土壤環(huán)境中抗生素抗性基因污染研究進(jìn)展和熱點(diǎn)分析

李澤楷,韓 淼,秦 超,胡小婕,高彥征 (南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土壤有機(jī)污染控制與修復(fù)研究所,江蘇南京 210095)

自1943年青霉素被應(yīng)用于臨床以來,人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過9 000種抗生素,這些抗生素被大量運(yùn)用于人類疾病治療和畜禽養(yǎng)殖[1]。隨著抗生素的大量生產(chǎn)及使用,其在環(huán)境中的殘留水平逐漸升高,這對(duì)細(xì)菌形成選擇壓力,從而促進(jìn)抗藥性的產(chǎn)生和傳播,隨之產(chǎn)生一種新的環(huán)境污染物——抗生素抗性基因(antibiotics resistance genes,ARGs)[2]。ARGs來源豐富,環(huán)境分布廣泛。ARGs主要污染源包括醫(yī)院廢水、畜牧業(yè)廢水和城市污水處理廠污水等[3]。ARGs可在不同環(huán)境介質(zhì)中遷移、轉(zhuǎn)化,目前已遍布于水、土壤和大氣中。ARGs還可通過食物鏈進(jìn)一步侵入人體,對(duì)人類健康造成潛在危害。近年來,有關(guān)ARGs來源、傳播和分布的科學(xué)問題已受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

土壤是抗生素和ARGs最大的受納體之一,養(yǎng)殖場中糞肥的施用是抗生素和ARGs進(jìn)入土壤環(huán)境的主要途徑。土壤中ARGs種類豐富,研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)種類ARGs在土壤環(huán)境中均有檢出[4]。例如,僅四環(huán)素類抗性基因就可檢出40余種,其中,tetA、tetO、tetW和tetZ等基因最常見[5]。由于不同地區(qū)抗生素使用情況、土地利用狀況和土壤理化性質(zhì)有所不同,故區(qū)域內(nèi)土壤中ARGs的分布與豐度也不盡相同。例如,在中國長江三角洲農(nóng)業(yè)區(qū),sul2和tetG是最常見的ARGs,其平均相對(duì)豐度分別為6.67×10-3和5.25×10-3copies/16S rRNA gene copies[6]。而在荷蘭的一些地區(qū),blaTEM、ermF和tetQ這3種ARGs較為常見,其相對(duì)豐度分別為5.5×10-2、9.3×10-2和9.3×10-3copies/16S rRNA gene copies[7]。

土壤環(huán)境與人類健康息息相關(guān)。土壤中豐富的微生物為ARGs的水平傳播提供了載體。ARGs可通過“土壤—微生物—植物—?jiǎng)游铩眰鞑ユ湶粩嗬鄯e,這不僅嚴(yán)重影響生態(tài)安全,也會(huì)危及上層食物鏈進(jìn)而威脅人類健康[8]。AARESTRUP等[9]研究發(fā)現(xiàn),從雞、豬和人體分離的糞腸球菌具有相似的耐藥譜和耐藥基因,這說明日常飲食是ARGs進(jìn)入人體的一條潛在途徑,也證明ARGs可通過土壤生態(tài)系統(tǒng)的富集、累積以及食物鏈的進(jìn)一步傳遞危害人類健康。

自ARGs在環(huán)境中被大量檢出并被確立為新型污染物以來,相關(guān)研究日益增多,其中,大量研究聚焦于ARGs在土壤環(huán)境中的污染問題,取得了許多重要進(jìn)展。這些研究從ARGs的來源與分布、傳播與擴(kuò)散、消減與治理等不同方面展開了深入探索,但截至目前,相關(guān)研究尚缺乏有效的梳理與總結(jié)。因此,該文對(duì)土壤環(huán)境中ARGs污染的研究進(jìn)展和熱點(diǎn)進(jìn)行綜述。首先,采用文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)方法,借助可視化軟件,對(duì)已發(fā)表的論文進(jìn)行信息挖掘,這些信息包括年發(fā)文量、發(fā)文數(shù)較多的國家,以及國家之間的合作頻率等;并對(duì)高頻關(guān)鍵詞進(jìn)行共現(xiàn)分析,揭示該領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究主題。同時(shí),該文從檢測方法、來源及分布、影響ARGs傳播的因素以及消減方法4個(gè)方面梳理和分析了土壤環(huán)境中ARGs污染方面的研究進(jìn)展。在此基礎(chǔ)上,結(jié)合當(dāng)前的研究熱點(diǎn)及前沿問題,指出了未來的研究方向,期望為未來土壤環(huán)境中ARGs污染領(lǐng)域的研究及土壤環(huán)境中ARGs的風(fēng)險(xiǎn)管控提供理論參考。

1 文獻(xiàn)計(jì)量分析

文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)分析是一種基于定量分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)描述某領(lǐng)域內(nèi)文獻(xiàn)特征的方法。通過該分析可以了解土壤環(huán)境中ARGs污染研究的現(xiàn)狀,并預(yù)測該研究領(lǐng)域未來的發(fā)展方向。

