陸生蔬菜浮床對富營養化水體氮磷的去除以及水體、根系細菌群落分析

周佳林,段婧婧,王 寧,李 明,陳小鋒,薛利紅 〔.揚州大學環境科學與工程學院,江蘇 揚州 5009;.江蘇省農業科學院農業資源與環境研究所/江蘇省食品質量安全重點實驗室(省部共建國家重點實驗室培育基地),江蘇 南京 004〕

城市化導致湖泊氮、磷富集,造成湖泊水體富營養化,且富營養化水體會危害人體健康和破壞生態環境。生態環境部發布的2022年《第二季度和1—6月全國地表水環境質量狀況》中指出,在194個監測湖泊中,中度富營養12個,占6.2%;輕度富營養37個,占19.1%;其余湖(庫)為中營養或貧營養狀態[1]。因此,現階段針對中度富營養及以下程度富營養水體的修復十分重要。

生態浮床主要用于富營養化水體的原位修復,因其具有成本低廉、應用廣泛和便于管理維護的特點而備受歡迎[2]。生態浮床的主要機理是運用植株生長對營養元素的吸收作用以及植株根系富集的微生物代謝作用,達到去除水體中污染物質的目的。植株選擇對生態浮床系統的凈化效果至關重要[3]。傳統的浮床植物常選用水生植株[4]。陸生植株根系發達,較水生植株更耐污,且化感作用更強,能夠抑制藻類生長[5-6]。WANG等[7]提出陸生植物也可以作為浮床植物的觀點。研究[8-9]表明,陸生植株在人工濕地系統中能夠正常生長,且對氮、磷物質具有較好的去除效果。因此,應用陸生植株作為浮床植物凈化水質,有很好的發展前景。

微生物群落可反映水生態系統化學循環過程,并與水體水質情況具有一定聯系[10]。16S rDNA高通量測序和定量 PCR(qPCR)相結合的技術是較為常用的水體微生物群落結構和功能基因的測試手段[11]。本地生長的蔬菜、花卉對周邊環境適應性強,不存在物種入侵風險,且兼具經濟效益和景觀性。同時,陸生蔬菜具有豐富的根系微生物群落,但在水環境中培育時,陸生蔬菜對水體環境的適應性和根系表面微生物的影響尚不清楚。因此,根據地域特點,挑選江浙一帶較為常見、易于水培的陸生蔬菜青菜和生菜,利用高通量及功能基因結合手段,探究陸生蔬菜浮床體系對富營養化水體氮、磷凈化效果以及對根系微生物群落結構和反硝化作用的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗采用160 L水箱(上部770 mm×560 mm,底部630 mm×430 mm,高460 mm)和管徑為10 mm的PVC管(35 mm×45 mm)定制浮床框架,在其上鋪漁網,加定植籃筐(25 mm×31 mm×45 mm)12個作為浮床植株的載體。試驗裝置見圖1。

圖1 試驗裝置Fig.1 Experimental installation diagram

試驗水體來源于江蘇省農業科學院水塘,初始水質指標:ρ(TN)為5.1 mg·L-1,ρ(TP)為0.1 mg·L-1,ρ(NH4+)為0.2 mg·L-1,ρ(NO3-)為2.3 mg·L-1,pH為9.03,ρ(DO)為16.3 mg·L-1,電導率(SPC)為362.8 μS·cm-1,用純水稀釋3倍將水體ρ(TN)和ρ(TP)調節至約1.5和0.05 mg·L-1。從市場購買江浙一帶具有耐寒性的常見蔬菜青菜、水芹和生菜用于開展后續試驗。

1.2 試驗方法

試驗前洗凈根部蔬菜,在試驗水體(120 L)中預培養14 d,待穩定后,正式開始植株試驗。正式試驗于2022年4月20至5月3日進行。設3個處理組和1個對照組,每組設3個重復。試驗分為2個階段,試驗第1～6天為第1階段,第7～13天為第2階段。試驗期間,分別于試驗1、3、5、7、9、11和13 d時取樣,每次取樣前補充一定量的純凈水至初始刻度,防止蒸發造成的影響。從3 d時開始,每2 d補充一次營養鹽,TN和TP補充量分別為0.2和0.012 mg·L-1。

