空間表達變異基因識別方法及其在腫瘤異質性研究中的應用進展

關雙 劉溪 王博 王念 劉駿 王忠

[摘要]?空間表達變異基因的識別是闡明空間轉錄組學的基礎。空間表達變異基因的分析需應用空間轉錄組數(shù)據(jù)相關公共存儲庫和計算技術。本文綜述空間轉錄組學應用于空間表達變異基因識別的計算方法，闡述空間表達變異基因識別在腫瘤異質性研究中的應用進展，以進一步理解驅動腫瘤異質性發(fā)生發(fā)展的分子機制。

[關鍵詞]?空間轉錄組學；空間表達變異基因；腫瘤異質性

[中圖分類號]?R730????[文獻標識碼]?A ????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.02.027

人體組織由各種類型的細胞組成，每種類型的細胞均執(zhí)行特定的功能，而細胞行為受組織內周圍環(huán)境的影響。了解組織中不同細胞的相對位置對于理解細胞類型和疾病機制至關重要[1]。腫瘤的空間異質性不僅由基因型的多樣性驅動，還由腫瘤細胞與構成局部腫瘤微環(huán)境的免疫和基質細胞之間的相互作用產生，從而導致腫瘤的不同區(qū)域具有獨特表型，因此了解腫瘤的空間異質性在臨床上有重要意義[2-3]。

空間轉錄組（spatial?transcriptome，ST）技術在對轉錄組進行高通量測序的同時，可保留相關組織環(huán)境和細胞的空間信息，彌補單細胞測序技術獲取空間信息的不足。生成ST數(shù)據(jù)的常用方法分為兩類，一類方法是基于圖像的原位轉錄學，稱為單分子熒光原位雜交；另一類方法是基于空間條碼的下一代測序技術，包括空間轉錄組學、Slide-Seq、Slide-Seq2等[4-6]。目前，ST技術主要應用于細胞類型識別、細胞-細胞相互作用關系計算、基于表達信息和空間坐標的空間模式識別等方面。其中，ST數(shù)據(jù)分析的主要貢獻之一是表征其空間組織方式[7]。近年來，研究者在闡明基因表達的空間變異方面付出諸多努力[8]。根據(jù)數(shù)據(jù)分析流程，可將上述分析方法分為兩類：第一類是不考慮空間域識別空間表達變異基因；第二類是利用空間聚類算法識別出的空間域檢測空間表達變異基因[9]。本文重點闡述用于ST數(shù)據(jù)分析的計算方法，特別強調如何將空間位置信息與基因表達聯(lián)合建模應用于空間表達變異基因的識別。

1??空間表達變異基因的鑒定

1.1??Trendsceek

Trendsceek利用標記點過程理論，以空間位置為點、表達水平為標記，應用標記點過程對每個基因的空間表達趨勢重要性進行排序和評估[10]。該方法通過將點作為其距離半徑函數(shù)進行成對分析，測試點的空間分布及其相關標記之間的相關性。用于依賴性評估的匯總統(tǒng)計量包括條件均值、條件方差、Stoyan分數(shù)相關性和分數(shù)-變異函數(shù)。

1.2??SpatialDE

SpatialDE利用高斯過程回歸將基因表達變化分解為空間成分和非空間成分[11]。空間差異項通過樣本的成對距離將基因表達協(xié)方差參數(shù)化，噪聲項模擬非空間可變性。由上述分量解釋的方差比率量化空間方差的分數(shù)。通過將上述完整模型與無空間方差分量的模型進行比較，可對空間表達變異基因進行識別。

1.3??Spark

與SpatialDE相似，Spark是一種生成模型，其具有10種空間核函數(shù)，包括5個具有不同周期性參數(shù)的周期核函數(shù)及5個具有不同平滑度參數(shù)的高斯核函數(shù)，可檢測空間表達變異基因[12]。該方法利用具有不同空間核的廣義線性混合模型對ST測序的原始數(shù)據(jù)進行建模，通過懲罰擬似然、限制性最大似然估計法對該模型進行求解，采用一種新的統(tǒng)計量整合規(guī)則計算統(tǒng)計P值。與SpatialDE不同的是，Spark可直接計算數(shù)據(jù)，并依據(jù)適當?shù)慕y(tǒng)計框架獲得校準P值，但其也導致識別空間表達變異基因的準確性降低。

1.4??Spark-X

Spark-X建立在穩(wěn)定的協(xié)方差測試框架基礎上，并將其擴展為結合各種空間核，用于對來自大型空間轉錄研究的稀疏計數(shù)數(shù)據(jù)進行非參數(shù)空間建模[13]。對于給定的基因，Spark-X首先構建基因表達的協(xié)方差矩陣（Y）和空間坐標的協(xié)方差矩陣（S），然后計算測試統(tǒng)計量（T）。測試統(tǒng)計量T實際上是所有位置對上的兩個相似性測量之間的乘積總和。當Y和S彼此獨立時，位置對之間關于基因表達的相似性度量將不會與位置對之間關于距離的相似性度量相關。因此，T值較小。