1.1 數(shù)據(jù)與方法

1.1.1數(shù)據(jù)來源

以Web of Science核心數(shù)據(jù)庫和萬方數(shù)據(jù)庫分別作為英文和中文論文數(shù)據(jù)來源,Web of Science核心數(shù)據(jù)庫的檢索關(guān)鍵詞是“Antibiotic Resistance Genes”和“Soil”,萬方數(shù)據(jù)庫的檢索關(guān)鍵詞是“抗生素抗性基因”和“土壤”,檢索時(shí)間范圍為數(shù)據(jù)庫創(chuàng)立時(shí)至2022年4月15日,涵蓋所有在標(biāo)題、摘要或關(guān)鍵詞中包含這些關(guān)鍵詞的文章。在此步驟中,共有2 817篇英文和209篇中文文章符合標(biāo)準(zhǔn)。然后,剔除書評(píng)、會(huì)議記錄和信函等非學(xué)術(shù)性質(zhì)文章,并根據(jù)論文的發(fā)表標(biāo)題和摘要,剔除所有研究內(nèi)容與“土壤環(huán)境中ARGs污染”無關(guān)的文章。經(jīng)過此步驟篩選,共有900篇文獻(xiàn)(805篇英文研究型論文、95篇中文研究型論文)符合要求,可用于進(jìn)一步分析。

1.1.2研究方法

利用Web of Science數(shù)據(jù)分析平臺(tái),分析論文的年發(fā)表量、活躍國家及研究方向。利用Scimago Graphica和VOS viewer對(duì)論文的發(fā)表國家、關(guān)鍵詞進(jìn)行分析,形成共現(xiàn)圖譜。通過可視化分析,獲取該領(lǐng)域研究現(xiàn)狀和熱點(diǎn)問題,并分析未來的發(fā)展趨勢(shì)。

1.2 結(jié)果與分析

1.2.1年發(fā)文量趨勢(shì)

“土壤環(huán)境中ARGs污染”研究領(lǐng)域年累計(jì)發(fā)文量統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖1(基于篩選出的900篇文獻(xiàn))。根據(jù)結(jié)果可將年累計(jì)發(fā)文量趨勢(shì)劃分為緩慢增長期(1991—2007年)、快速增長期(2008—2015年)和急速增長期(2016至今)3個(gè)階段。具體來說,1991—2007年,“土壤環(huán)境中ARGs污染”相關(guān)研究發(fā)展平緩,累計(jì)發(fā)文量為42篇,年均發(fā)文量≤5篇,這表明在此階段,土壤環(huán)境中ARGs污染問題尚未引起學(xué)者們的注意;2008—2015年,該領(lǐng)域論文數(shù)增加至192篇,占總發(fā)文數(shù)量的21.33%;2016年之后,“土壤環(huán)境中ARGs污染”問題成為一個(gè)研究熱點(diǎn),得到了學(xué)術(shù)界的高度重視,這一階段文章數(shù)量顯著增長,占研究總數(shù)的74.00%,遠(yuǎn)高于前兩個(gè)階段。

截至2022年4月15日。圖1 年累計(jì)發(fā)文數(shù)量及被引頻次變化趨勢(shì)Fig.1 The number of annual publications and their citations

論文被引頻次反映了該研究方向的認(rèn)可度和學(xué)術(shù)影響。如圖1所示,雖然2010和2017年等年份的文章數(shù)量有所下降,但被引數(shù)量逐年持續(xù)上升,說明土壤環(huán)境中ARGs污染研究方面的論文質(zhì)量有所提高且逐漸受到關(guān)注,相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)入快速發(fā)展階段。

1.2.2發(fā)文國家及其合作

土壤環(huán)境中ARGs污染研究已在全球范圍內(nèi)廣泛開展。截至目前,共有72個(gè)國家參與了研究并發(fā)表論文。土壤環(huán)境中ARGs污染研究方面的論文數(shù)量排名前10位的國家見表1。其中,中國以473篇論文排名第一,占研究總數(shù)的52.56%,其次是美國(196篇,占比為21.78%),這兩個(gè)國家發(fā)表的論文數(shù)量明顯多于其他國家,是推動(dòng)該領(lǐng)域發(fā)展的主要國家。中國的總被引頻次最高(15 136次),其次是美國(11 223次)。由 表1可知,各國總被引頻次與論文數(shù)量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。然而,論文發(fā)表數(shù)量與篇均被引頻次并不呈正比,各國間論文的篇均被引頻次差異顯著。其中,德國以84.82次的篇均被引頻次排名第一,其次是丹麥(78.74次)和澳大利亞(67.38次)。值得注意的是,盡管中國的論文數(shù)量和總被引頻次最高,但篇均被引頻次(32.00次)并不理想,僅高于韓國(10.27次),這表明我國在提高該研究領(lǐng)域論文發(fā)表數(shù)量的同時(shí),應(yīng)進(jìn)一步提升論文質(zhì)量。

表1 土壤環(huán)境中ARGs污染研究方面的論文數(shù)量排名前十的國家Table 1 Top 10 countries based on the number of publications on ARGs pollution in soil environment

國家間的合作網(wǎng)絡(luò)見圖2,圖2較好地展示了各國間關(guān)于土壤環(huán)境中ARGs污染相關(guān)研究的合作信息。由圖2可知,中國與美國、英國和澳大利亞的交流最頻繁。然而對(duì)于一些發(fā)展中國家,比如印度和俄羅斯,它們與其他國家的合作較為單一。隨著這一領(lǐng)域的不斷發(fā)展,這些國家應(yīng)加強(qiáng)與其他國家的國際合作,進(jìn)一步提高其影響力和學(xué)術(shù)成就。