1.2.1植株樣本的采集

試驗前后稱量植株鮮重,且試驗前每個處理另取與之相同鮮重的植株,用于得到試驗前干重和體內營養物質背景值。將烘干的植株樣磨碎、過篩,并于105 ℃條件下殺青30 min,于60 ℃烘箱烘干至恒重。稱取干重為0.1～0.2 g植株用于體內全氮、全磷的測定。試驗后測量根系長度。

1.2.2水樣的采集

采用五點法取100 mL水樣用于營養鹽的測定。

1.2.3根系水體及根系微生物的采集

用無菌針頭于試驗1(前期)、7(中期)和13 d(后期)時抽取根系附近水體90 mL,用無菌0.22 μm孔徑濾膜抽濾后,放入2 mL無菌離心管中,存于-80 ℃冰箱中。試驗結束后用無菌剪刀取植株根系5 g(鮮重),將無菌水沖洗后的根系置于裝有0.1 mol·L-1PBS緩沖液的50 mL無菌離心管中,超聲洗滌10 min,再用0.22 μm濾膜抽濾、保存,用于微生物反硝化功能基因和細菌群落多樣性的測定。

1.3 試驗指標的測定

1.3.1植株氮、磷的測定

植株體內總氮濃度經H2SO4-H2O2消煮,采用凱氏定氮儀測定?？偭诐舛冉汬2SO4-H2O2消煮,采用電感耦合等離子光譜發射儀(ICP)測定。

1.3.2水質指標的測定

pH、水溫、溶解氧(DO)濃度、電導率(SPC)等水質指標采用便攜式水質檢測儀原位測定。水體總氮濃度采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法(HJ 636—2012《水質 總氮的測定 堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法》)測定,總磷濃度采用鉬酸銨分光光度法(GB/T 11893—1989《水質 總磷的測定 鉬酸銨分光光度法》)測定,氨態氮濃度采用紫外分光光度法測定,硝態氮濃度采用靛酚藍比色法測定。

1.3.3DNA提取與PCR擴增

微生物基因委托北京奧維森基因科技有限公司測定。測定方法:使用超純總DNA提取試劑盒進行DNA提取,對微生物進行PCR擴增,擴增引物為ACTCCTACGGGAGGCAGCAG和GGACTACHVGGGTWTCTAAT,擴增區間為V3～V4區。nirK、nirS、nosZ和norB功能基因Real Time PCR檢測引物為nirK(FlaCu-R3Cua):上游引物為ATCATGGTSCTGCCGCG,下游引物為GCCTCGATCAGRTTGTGGTT;nirS(cd3a-R3cd):上游引物為GTSAACGTSAAGGARACSGG,下游引物為GASTTCGGRTGSGTCTTGA;nosZ:上游引物為CGYTGTTCMTCGACAGCCAG,下游引物為CGSACCTTSTTGCCSTYGCG;norB:上游引物為GGNCAYCARGGNTAYGA,下游引物為ACCCANAGRTGNACNACCCACCA。

PCR擴增條件為94 ℃(5 min)預變性后,94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,共30個循環,最后72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增結果。將合格PCR產物按照樣本測序量要求進行相應比例的混合,采用MiSeq測序儀進行高通量測序分析。

1.4 指標計算

(1)植株相對生長速率(RGR)的計算

(1)

式(1)中,Wt為t時間植株干重,g;Wt+1為t+1時間植株干重,g;t為實驗培養時間,d;RRG為植株相對生長速率,g·g-1·d-1;

(2)N、P污染負荷去除率的計算

(2)

式(2)中,C0為N或P營養鹽添加濃度,mg·L-1;Ci為N或P初始濃度,mg·L-1;Cj為N或P最終濃度,mg·L-1;n為N或P營養鹽添加次數;V0為初始水體體積,L;V為添加營養鹽后水體體積,L;w為N或P污染負荷去除率,%;

1.5 數據處理

試驗數據采用SPSS 26.0進行描述和方差分析,采用Duncan法進行差異顯著性分析(P<0.05),采用Origin 2021制圖;功能基因和環境因子相關性分析采用皮爾遜相關性分析(P<0.05,P<0.01)。MiSeq測序得到的PE reads序列首先根據overlap關系進行拼接,同時進行質控和過濾序列質量,區分樣本后進行OTU聚類分析和物種分類學分析,基于OTU聚類分析結果,計算α多樣性〔Chao1、覆蓋率(observed_species)、Shannon、Simpson〕。α多樣性、β多樣性和偏最小二乘辨別分析(PLS-DA)聚類計算均使用QIIME流程,采用R語言繪圖。

