變化趨勢得到證明。

3 結論

結果表明，臭氧能夠抑制哈密瓜PG、β-Gal、Cx、β-Glu 與果實軟化相關酶活性的上升，延緩原果膠的降解和果實硬度的下降，一定程度上抑制可溶性果膠含量的上升，從而抑制果實軟化。結果表明，臭氧能夠在一定程度上抑制細胞壁降解酶對果膠的降解，從而維持細胞壁堅挺，達到延緩軟化的目的并延緩果實腐爛。