收集了發(fā)表論文數(shù)量大于2篇的國家。不同顏色的矩形表示不同國家,矩形區(qū)域面積越大表示該國發(fā)表論文的數(shù)量越多;國家間的連接線表示兩個(gè)國家之間合作發(fā)表論文的數(shù)量,連接線顏色越深表示兩國間合作聯(lián)系強(qiáng)度越高。圖2 1991—2022年各國關(guān)于土壤環(huán)境中ARGs污染研究的合作情況Fig.2 Cooperation between countries on the research of ARGs pollution in the soil environment from 1991 to 2022

1.2.3主題關(guān)鍵詞分析

關(guān)鍵詞的變化可以體現(xiàn)研究主題的演變過程,可供相關(guān)領(lǐng)域的研究人員預(yù)測該主題未來的發(fā)展趨勢(shì)。基于VOS viewer中“Co-occurrence”分析功能,對(duì)檢索結(jié)果的關(guān)鍵詞進(jìn)行共現(xiàn)分析。圖3(a)顯示了69個(gè)高頻(出現(xiàn)超過15次)關(guān)鍵詞,這些關(guān)鍵詞可以分為4個(gè)簇,并通過不同顏色進(jìn)行區(qū)分。圖3(b)顯示1991—2022年這些關(guān)鍵詞的演變過程,從紫色到黃色的變化對(duì)應(yīng)了關(guān)鍵詞出現(xiàn)的年份變化。

圖3(a)中紅色聚類的關(guān)鍵詞包括細(xì)菌、抗生素抗性、質(zhì)粒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR反應(yīng))和基因等,表明該領(lǐng)域主要與攜帶ARGs的細(xì)菌及其在土壤環(huán)境中的活動(dòng)有關(guān);這一關(guān)鍵詞聚類在圖3(b)中的顏色接近藍(lán)色或紫色,表明在土壤環(huán)境中ARGs污染相關(guān)研究的早期階段重點(diǎn)關(guān)注了攜帶ARGs的土壤微生物及其環(huán)境行為。

綠色聚類的關(guān)鍵詞包括污染物、廢物、藥物等與ARGs共存的常見物質(zhì),也包括獸用抗生素、土霉素、磺胺、金霉素等土壤中常見的抗生素類詞匯,以及吸收、命運(yùn)和消減等有關(guān)ARGs去向的詞匯,這表明此聚類與土壤環(huán)境中ARGs的環(huán)境行為與消減方法有關(guān)。圖3(b)中的顏色顯示,這一聚類中的關(guān)鍵詞在2018年之后成為熱點(diǎn),表明土壤環(huán)境中ARGs污染相關(guān)研究的熱點(diǎn)逐步從攜帶ARGs的土壤微生物轉(zhuǎn)變?yōu)橥寥拉h(huán)境中ARGs的環(huán)境行為與消減方法。

藍(lán)色聚類的高頻詞是污泥、家禽、糞肥、施肥、土地利用和持久性等關(guān)鍵詞,表明該聚類研究主要集中在土壤環(huán)境中ARGs來源及在土壤中的持久性,以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)對(duì)土壤中ARGs賦存狀態(tài)的影響。圖3(b)中的顏色顯示,這一研究主題在2019年之后也成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。

黃色聚類散布在紅色、綠色和藍(lán)色聚類之間,包含豐度、重金屬、水平基因轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer,HGT)、群落和可移動(dòng)遺傳元件(mobile genetic elements,MGEs)等關(guān)鍵詞,說明該聚類的主題是ARGs在土壤環(huán)境中的豐度變化與微生物群落結(jié)構(gòu)和水平基因轉(zhuǎn)移的關(guān)系。由圖3(b)可知,這一聚類在2019年之后成為熱門研究領(lǐng)域,表明近年來研究者重點(diǎn)關(guān)注ARGs在土壤環(huán)境中的傳播機(jī)制及其帶來的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

2 土壤中ARGs的常見檢測方法

ARGs的檢測方法主要包括傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法和分子生物學(xué)方法兩類(表2)。傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法包括紙片擴(kuò)散法、稀釋法和抗生素濃度梯度法。分子生物學(xué)方法包括PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、DNA微陣列和宏基因組測序4種方法。

表2 抗生素抗性基因檢測方法優(yōu)缺點(diǎn)比較Table 2 Comparison of advantages and disadvantages of the detection methods for ARGs

2.1 傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法

傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法(即細(xì)菌耐藥性試驗(yàn))是國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室較常使用的檢測方法。該方法的原理是基于微生物的純培養(yǎng),盡管環(huán)境中的多數(shù)微生物不能在人工條件下培養(yǎng),但傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法操作簡單,成本較低,標(biāo)準(zhǔn)化程度高,因此,仍然可以在一些耐藥性研究中發(fā)揮作用。傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法也為研究耐藥細(xì)菌的生理學(xué)特征提供基礎(chǔ)。

2.1.1紙片擴(kuò)散法

紙片擴(kuò)散法又稱作Kirby-Bauer法(K-B法),誕生于20世紀(jì)40年代。操作方法是將涂抹有適量抗菌藥物的紙片貼在涂布了待測菌的培養(yǎng)基上,利用紙片上抗菌藥物的擴(kuò)散形成濃度梯度,觀察紙片是否出現(xiàn)抑菌環(huán),以推測藥物是否抑制細(xì)菌的生長。通過抑菌環(huán)大小,可以判斷藥物對(duì)細(xì)菌抑制作用的強(qiáng)弱。