2 結果與分析

2.1 植株生物量和根系變化

3種植株試驗前后生物量變化情況見表1,其中,青菜生物量增加量最大,平均增重57.477 g;水芹次之,平均增重55.500 g;生菜增加量最小,平均增重14.743 g。試驗后水芹處理組鮮重與生菜處理組呈顯著差異(P<0.05)。植株相對生長速率由高到低依次為青菜、水芹和生菜,并呈顯著差異(P<0.05)。而收獲時水芹根系長度顯著高于青菜和生菜(P<0.05)。

表1 植株物理指標Table 1 Physical indicators of plants

由表2可知,與試驗前相比,試驗后青菜體內全氮、全磷含量顯著下降(P<0.05),水芹和生菜體內全氮含量顯著下降(P<0.05),試驗后各處理間無顯著差異。由表3可知,青菜和生菜處理氮凈去除量(75.720～81.460 mg)高于對照和水芹處理(47.360～50.320 mg),青菜處理組植株吸氮量高于水芹處理組,生菜處理組其他吸氮量最大。

表2 植株體內營養元素濃度Table 2 Concentration of nutrients in the plants

表3 各處理氮平衡分析Table 3 Analysis of nitrogen balance in the treatments

2.2 水體水質氮磷濃度變化及去除率

如圖2所示,水體溫度維持在16～27 ℃,以第9天為分界點呈現先下降后上升趨勢。水體pH維持在9～11,并呈上升趨勢,前9天對照組最高。DO濃度和SPC變化趨勢相同,均以第5天為分界點呈現先下降后上升趨勢。前7天水芹和青菜處理組DO濃度低于生菜和對照組,后期生菜DO濃度較其他處理組低。生菜處理組SPC一直較低,后期各處理組SPC由高到低依次為水芹、青菜、對照和生菜。

DO為溶解氧,SPC為電導率。圖2 水質物理指標Fig.2 Physical indicators of water quality

2.2.1水體氮磷濃度變化及去除率

水中營養物質濃度變化分為2個階段(圖3)。如圖3(a)所示,蔬菜浮床經第1階段培養后,除水芹處理組外,青菜和生菜處理組TN濃度明顯下降,蔬菜處理組TN濃度均低于對照組。進入第2階段后,蔬菜處理組和對照組TN濃度有所累積,且對照組TN高于蔬菜處理。如圖4(a)所示,在組內水平上,各組試驗第1階段TN污染負荷去除率與第2階段無明顯差異。而在組間水平上,第1階段水芹處理組TN污染負荷去除率與生菜處理組間差異顯著(P<0.05)。2個階段TN平均負荷去除率從高到低依次為生菜(33.93%)、青菜(31.20%)、對照(24.41%)和水芹(9.05%)。

如圖3(b)所示,經第1階段培養后,蔬菜處理組水體TP濃度下降,而對照組出現TP累積現象,導致對照組TP濃度高于其他處理組。進入第2階段后,陸生蔬菜處理組TP濃度于試驗11 d時急劇累積,之后快速下降,其中,只有青菜處理組TP濃度高于對照組。如圖4(b)所示,第1階段處理組TP污染負荷去除率與對照組有顯著性差異(P<0.05),且隨著試驗的進行,青菜和水芹處理組TP污染負荷去除率下降,生菜處理組去除率相對穩定,而對照組去除率上升。結合第1和第2階段結果,水芹、生菜和青菜處理組TP負荷平均去除率(57.13%、46.91%和40.86%)優于對照組(25.46%)。

如圖3(c)所示,經第1階段培養后,蔬菜處理組NO3-濃度有所累積,而對照組NO3-濃度降低,各處理組水體NO3-濃度由高到低依次為生菜、對照、水芹和青菜。進入第2階段培養后,各處理組NO3-濃度呈累積趨勢,最終對照組NO3-濃度最高,生菜處理組NO3-濃度最低。如圖4(c)所示,各處理組NO3-污染負荷去除率無明顯差異。2個階段NO3-負荷平均去除率由高到低依次為青菜(39.96%)、對照(39.71%)、生菜(31.19%)和水芹(30.99%)。