1.5??GPCounts

GPCounts建模具有負二項可能性的時間或空間計數(shù)數(shù)據(jù)[14]。使用具有對數(shù)連接函數(shù)的GP模擬計數(shù)數(shù)據(jù)分布在時間或空間平均值的變化。對于空間轉錄數(shù)據(jù)，GPCounts遵循兩個測試程序，使用根據(jù)χ2分布估計的P值，還可通過置換測試估計P值。GPcounts可識別執(zhí)行偽時間推斷，識別分支基因并發(fā)現(xiàn)時間軌跡[15]。與大多數(shù)軟件包相比，GPcounts的應用范圍更廣。但該方法在應用于大型數(shù)據(jù)集時，其計算效率并不明確。

2??空間域的識別

識別空間特征是空間轉錄組學分析中的步驟之一。為識別組織結構，現(xiàn)有算法對轉錄組上相似位點或細胞進行分組，以揭示基因表達的空間模式。較新方法可專職利用空間數(shù)據(jù)識別組織特征，如組織域。在空間表達變異基因檢測中考慮空間域可確保檢測到的基因在空間域中表現(xiàn)為豐富的表達模式，這些基因可作為細胞空間位置的標志物[16-17]。

2.1??SpaGCN

SpaGCN是一種利用圖卷積網絡分析ST數(shù)據(jù)，劃分不同組織區(qū)域并尋找區(qū)域富集基因的機器學習算法[18]。首先，建圖表示考慮空間位置和組織學信息所有點的關系；其次，利用圖卷積層聚合來自相鄰點基因的表達信息；第三，使用無監(jiān)督迭代聚類算法對點進行聚類。每個集群視為一個空間域，SpaGCN通過差異分析識別區(qū)域中富集的空間表達變異基因。當單個基因無法標記一個區(qū)域的表達模式時，SpaGCN會構建一個由多個基因組合形成的元基因，從而代表該區(qū)域的表達模式。SpaGCN的重點是結合現(xiàn)有組織學確定空間域，并確定在空間域之間存在的差異表達基因。在計算空間表達變異基因時，SpaGCN未將細胞類型信息和組織解剖結構納入計算中。

2.2??SOMDE

SOMDE使用自組織映射，在保持原始空間信息的前提下，根據(jù)輸入數(shù)據(jù)的密度和拓撲結構構造一個節(jié)點數(shù)較少的壓縮映射，應用高斯過程檢測空間表達變異基因[19]。SOMDE的核心思想是構造一種精簡的空間轉錄數(shù)據(jù)整合策略，既可保留空間表達變異基因的信息，又可降低下游的計算復雜度。該方法即使在非常大的數(shù)據(jù)集中也能有效識別空間表達變異基因，且運行速度快。

2.3??MULTILAYER

MULTILAYER將每個基因的差異表達水平與整個組織中的平均表達水平進行比較，應用層次聚類識別基因表達模式[20]。這些模式通過圖中節(jié)點進行表示，其中邊緣由基因模式的相似性加權；另有一些示例可利用Markov隨機字段在執(zhí)行空間聚類時合并空間信息。該方法對空間分辨率低的ST數(shù)據(jù)較為敏感。

2.4??SPADE

SPADE使用成像數(shù)據(jù)和ST數(shù)據(jù)作為輸入，通過卷積神經網絡提取每個點周圍的形態(tài)特征，并將其與基因表達數(shù)據(jù)相結合，以識別與空間和形態(tài)異質性相關的關鍵基因[21]。首先，建立線性模型，將每個空間轉錄數(shù)據(jù)集中所有基因的比例基因表達與圖像潛在特征PC進行擬合；其次，根據(jù)回歸系數(shù)或應用Benjamini-Hochberg方法校正P值，對基于PC值的線性回歸分析相關基因并排序，收集在PC機中錯誤發(fā)現(xiàn)率<0.05、解釋512D圖像特征方差>2%的基因列表，從而選擇SPADE基因；第三，基于上述關鍵基因進行功能分析，以進一步闡明負責不同形態(tài)特征的生物過程。

2.5??Sepal

Sepal模擬基因表達在空間域中的擴散，并應用Fick第二定律模擬表達擴散，測量收斂時間[22]。Sepal假設具有空間模式的基因表現(xiàn)為較低程度的隨機性擴散且具有較高程度的結構。因此，與在不同空間位置具有統(tǒng)一模式的基因相比，遵循結構化模式的轉錄本需要更多的迭代才能使梯度算法收斂，且系統(tǒng)的長收斂時間表明存在結構化的空間模式。Sepal可檢測不規(guī)則空間模式的基因。