K-B法操作簡便,結(jié)果穩(wěn)定,價(jià)格低廉,可以自由選擇抗菌藥物,是實(shí)驗(yàn)室最經(jīng)典、最常用的藥敏檢測方法[10]。盡管如此,K-B法尚存在諸多局限。比如,在進(jìn)行結(jié)果判讀時(shí),抑菌環(huán)直徑對(duì)于試驗(yàn)結(jié)果的影響較大。當(dāng)抑菌環(huán)不明顯或是當(dāng)抑菌環(huán)直徑位于藥物敏感性試驗(yàn)折點(diǎn)附近時(shí),容易造成比較嚴(yán)重的誤判。此外,K-B法試驗(yàn)耗時(shí)長,無法進(jìn)行定量分析。

2.1.2稀釋法

稀釋法是細(xì)菌藥物敏感性定量檢測的常用方法,也是最早使用的方法之一,分為肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法兩種。該方法的原理是將菌株接種到含有一系列稀釋濃度抗生素的肉湯或者瓊脂培養(yǎng)基中,觀察菌株生長狀況,即可獲得該菌株的最小抑菌濃度(minimal inhibit concentration,MIC)。

肉湯稀釋法重復(fù)性好,且一次可檢測多種抗生素的MIC,檢測準(zhǔn)確性和效率均較高。該方法操作簡便,成本較低,所用抗生素平板可以提前配制并冷藏待用。但肉湯稀釋法難以用肉眼判斷雜菌,不易判讀MIC。而瓊脂稀釋法能夠觀察細(xì)菌生長情況,與肉湯稀釋法相比,可以精確觀察到MIC值,同時(shí)還能觀察試驗(yàn)中是否出現(xiàn)雜菌污染。因此,瓊脂稀釋法的檢測結(jié)果也常常被用作其他方法的參考結(jié)果。但該方法工作量較大,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,因此在部分菌株的耐藥性試驗(yàn)中,瓊脂稀釋法具有局限性。

2.1.3抗生素濃度梯度法

抗生素濃度梯度法(E-test法)結(jié)合了紙片擴(kuò)散法和稀釋法兩種方法的原理和特點(diǎn)。該方法操作簡便,在E-test試紙上涂上事先準(zhǔn)備好的抗生素,其濃度由一頭向另一頭呈指數(shù)增長。將試紙貼在細(xì)菌平板中過夜,平板上就會(huì)形成抑菌圈,圈邊緣與試紙相交處的刻度即為MIC值。E-test法兼具紙片擴(kuò)散法和稀釋法的優(yōu)點(diǎn):操作簡便,精確度高,重復(fù)性強(qiáng),并可以用于直接測定細(xì)菌的MIC。但E-test試紙較貴,使用成本較高。

2.2 分子生物學(xué)方法

近年來分子生物學(xué)方法得到飛速發(fā)展,已成為檢測環(huán)境樣品中ARGs污染的主要方法。此類方法不需要傳統(tǒng)微生物的培養(yǎng)和篩選過程,因此對(duì)環(huán)境樣品中的可培養(yǎng)微生物和不可培養(yǎng)微生物均可以進(jìn)行耐藥性檢測,其檢測結(jié)果更加全面、可信。

2.2.1PCR

PCR技術(shù)是基因檢測的常用方法,其原理是基于對(duì)特定核苷酸序列的指數(shù)型擴(kuò)增。該方法無需對(duì)微生物進(jìn)行分離培養(yǎng),即可快速檢測目標(biāo)基因。目前,PCR法已經(jīng)廣泛用于土壤樣品檢測。PCR技術(shù)不僅能單獨(dú)用于ARGs分析,也能與其他方法相結(jié)合。比如PCR結(jié)合傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法,能用于檢測純菌株所攜帶的ARGs。PCR法檢測效率高,但其檢測過程中可能會(huì)有假陽性結(jié)果出現(xiàn),因此,常常還需配合DNA測序來識(shí)別特定的ARGs。

2.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR

PCR法主要通過凝膠電泳對(duì)ARGs進(jìn)行定性分析,因此,只能檢測環(huán)境中是否存在ARGs,并不能做定量化分析。在此基礎(chǔ)上,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,q-PCR)成為近年來廣泛使用的ARGs檢測手段。該方法結(jié)合了普通PCR和熒光能量傳遞技術(shù)的原理,借助熒光信號(hào)來檢測PCR產(chǎn)物。當(dāng)熒光探針與產(chǎn)物結(jié)合后,被激發(fā)的熒光強(qiáng)度和擴(kuò)增產(chǎn)物的量呈正比,因此可以實(shí)現(xiàn)精確定量。

q-PCR法實(shí)現(xiàn)了PCR法從定性分析到定量分析的進(jìn)步,其重復(fù)性好,穩(wěn)定性強(qiáng),但由于染料SYBR Green Ⅰ特異性較差,能夠和任何DNA雙鏈結(jié)合,因此與PCR檢測類似,q-PCR法依然會(huì)產(chǎn)生假陽性信號(hào)。而且傳統(tǒng)q-PCR法只能同時(shí)對(duì)幾種或者幾十種ARGs進(jìn)行定量分析,其效率在一定程度上較低。新發(fā)展的高通量熒光定量PCR技術(shù)(high-throughput quantitative PCR)彌補(bǔ)了這種不足,該技術(shù)最多可支持上百種ARGs的同時(shí)定量檢測,大大提高了分析效率。比如,ZHU等[4]利用高通量熒光定量PCR技術(shù),分析了來自養(yǎng)豬場糞便、堆肥以及施肥土壤樣品中可能存在的244種抗生素抗性基因,共檢測出其中的149種,基本涵蓋目前常見的ARGs類型。