試驗期間未添加任何形式的銨鹽。如圖3(d)所示,經第1階段培養后,各處理組NH4+濃度明顯下降,對照組NH4+濃度略高。進入第2階段培養后,青菜處理組NH4+濃度有所累積,這與其他處理組變化趨勢相反。試驗結束時,水芹處理組NH4+濃度最低。如圖4(d)所示,第2階段青菜處理組NH4+污染負荷去除率(-36.02%)與其他處理組呈顯著差異(P<0.05)。2個階段水芹處理組(51.30%)和生菜處理組(48.16%)NH4+負荷平均去除率明顯高于對照組(27.23%)和青菜處理組(5.17%)。

2.3 微生物群落結構及基因豐富度分析

2.3.1微生物群落結構

試驗結果共提取23 360條有效序列,經抽平處理獲得4 421個OTU。由表4可知,各處理組OTU數量在試驗中期達到峰值,試驗末期OTUs較初期高。

表4 各處理組OTUs數量Table 4 Details of OTUs in each process

由圖5可知,試驗結果表明,屬水平上發現15種優勢菌屬,包括黃桿菌屬(Flavobacterium)、棲湖菌屬(Limnohabitans)、產卟啉桿菌屬(Porphyrobacter)、Cyanobium_PCC-6307、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、多核桿菌屬(Polynucleobacter)、UKL13-1、嗜湖水橙色桿狀菌(Sandarakinorhabdus)、紅桿菌屬(Rhodobacter)、噬氫菌屬(Hydrogenophaga)、Schrenkiella_parvula、玫瑰單胞菌(Roseomonas)、Pseudanabaena_PCC-7429、大不里士桿菌屬(Tabrizicola)和玫瑰球菌屬(Roseococcus)。

Bra為青菜處理,Oja為水芹處理,Lsa為生菜處理,Ctr為對照;1、7和13表示不同采集天數水樣;R表示第13天蔬菜根系。圖5 屬水平物種組成Fig.5 genus level species composition

黃桿菌屬相對豐度在蔬菜根系明顯低于蔬菜根系周圍水體(P<0.05)。在試驗全程,青菜、水芹處理組黃桿菌屬相對豐度下降。試驗結束后,蔬菜處理組黃桿菌屬相對豐度低于對照組。棲湖菌屬相對豐度以對照組為較大,在試驗全程相對豐度呈現下降趨勢,其中,試驗1和7 d時對照組棲湖菌屬相對豐度明顯高于其他處理組(P<0.05)。產卟啉桿菌屬和UKL13-1相對豐度在水芹根系周圍水體中明顯增加(P<0.05)。對照組多核桿菌屬、嗜湖水橙色桿狀菌相對豐度較高,且在試驗末期明顯高于其他(P<0.05)。

在試驗后期青菜根系周圍水體及根系表面Cyanobium_PCC-6307相對豐度高于其他處理組(P<0.05)。芽單胞菌屬相對豐度在青菜根系周圍水體以及水芹和生菜根系表面最高(P<0.05)。各蔬菜根系紅桿菌屬相對豐度明顯高于根系周圍水體和對照組(P<0.05)。在試驗全程,對照組噬氫菌屬相對豐度均明顯低于其他處理組(P<0.05),且以水芹、生菜根系為最高(P<0.05)。青菜和水芹根系玫瑰單胞菌和玫瑰球菌屬相對豐度明顯高于根系周圍水體(P<0.05)。生菜根系Pseudanabaena_PCC-7429相對豐度明顯高于其他處理組(P<0.05)。試驗后期,大不里士桿菌屬相對豐度在青菜、水芹根系水體及根系表面明顯高于其他處理組(P<0.05)。

2.3.2微生物群落豐富度和物種多樣性

(1)α群落多樣性

由表5可知,試驗過程中水芹處理組微生物群落豐富度最高,對照組微生物群落豐富度最低。試驗過程中,微生物群落豐富度于7 d時達到峰值后下降,但在試驗末期各處理組微生物群落豐富度較1 d時增加。各處理組蔬菜根系微生物群落豐富度由大到小依次為水芹、生菜和青菜。Shannon和Simpson指數用來估算樣本中微生物多樣性,Shannon和Simpson指數值越大,說明群落多樣性越高。根據Shannon和Simpson指數可知,試驗初期水芹處理組微生物多樣性最高,試驗第7天生菜處理組物種多樣性最高,試驗結束時水芹處理組物種多樣性最高,對照組物種多樣性在試驗全程均為最低。試驗過程中,青菜處理組微生物多樣性持續升高,水芹處理組先減少后增加,生菜處理組和對照組先升高后降低。除對照組外,試驗結束時蔬菜處理組微生物群落多樣性指數均比試驗初期有所增加。各蔬菜根系微生物多樣性由大到小依次為水芹、生菜和青菜。