2.6??ScGCO

ScGCO基于圖切割和高斯混合模型識別空間基因[23]。首先，對細胞的空間坐標進行Delaunay三角剖分以生成細胞位置稀疏圖形；其次，通過圖切割算法分析該圖，以識別最小化基礎馬爾可夫隨機場的能量切割，其中得到的子圖對應于具有相似表達值的細胞集群；第三，通過Voronoi鑲嵌可視化識別空間模式，且可使用齊次空間泊松過程評估所識別空間基因的統(tǒng)計學意義。該方法會對每個基因的表達進行分類，以更準確地區(qū)分細胞類型。

2.7??GLISS

GLISS將細胞位置作為連續(xù)變量進行處理，包括原則性的和可推廣的空間變化基因選擇過程：使用基于圖形的相關性度量，自動選擇多變量空間變量和基因表達信息之間的單調和非單調關聯(lián)。該過程是無模型的：GLISS不對SGE或scRNA-seq數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)生成過程進行分布假設。此外，GLISS的非參數(shù)統(tǒng)計程序在經驗上是強大的，具有錯誤發(fā)現(xiàn)保證，這對推廣和重復性至關重要。

3??ST技術在腫瘤異質性研究中的應用

異質性是惡性腫瘤的主要特征之一，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移、侵襲及預后等密切相關。ST技術可直接檢測不同組織區(qū)域基因表達的異質性，適用于腫瘤組織的異質性研究。例如，同一腫瘤中不同部位腫瘤細胞的轉錄組水平存在顯著差異，大規(guī)模的組織區(qū)域分析可以使學者對腫瘤微環(huán)境中基因差異表達有更深入的了解，從而在解析腫瘤細胞空間分布中發(fā)揮重要作用[24]。

3.1??乳腺癌

在女性中，乳腺癌是發(fā)病率最高的腫瘤。明確乳腺癌的腫瘤異質性對于確定特定疾病狀態(tài)、采取合適的治療方法至關重要。SpatialDE確定115個空間表達變異基因，其中有7個與乳腺癌相關并清楚地將脂肪細胞與組織的較密集區(qū)域分開[11]。Spark發(fā)現(xiàn)290個空間表達變異基因，其中10個與乳腺癌相關，大多數(shù)基因與細胞外基質和免疫反應有關[12]。Trendsceek發(fā)現(xiàn)14個空間表達變異基因，涉及乳腺癌的基因具有顯著的空間模式，包括轉錄因子KLF6、跨膜蛋白PMEPA1及12個與細胞外基質相關的基因[10]。ScGCO發(fā)現(xiàn)118個空間表達變異基因，其中有具有較低百分比的不可復制基因[23]。MULTLAYER鑒定112個空間表達變異基因[20]。上述研究有助于確定乳腺癌相關生物標志物。

3.2??胰腺癌

胰腺癌是一種難治性惡性腫瘤，目前無有效治療方法以改善其預后。SpaGCN在人胰腺癌中識別??3個空間域，分別確定每個空間域的特征基因；以空間域2為例，發(fā)現(xiàn)meta基因組（KRT17+MMP11-?SERPINA1）更能表征空間域2，KRT17在胰腺癌中可作為腫瘤促進劑并調節(jié)增殖，而MMP11是胰腺癌預后的生物標志物[15]。

3.3??黑色素瘤

黑色素瘤多發(fā)生于皮膚，是一種高度惡性腫瘤。除早期手術切除外，無特效方法且預后較差。因此，尋找黑色素瘤的早期診斷、治療及預后相關的生物標志物極為重要。Sepal識別出黑色素瘤的4個家族。其中，家族1與黑色素瘤相關；家族2、家族4與免疫相關；家族3與細胞外基質相關[22]。

4??小結與展望

空間轉錄組學提供了一個空間視角，從全新角度探索生物學研究的不同領域，幫助了解復雜疾病的起源、發(fā)育和進展軌跡。大量富含空間信息的轉錄組數(shù)據(jù)為科學研究指明新的方向。例如，基于測序技術的ST技術可展現(xiàn)人心臟發(fā)育過程中的基因空間、時間序列表達模式[25]。Maniatis等[26]研究肌萎縮側索硬化癥的進展。Chen等[27]確定阿爾茨海默病淀粉樣斑塊周圍組織域的轉錄變化。空間轉錄組學還被用于研究各種類型腫瘤的異質性[28-32]。鑒定空間表達變異基因有助于進一步理解驅動腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制，探索腫瘤微環(huán)境，解析腫瘤異質性；有助于發(fā)現(xiàn)腫瘤治療、預后相關標志物。與此同時，對基于具有空間表達模式的基因進行功能分析，可進一步闡明腫瘤異質性發(fā)生發(fā)展的生物學過程。治療方面，通過分析不同腫瘤患者空間位置差異、癌組織與癌旁正常組織差異及免疫細胞的分布差異，指導腫瘤的臨床用藥。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2022–12–24）

（修回日期：2023–11–24）