2.2.3DNA微陣列

DNA微陣列技術(shù)(DNA microarray)具有快速、高效、自動(dòng)化的特點(diǎn),其原理是將已知序列的探針固定在微型芯片上,再將其與樣本中的DNA核酸序列進(jìn)行雜交,從而快速檢測樣本中的大量基因。

由于土壤樣品基質(zhì)復(fù)雜,一些污染物的存在可能會(huì)干擾檢測結(jié)果,因此,該方法在臨床醫(yī)學(xué)上應(yīng)用較多,而在環(huán)境領(lǐng)域應(yīng)用較少[11]。由于該技術(shù)檢測限度較低,單獨(dú)使用該方法的檢測效率低下,因此DNA微陣列技術(shù)往往還需要與PCR法相配合。

2.2.4宏基因組測序

宏基因組學(xué)是對(duì)環(huán)境中所有遺傳物質(zhì)的總DNA進(jìn)行分析的研究集合。宏基因組測序主要分為3步:(1)宏基因組DNA的提取和純化;(2)宏基因組文庫的構(gòu)建;(3)宏基因組文庫的篩選和分析。宏基因組測序不僅可以檢測已有的ARGs,也可以發(fā)掘環(huán)境中新出現(xiàn)的ARGs,豐富基因庫,以便更加全面地了解ARGs多樣性。宏基因組測序不依賴于微生物的培養(yǎng)和篩選,可以用于檢測樣品的全部DNA,避免了實(shí)驗(yàn)操作和引物選擇造成的誤差。因此,盡管宏基因組測序成本高,數(shù)據(jù)分析量大,但該方法依然在ARGs檢測和篩選中具有良好的前景。

3 土壤環(huán)境中ARGs污染的來源及分布

土壤中ARGs分布十分廣泛。如表3[6-7,12-17]所示,7個(gè)大洲的土壤均顯示有一定豐度的ARGs。土壤中ARGs的全球分布與人類活動(dòng)密切相關(guān),在城市居民區(qū)、農(nóng)田和養(yǎng)殖場等人類活動(dòng)頻繁的場所土壤中均發(fā)現(xiàn)了較高水平的ARGs。然而,在人口密度較低的地區(qū)也可能存在一定水平的ARGs。比如人類活動(dòng)有限的南極偏遠(yuǎn)地區(qū)土壤中共檢測出177種天然存在的ARGs[18],這表明ARGs在全球土壤環(huán)境中廣泛存在。

表3 土壤環(huán)境中ARGs分布和豐度[6-7,12-17]Table 3 Distribution and abundance of ARGs in the soil environment

自然環(huán)境中ARGs來源分為內(nèi)在抗性和外源輸入兩類。內(nèi)在抗性指細(xì)菌因突變而使其基因組上的抗性基因原型表達(dá),從而產(chǎn)生可水解抗生素的酶或細(xì)胞外排泵,有效分解和清除細(xì)胞內(nèi)的抗生素,使細(xì)菌顯現(xiàn)出抗生素抗性。內(nèi)在抗性是微生物在自然選擇過程中產(chǎn)生的,有利于微生物更好地適應(yīng)環(huán)境。許多土壤土著微生物能代謝產(chǎn)生抗生素,因此土壤中天然存在ARGs。ZHANG等[19]分析了人類活動(dòng)較少的冰川土壤和永凍土層,發(fā)現(xiàn)多種ARGs的存在,這表明ARGs早于人類抗生素使用之前就在環(huán)境中存在。但由內(nèi)在抗性產(chǎn)生的ARGs濃度在環(huán)境中非常低,因此目前土壤環(huán)境中ARGs污染以外源輸入為主,這種外源輸入主要源于人類社會(huì)的生產(chǎn)和生活活動(dòng)。

畜禽養(yǎng)殖業(yè)抗生素的濫用導(dǎo)致畜禽糞便中含有大量抗生素、抗生素耐藥菌(antibiotic-resistant bacteria,ARB)和ARGs。當(dāng)畜禽糞便及其堆肥產(chǎn)品被用作有機(jī)肥施入土壤后,其抗生素殘留會(huì)對(duì)土壤微生物施加持久性壓力,誘導(dǎo)其體內(nèi)耐藥性基因表達(dá),從而增加土壤環(huán)境中ARGs豐度。ZHAO等[20]通過研究山東省長期施用糞肥的土壤,發(fā)現(xiàn)長期施用含有磺胺類抗生素糞肥的土壤中ARGs種類和豐度相較于未施肥的對(duì)照組顯著增加,表明磺胺類抗生素可以誘導(dǎo)ARGs的出現(xiàn)。此外,糞便及其堆肥產(chǎn)品中ARGs種類豐富,這些ARGs會(huì)隨糞肥施用直接進(jìn)入土壤中。SCHMITT等[21]對(duì)比了豬糞施用前后土壤中ARGs種類變化,發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類抗性基因tetY、tetS、tetC、tetQ和tetH未出現(xiàn)在對(duì)照組土壤中,但卻在豬糞及豬糞施用土壤中檢出,表明ARGs可以隨著施肥過程進(jìn)入土壤。