表5 α多樣性指數Table 5 Alpha diversity index

(2)β群落多樣性

各樣本間的距離表示樣本間的差異性,距離越近則越相似,距離越遠則差異越大。由圖6(a)可知,各個根系處理組與各個水體處理組樣本距離遠,說明根系和水體的組成有差異,其中水芹根系處理組和青菜根系處理組的距離近,其相似度高。對照中期、生菜中期、生菜末期、水芹前期和水芹末期樣本點分布分散,且離其他樣本點較遠。

Bra為青菜處理,Oja為水芹處理,Lsa為生菜處理,Ctr為對照。1、7和13表示不同采集天數水樣;R表示第13天蔬菜根系。T為溫度,DO為溶解氧,SPC為電導率,TN為總氮,TP為總磷。圖6 β多樣性指標偏最小二乘辨識分析(PLS-DA)和環境因子冗余分析(RDA)Fig.6 β diversity index PLS-DA and environmental factor analysis RDA

(3)微生物群落與環境因子影響因素分析

由圖6(b)可知,環境因子對微生物群落的解釋為68.7%。pH、NH4+和水溫(T)對微生物群落的影響較為明顯,黃桿菌屬和棲湖菌屬與NH4+、T、TN和DO呈現正相關,紅桿菌屬和Cyanobium_PCC-6307與pH、SPC、TP和NO3-呈現正相關。

2.3.3微生物功能基因豐度與環境因子相關性分析

(1)功能基因豐度

各處理組根系及其周圍水體微生物功能基因(nirK、nirS、nosZ、和norB)拷貝數分析結果見圖7。由圖7(a)可知,對照組水體中nirK基因拷貝數較其他處理組高,且7 d時對照組水體中和13 d時水芹根系nirK基因拷貝數顯著高于其他處理組(P<0.05)。由圖7(b)可知,試驗后期青菜處理組水體中nirS基因拷貝數增加較多,青菜根系表面富集nirS基因拷貝數顯著低于其他處理組(P<0.05)。nosZ和norB基因拷貝數變化趨勢與nirS基因相同,均呈現13 d時基因拷貝數比1 d時增加的趨勢〔圖7(b)～(d)〕。

同一幅圖中,同一組柱子上方英文小寫字母不同表示同一條件下不同處理間某指標差異顯著(P<0.05)。誤差線為標準誤。1、7和13表示不同采集天數水樣,13-R表示第13天蔬菜根系。圖7 不同處理組根系及周圍水體基因豐度Fig.7 Abundance of functional genes in roots and surrounding water of different vegetable treatments

(2)功能基因與環境因子相關性分析

各功能基因與環境因子的相關性分析結果見表6。nirK基因與TN、NO3-分別呈顯著正相關(P<0.05)和極顯著正相關(P<0.01);nirS、nosZ和norB基因僅與環境因子T呈顯著相關(P<0.05);nirS、nosZ和norB基因兩兩之間呈極顯著相關(P<0.01)。

表6 反硝化功能基因與環境因子之間皮爾遜相關性Table 6 Pearson product-moment correlation coefficient between denitrification function genes and environmental factors

3 討論

3.1 環境參數與氮磷的變化

水質參數是評判生態環境是否健康的重要特征指標。試驗水體初始pH呈堿性(圖2),水體中有藻類和浮游動物存在,推測水中藻類的光合作用導致pH過高[12]。在試驗前期,水體pH有所下降,這可能是由于在試驗初期微生物硝化作用活躍,產生大量H+,使水體pH降低[13]。同時,根據皮爾遜相關性分析結果(表6)可知,高pH可以降低水中NH4+濃度,這與化學平衡結果一致。水體DO濃度呈現先下降后上升趨勢(圖2),這是由于水體DO濃度與空氣中氧氣和藻類光合作用有關,溫度驟降會導致DO濃度突然下降[14]。同時,微生物迅速增長也會導致水體DO濃度下降。隨著試驗的進行,水體微生物代謝水平相對穩定,植株根系泌氧功能增強,導致DO濃度回升[15]。

大量研究表明,N、P循環主要包括3個部分:外界環境、底泥釋放、大氣沉降和生物固氮等途徑的源過程;植物吸收、反硝化等途徑的去除過程;生物吸收和排泄、硝化作用、微生物分解等途徑的遷移和轉化過程[16-17]。蔬菜浮床對水體N凈化能力有差異,這是由于植株本身生理特性差異造成的。陸生蔬菜的青菜、生菜對TN的去除效果明顯好于水芹(P<0.05),造成這一現象的原因可能是由于陸生蔬菜在水培時,由于生存環境改變,陸生蔬菜急需大量營養元素,而水芹作為濕生植物在水體中適宜性較強。所需營養元素含量不同導致青菜和生菜對TN的去除效果較好。與此同時,在低營養水體環境中,植株為了維持自身生命體征,當水中營養鹽不能滿足代謝要求時,植株消耗體內營養物質導致體內營養鹽含量下降。

除此之外,植株根系泌氧是影響水體中氮去除的重要因素。根系泌氧功能主要通過改善脫氮微生物生存環境、影響脫氮微生物群落結構與活性、維持硝化反應所需的好氧環境等方式,從而起到促進脫氮的效果[18]。此外,植物在生長過程中,會分泌根系分泌物,為浮床系統提供內在碳源[19]。鄧泓等[20]通過研究10種濕地植株根系泌氧特征,發現水芹根部任意部位均具有較高的泌氧速率,其根部存在發達的通氣組織。嵇慶才等[21]發現水稻在土培、水培中生物形態有所不同,土培會促進葉片生長,而水培會促進根系生長。筆者研究結果表明,水芹根系茂盛、長且粗大,青菜和生菜根系長度相差不大,其中,生菜須根多,根表面積較大,這可能是生菜生物量較小但其根系微生物豐度較高的原因。這說明陸生植株水培后會促進其根部生長,根系泌氧功能在一定程度上會得到增強,從而提高其脫氮能力。試驗后期植株生長狀態相對穩定,N、P吸收能力有所下降。對照組在試驗前期對NH4+去除能力較好,這可能與藻類生長和微生物代謝有關[22]。因此,陸生蔬菜的青菜、生菜通過植物吸收和改變微生物豐度作為氮素去除的主要方式,整體脫氮效果與水芹相當。

3.2 蔬菜浮床對微生物物種多樣性的影響

筆者試驗中黃桿菌屬(Flavobacterium)、棲湖菌屬(Limnohabitans)、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、紅桿菌屬(Rhodobacter)和噬氫菌屬(Hydrogenophaga)等屬為優勢物種,具有較高的豐度(>0.08%),且能夠參與氮轉化過程。

硝化作用是去除水中NH4+的重要途徑,研究發現棲湖菌屬在淡水系統廣泛分布,具有可以代謝多種底物的能力,部分菌種具有二氧化碳固定作用、光合作用和氨氧化等多種代謝功能[18]。對照組水體中棲湖菌屬相對豐度在試驗前期較高,且其去除NH4+的效果較好;在試驗開展后其相對豐度明顯下降(P<0.05),水體NH4+的去除能力也明顯下降。這與劉明坤[23]發現NH4+與棲湖菌屬呈正相關的結論一致。在試驗后期對照組水體NH4+濃度較高可能與硝酸鹽異化還原為氨有關[24]。而在試驗初期和后期蔬菜浮床處理水體棲湖菌屬相對豐度較低,但對NH4+的去除效果較好,這說明蔬菜浮床系統的脫氮方式較為多樣且可以抑制硝酸鹽異化還原為氨的過程。

研究[25-29]發現,黃桿菌屬、紅桿菌屬和噬氫菌屬都屬于典型的反硝化菌屬,其中,黃桿菌屬具有厭氧硝化、好氧反硝化的作用。LIU等[30]在曝氣濾池中發現了氮氧化菌類的黃桿菌屬具有較高豐度。筆者試驗結果表明,對照無蔬菜處理組黃桿菌屬相對豐度較高,對TN、NO3-的去除效果較好。同時,各處理組水體中黃桿菌屬相對豐度較高。紅桿菌屬對氮、磷及有機物具有較好的去除效果[28],筆者試驗結果表明其豐度在陸生蔬菜根系表面和水芹根系周圍水體中較高,且對NO3-的去除效果較好。這說明蔬菜浮床可以利用水體中黃桿菌屬和蔬菜根系表面的紅桿菌屬進行反硝化脫氮。