廢水是土壤環(huán)境中ARGs污染的另一重要來源。再生廢水灌溉實(shí)現(xiàn)了水資源的循環(huán)利用,在一定程度上緩解了用水壓力。然而現(xiàn)有的污水處理系統(tǒng)并不完善,來自醫(yī)療系統(tǒng)和養(yǎng)殖場的污水中存在大量抗生素和ARGs,其無法通過污水處理系統(tǒng)徹底去除。這些富含抗生素和ARGs的再生廢水一旦澆灌土壤,無疑會(huì)引入大量ARGs污染[22]。BOUGNOM等[23]測定了非洲3個(gè)地區(qū)廢水灌溉農(nóng)田中ARGs豐度,發(fā)現(xiàn)ARGs絕對(duì)豐度相較于對(duì)照組提高27%。污水處理過程中產(chǎn)生的活性污泥也是土壤中ARGs的一個(gè)來源,其主要通過污泥農(nóng)用方式進(jìn)入農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)。RAHUBE等[24]分析了加拿大安大略省試驗(yàn)田中活性污泥施用地塊以及該地塊收獲的蔬菜樣品中ARGs豐度,發(fā)現(xiàn)相較于未施用地塊,污泥施用地塊土壤和蔬菜樣品中ARGs豐度顯著增加,表明活性污泥中ARGs可以向土壤和蔬菜中轉(zhuǎn)移,具有生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

4 影響土壤環(huán)境中ARGs傳播的因素

土壤環(huán)境中ARGs污染的廣泛分布往往來自于ARGs的易傳播特性。水平基因轉(zhuǎn)移是土壤中ARGs傳播擴(kuò)散的主要方式之一,指ARGs通過接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化等方式在微生物間傳遞的過程。在這一過程中,ARGs多負(fù)載于MGEs上。由于HGT常發(fā)生于開放的自然環(huán)境中,因此,這一過程易受多種因素影響,包括土壤中與ARGs共存的其他物質(zhì)的影響以及土壤本身理化性質(zhì)的影響。文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)調(diào)查顯示,與ARGs在土壤環(huán)境中傳播相關(guān)的論文共有41篇,僅占論文總數(shù)的4.56%。因此,盡管土壤環(huán)境中ARGs污染研究逐年增加,關(guān)于影響ARGs在土壤中傳播的因素研究依然處于不斷的探索之中。

4.1 抗生素

ARGs的HGT過程受土壤環(huán)境中抗生素的影響,共有9篇論文關(guān)注了這一影響因素?？股卦谕寥拉h(huán)境中的遷移、轉(zhuǎn)化,不僅會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生ARGs,也會(huì)對(duì)ARGs的傳播表現(xiàn)出促進(jìn)作用。盧文強(qiáng)等[25]發(fā)現(xiàn)低濃度磺胺類抗生素使大腸桿菌(Escherichiacoli)接合轉(zhuǎn)移頻率顯著增加,這是由于此類抗生素引起了宿主細(xì)胞內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)的損傷從而觸發(fā)細(xì)菌的DNA損傷誘導(dǎo)(SOS)反應(yīng)。細(xì)菌利用SOS應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)修復(fù)損傷,該系統(tǒng)也可同時(shí)誘導(dǎo)MGEs發(fā)生轉(zhuǎn)移,從而促進(jìn)ARGs的HGT過程[26]。此外,喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類抗生素均被發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)SOS反應(yīng),從而促進(jìn)HGT[27]。

4.2 重金屬

重金屬在土壤環(huán)境中廣泛存在,部分重金屬與ARGs豐度之間存在顯著相關(guān)性,重金屬污染土壤中ARGs轉(zhuǎn)移效率也顯著提高。依據(jù)文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)調(diào)查結(jié)果,共有16篇論文研究了重金屬對(duì)土壤環(huán)境中ARGs水平轉(zhuǎn)移過程的影響。楊統(tǒng)一等[28]基于室內(nèi)培養(yǎng)法,發(fā)現(xiàn)Zn的脅迫可以提高供試土壤中ARGs相對(duì)豐度,且高濃度Zn離子可以促進(jìn)ARGs的擴(kuò)散。這是因?yàn)橐恍㎝GEs是ARGs和重金屬抗性基因的共同載體,在重金屬暴露下這些MGEs豐度會(huì)顯著提升,進(jìn)而相應(yīng)提高ARGs發(fā)生水平轉(zhuǎn)移的頻率[29]。HU等[30]研究了長期Ni暴露下土壤中ARGs和MGEs豐度變化,結(jié)果顯示ARGs多樣性和豐度隨著Ni濃度增加而增加,且MGEs豐度與ARGs豐度之間呈正相關(guān)關(guān)系,表明Ni暴露會(huì)增加ARGs水平轉(zhuǎn)移的能力。