其次,在凈化低污染水體、富營養化湖泊和人工濕地過程中,由于低C/N比對反硝化過程具有限制作用,水體會出現許多自養反硝化過程(硫自養反硝化、鐵自養反硝化和氫自養反硝化)[31]。其中,氫自養反硝化過程主要消耗H2和NO3-。GAO等[32]在低C/N比(C/N比為2∶1)條件下,通過電解強化手段將人工濕地中噬氫菌屬相對豐度從6.0%提升至24.3%。說明富營養化水體在缺少碳源條件下,水中H2可被用作電子供體,使噬氫菌屬以氫自養方式進行反硝化。筆者試驗也發現,在水芹和生菜根系表面具有氫自養功能的噬氫菌屬相對豐度(分別為5.67%和5.73%)顯著高于其他菌屬(P<0.05)。此外,許多水體和土壤環境也均發現芽單胞菌屬的存在。ZHANG等[33]從芽單胞菌屬中檢測出與反硝化和碳固定相關的基因。芽單胞菌屬攜帶nosZ基因,可以通過反硝化作用減少N2O,將N2O轉化為N2[34]。筆者試驗中芽單胞菌屬主要分布于水芹、生菜根系表面,通過反硝化作用將N2O轉化為N2。筆者試驗結果表明生菜根系微生物豐富,這說明生菜浮床不僅能夠通過顯著增加氫自養反硝化的方式來脫氮,還可以實現完全反硝化以減少溫室氣體的產生。

3.3 浮床蔬菜對反硝化微生物的影響

水體中反硝化作用主要是NO3-經硝酸鹽還原酶(nitrate reductase,Nar)催化為NO2-,其次經亞硝酸鹽還原酶(nitrite reductase,Nir)催化成NO,再次經氧化氮還原酶(nitric oxide reductase,Nor)催化成N2O,最后經氧化亞氮還原酶(nitrous oxide reductase,Nos)催化成N2的過程[35]。nirK基因的催化過程是將亞硝酸鹽轉化為氧化氮,這是反硝化作用有別于其他硝酸鹽代謝的標志性反應,該基因編碼的亞硝酸鹽還原酶是催化該反應的限速酶,nirK和nirS基因編碼催化產物是NO和N2O混合物[36]。

筆者研究結果表明,各處理組nirK基因拷貝數是nirS基因的10倍以上,這是由于nirK基因更多存在于細菌中,且兩者不能共存[37]。對照組nirK基因處于優勢,這對硝酸鹽降解起到一定作用,這與對照組NO3-的去除結果保持一致。其次,在試驗后期,水芹和生菜根系表面nirK基因豐度遠高于各自周圍水體。這表明水芹、生菜根系表面會聚集nirK基因,使反硝化微生物大量繁殖,以此來增強對NO3-的去除。筆者試驗結果還顯示,水芹和生菜根系表面nirS和norB基因豐度較高,而青菜根系周圍水體中這兩個基因豐度較高,這說明不同于水芹和生菜浮床系統,青菜浮床系統主要依賴于水體中具有反硝化功能的基因來促進反硝化過程。

nosZ基因可以將N2O催化成N2后排放出去,這是減少溫室氣體排放的關鍵步驟。而在某些含有nir和nor基因的細菌和古菌中,往往缺失nos基因,使得反硝化過程終產物為N2O[34]。此外,研究[38]發現,nirS型反硝化菌往往攜帶nosZ基因(CupriaviduseutrophaJMP134除外),這可能是nosZ與nirS基因變化趨勢相同但其相對豐度較小的原因。筆者試驗中,在青菜根系周圍水體以及水芹和生菜根系表面都發現較高相對豐度的nosZ基因,這說明蔬菜浮床系統有利于進行完整的反硝化過程,從而有效減少水體中溫室氣體的產生。

4 結論

(1)蔬菜浮床系統中水芹生物量最大,植物根系發育最好,而青菜生長速率顯著較高,且具有較好的氮磷去除潛力。但是,試驗結束時3種蔬菜體內全氮、全磷含量均有所下降。

(2)在富營養化水體環境中,蔬菜浮床系統對TN、TP和NH4+去除效果較好,這可能與根系表面或周圍水體中富集的優勢菌種分布有關。

(3)分布于水芹、生菜根系表面的噬氫菌屬會通過增加氫自養反硝化的方式增強反硝化作用,其表面富集的芽單胞菌屬能將N2O轉化為N2以減少溫室氣體排放。

(4)蔬菜浮床系統中nirS、norB和nosZ基因相對較多,這表明蔬菜浮床系統可以實現更徹底的反硝化。