4.3 持久性有機(jī)污染物

持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants,POPs)對(duì)微生物、動(dòng)植物甚至人類健康均會(huì)造成不利影響。常見的有機(jī)污染物包括多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯等。POPs影響ARGs水平轉(zhuǎn)移的機(jī)制主要有:(1)引起細(xì)胞SOS反應(yīng)[31];(2)改變細(xì)胞膜通透性,使ARGs水平轉(zhuǎn)移頻率增加[32];(3)調(diào)控MGEs,微生物抵抗POPs的選擇性壓力時(shí),會(huì)相應(yīng)提高POPs降解基因所在的MGEs豐度,這同時(shí)會(huì)增加處在同一MGEs中的ARGs豐度[33];(4)增強(qiáng)細(xì)胞感受能力,從而使其攝取更多ARGs來抵抗外界壓力[34]。文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)調(diào)查顯示,僅有5篇論文報(bào)道了POPs對(duì)ARGs傳播的影響。盡管土壤環(huán)境中POPs的界面行為已得到廣泛且詳細(xì)的研究,但對(duì)于POPs如何影響ARGs的遷移轉(zhuǎn)化過程仍需進(jìn)一步探索。

4.4 其他環(huán)境因素

土壤的理化性質(zhì)也會(huì)影響ARGs在土壤中的傳播,文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)調(diào)查顯示共有11篇論文分別從土壤pH、質(zhì)地、水分含量等角度探究了ARGs在土壤中的遷移。土壤pH、水分等因素能夠改變土壤養(yǎng)分的有效性,從而影響土壤微生物群落活性,影響ARGs在土壤環(huán)境中的傳播。LI等[35]研究表明,酸性條件可以促進(jìn)四環(huán)素類和β-內(nèi)酰胺類ARGs的HGT過程,這是因?yàn)樗嵝詶l件可以促進(jìn)細(xì)胞膜通透性增加,從而增加質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移。WANG等[36]研究表明土壤水分含量達(dá)到20%時(shí)發(fā)生HGT的效率最高。

5 土壤環(huán)境中ARGs消減方法

為了減少土壤中ARGs污染,降低ARGs帶來的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn),目前學(xué)者已研發(fā)出各種ARGs消減技術(shù),比如堆肥、生物修復(fù)法、添加外源物質(zhì)及改變土壤理化性質(zhì)等。在筆者所篩選出的900篇文獻(xiàn)中,共有62篇(6.89%)文獻(xiàn)報(bào)道了各類方法對(duì)于土壤環(huán)境中ARGs的消減作用。

5.1 堆肥

好氧堆肥和厭氧消化是畜禽糞便無害化處理和資源化利用的常用方法,它們主要通過提高溫度抑制微生物生長繁殖并破壞其細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)來消減ARGs污染。在所篩選的文獻(xiàn)中,共有9篇論文關(guān)注堆肥過程對(duì)糞肥中ARGs的去除效果及后續(xù)施用土壤中ARGs污染狀況。研究發(fā)現(xiàn),高溫可以有效降低ARGs種類和豐度,表明無論是好氧堆肥還是厭氧消化,提高溫度并延長反應(yīng)時(shí)間均能有效提高ARGs去除率[37-38]。此外,堆肥過程中添加外源物質(zhì)也可有效提高ARGs的去除效果。WANG等[39]發(fā)現(xiàn)堆肥過程中添加玉米芯顆粒顯著降低堆肥產(chǎn)品中和隨后施用的土壤中ARGs相對(duì)豐度和多樣性。但盡管如此,堆肥過程仍然難以徹底去除產(chǎn)品中所有的ARGs,糞肥仍然是ARGs的重要儲(chǔ)存庫。

5.2 生物修復(fù)法

前述文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果顯示,研究或提及“土壤中ARGs的生物修復(fù)法”的文獻(xiàn)僅有15篇,共涉及11種不同的動(dòng)物、植物和微生物,這表明針對(duì)ARGs污染土壤的生物修復(fù)法研究尚處于初探階段。生物修復(fù)相對(duì)于其他方法的優(yōu)勢(shì)在于其可利用自然環(huán)境中對(duì)ARGs表現(xiàn)有耐受性的動(dòng)物、植物和微生物實(shí)現(xiàn)對(duì)ARGs的強(qiáng)效去除,可以在一定程度上避免由其他修復(fù)方法帶來的對(duì)土壤本身性質(zhì)的不良影響。

目前,植物修復(fù)多被用于治理土壤中的重金屬和POPs污染,其對(duì)ARGs的去除已被研究者關(guān)注,但相關(guān)研究仍處于初步階段。CUI等[40]將多花黑麥草和印度芥菜間作于ARGs污染土壤,發(fā)現(xiàn)多花黑麥草根際土壤中ARGs豐度降低20.43%,印度芥菜非根際土壤ARGs豐度降低23.22%。盡管試驗(yàn)結(jié)果表明植物具有修復(fù)ARGs污染土壤的潛能,但在應(yīng)用上依然面臨諸多問題。植物對(duì)野外實(shí)際環(huán)境的適應(yīng)性以及食草動(dòng)物、土壤病原菌的威脅都是利用植物修復(fù)ARGs污染環(huán)境所面臨的挑戰(zhàn),這些因素很有可能導(dǎo)致修復(fù)效果與實(shí)驗(yàn)室中的結(jié)果存在差異。

蚯蚓是大型土壤動(dòng)物,具有發(fā)達(dá)的腸道系統(tǒng),常被用作污染土壤動(dòng)物修復(fù)的模式生物。大量研究表明蚯蚓對(duì)重金屬和POPs污染土壤具有良好的修復(fù)效果,近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)蚯蚓對(duì)ARGs污染土壤也具有一定的修復(fù)能力。CHAO等[41]采集中國長江三角洲的森林土壤,探究了添加蚯蚓對(duì)四環(huán)素和ARGs污染土壤的修復(fù)效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加蚯蚓后的土壤中ARGs和ARB豐度相較于沒有添加蚯蚓的土壤有所降低。這是由于蚯蚓腸道中的微生物相較于土壤微生物具有更強(qiáng)的降解四環(huán)素的能力,進(jìn)而減少四環(huán)素的選擇壓力。

土壤中微生物具有繁殖強(qiáng)、代謝快的特點(diǎn),在用于土壤污染治理的生物修復(fù)技術(shù)中優(yōu)勢(shì)顯著。將特異性菌群應(yīng)用于土壤可以實(shí)現(xiàn)土壤中ARGs的降解。SHI等[42]從活性污泥中分離出煙草節(jié)桿菌OTC-16(ArthrobacternicotianaeOTC-16)用于降解四環(huán)素和土霉素。該菌在一定的生長適宜范圍內(nèi)可以促進(jìn)糞肥中四環(huán)素和土霉素的去除,最高達(dá)到91.54%。由于抗生素的選擇壓力減小,因此該菌同時(shí)可顯著降低ARGs豐度。

5.3 添加外源物質(zhì)

添加外源物質(zhì)也是控制農(nóng)田土壤ARGs污染的一項(xiàng)有效措施。其中,生物炭是較常添加的一類物質(zhì),文獻(xiàn)調(diào)查結(jié)果顯示,在涉及利用外源物質(zhì)降低土壤環(huán)境中ARGs污染的27篇論文中,有13篇(48.15%)與生物炭相關(guān)。這表明生物炭在去除土壤環(huán)境中ARGs方面具有廣闊的應(yīng)用前景。此外,土壤改良劑也是修復(fù)ARGs污染土壤的常用材料。WANG等[43]利用負(fù)載了沸石的鳥糞石作為土壤改良劑,處理微塑料污染土壤中Cu、四環(huán)素和ARGs的復(fù)合污染。通過處理,土壤中ARGs總相對(duì)豐度降低76.2%～80.3%。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn),該土壤改良劑的施加改變了污染物生物利用度、土壤性質(zhì)和土壤微生物群落結(jié)構(gòu),進(jìn)而減少污染土壤中ARGs的增殖。

5.4 改變土壤理化性質(zhì)

改變土壤理化性質(zhì)主要是為了阻斷土壤中ARGs的擴(kuò)增與傳播,此次調(diào)查中共有9篇論文是關(guān)于土壤含水量、厭氧條件等因素對(duì)于ARGs去除效率影響的研究。通過改變土壤理化性質(zhì),可以有效降低土壤微生物數(shù)量和活性,從而改變土壤中ARGs轉(zhuǎn)移擴(kuò)散能力。比如,土壤厭氧條件有利于ARGs的消減。XU等[44]比較了土壤有氧和厭氧條件下ARGs豐度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在有氧條件下,土壤中ARGs和MGEs豐度顯著高于厭氧條件,這表明改變土壤含氧狀態(tài)可以在一定程度上降低農(nóng)田環(huán)境中ARGs的污染風(fēng)險(xiǎn)。

6 總結(jié)與展望

以文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)理論為基礎(chǔ),借助Scimago Graphica、VOS viewer等軟件,系統(tǒng)地分析了來自Web of Science核心數(shù)據(jù)庫和萬方數(shù)據(jù)庫的900篇論文,以圖譜形式展現(xiàn)并剖析了有關(guān)土壤環(huán)境中ARGs污染研究的文獻(xiàn)產(chǎn)出特點(diǎn)和研究熱點(diǎn)。

土壤環(huán)境中ARGs污染研究的發(fā)展可分為緩慢增長期(1991—2007年)、快速增長期(2008—2015年)和急速增長期(2016至今)3個(gè)階段。從發(fā)文國家來看,中國、美國是該研究領(lǐng)域較為活躍的兩個(gè)國家,研究成果多,影響力大。各國之間在該研究領(lǐng)域的合作較多,但部分發(fā)展中國家還應(yīng)加強(qiáng)與其他國家的合作研究。目前,該領(lǐng)域的研究方向主要集中在5個(gè)方面:土壤中攜帶ARGs的微生物及其在土壤環(huán)境中的活動(dòng)行為、土壤環(huán)境中ARGs的來源和持久性、土壤環(huán)境中ARGs的傳播和消減策略、土壤中共存物質(zhì)對(duì)ARGs豐度和遷移行為的影響以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)對(duì)土壤環(huán)境中ARGs污染的影響。

在文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)分析的基礎(chǔ)上,結(jié)合近年來土壤環(huán)境中ARGs污染研究的相關(guān)論文,總結(jié)歸納了土壤環(huán)境中ARGs的常見檢測方法、來源和分布、影響ARGs傳播的因素以及ARGs的消減方法。雖然目前土壤環(huán)境中ARGs污染研究日益豐富,相關(guān)理論體系趨于成熟,但仍然有諸多問題亟待解決。比如,ARGs通過HGT過程在土壤中傳播,這一過程受諸多因素共同影響,然而目前研究僅考慮單一影響因素,尚未探究復(fù)合影響因素的共同作用,建議今后相關(guān)研究的開展可以充分考慮土壤環(huán)境的復(fù)雜性。關(guān)于ARGs污染土壤的修復(fù),目前相關(guān)消減技術(shù)多處于理論研究階段,如何將其規(guī)?；\(yùn)用于ARGs污染土壤并取得良好的修復(fù)效果仍需更多的探索與實(shí)踐。