張博媛 孫德鵬 王鈺涵 田敬怡 牟柏德 崔明勛 李官浩

(1. 農業農村部延邊特色高品質牛肉精深加工創新重點實驗室,吉林 延吉 133002;2. 東北寒區肉牛科技創新教育部工程研究中心,吉林 延吉 133002;3. 延邊大學農學院,吉林 延吉 133002)

在評價鮮肉食用質量特征時,嫩度在消費者接受程度上起著至關重要的作用[1]。動物經屠宰后肌細胞處于無氧狀態導致肌肉收縮,影響肉的嫩度。在成熟過程中由于內源性蛋白水解酶調控細胞凋亡[2],加快肌原纖維蛋白和結締組織蛋白的水解,以蛋白質降解為主的生化反應能夠改善肉的質地。目前常見的宰后成熟方式有干法成熟和濕法成熟兩種[3-4],均能顯著提高肉的嫩度[5]。Kim等[6]分別將牛肉進行了28 d的濕法成熟和干法成熟,發現干熟樣品的剪切力低于濕熟樣品;也有研究[7]表明,干法成熟至14～35 d時,牛肉的嫩度和剪切力雖然持續改善,但14 d之后的嫩度改善效果顯著降低。張睿[8]的研究結果也顯示了干法成熟和濕法成熟均有效改善牦牛西冷的嫩度,且成熟時間越長,改善效果越好。肌纖維已被確定為影響肉類品質的重要因素,肉的最終嫩度也取決于肌原纖維結構的改變和降解的程度[9-10]。因此,為了探究宰后不同成熟過程中肉嫩度的變化,有必要深入探究成熟過程中肌原纖維蛋白降解與結構特性改變對宰后牛肉的影響。

延邊黃牛臀肉中脂肪含量低,肌纖維比例較高,推斷其在成熟過程中結構改變和降解速率較快[11]。研究擬以臀肉作為材料,分別進行30 d的干法成熟和濕法成熟,通過比較肉的嫩度相關品質、肌纖維結構特性和蛋白質降解程度,分析宰后成熟過程中嫩度變化,以優化最佳的嫩化方式為實際加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性成年延邊黃牛:龍井長白山犇福清真肉業有限公司;

氯化鉀、氯化鎂、乙二胺四乙酸、甲醛、乙醇、二甲苯、尿素、硫脲:分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司;

BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、考馬斯亮蘭染色套裝、蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒:北京索萊寶科技有限公司;

pH計:pH-STAR型,北京天翔飛域科技有限公司;

高速分散均質機:DY89-Ⅱ型,寧波新芝生物科技股份有限公司;

質構儀:TMS-PLUS型,北京盈盛恒泰科技有限責任公司;

酶標儀:Multiskan FC型,德國賽默飛世爾科技公司;

組織切片機:HistoCore BIOCUT型,德國徠卡公司。

1.2 成熟工藝

成年雄性延邊黃牛屠宰后,將臀肉均勻分割成形狀統一、重量為(2.0±0.2) kg的肉塊,充分混合后隨機分為2組進行30 d的干法成熟和濕法成熟,干法成熟(D):懸掛在發酵箱中,溫度2～4 ℃,相對濕度(RH)(85±5)%,風速1.2 m/s;濕法成熟(W):真空包裝放置于2～4 ℃的環境中;每組6塊,同時取2塊作為0 d空白對照樣品,各處理組分別在成熟10,20,30 d時取樣。

1.3 試驗方法

1.3.1 剪切力值測定 將溫度計插入肉塊中心,于蒸煮袋內水浴加熱至溫度為75 ℃后取出,充分冷卻后順肌纖維方向切成1 cm×1 cm×3 cm的長條測定剪切力值,測試速度60 mm/min,初始力0.5 N。

1.3.2 水分含量測定 參照GB 5009.3—2016。

1.3.3 pH 采用pH計法。

1.3.4 肌原纖維小片化指數的測定 參考張詩泉等[12]的方法并修改,取2 g成熟牛肉樣品,加入30 mL緩沖液(100 mmol/L KCl,1 mmol/L EDTA,1 mmol/L MgCl2,pH 7.0),冰浴勻漿1 min。在4 ℃、10 000 r/min離心15 min,棄去上清液,在沉淀中再次加入20 mL緩沖液,充分溶解后用BCA試劑盒測定蛋白濃度后,稀釋至質量濃度為0.5 mg/mL,于540 nm下測溶液的吸光度,將吸光度值乘200后,即為肌原纖維小片化指數。

1.3.5 石蠟切片制備及染色 肉樣垂直肌纖維方向切成1 cm×1 cm×0.5 cm的小塊后放置于體積分數4%的甲醛溶液中固定24 h,再用自來水沖洗過夜。將組織切成合適大小裝入包埋盒,依次于體積分數為70%,80%,90%,95%,100%的酒精中脫水1 h,再放置于二甲苯中浸泡10 min透明;分別于軟蠟和硬蠟中浸泡1 h后包埋。用石蠟切片機將組織切成6 μm的薄片后HE染色。

1.3.6 肌纖維結構觀察 用顯微鏡觀察染色后的切片并拍照,隨機選取20根肌纖維[13],用Image-pro plus軟件計算肌纖維橫截面積S和肌纖維直徑L;肌纖維密度D以單位面積S1內肌纖維數量N計算。

1.3.7 蛋白提取 根據Roberto等[14]的方法。取1 g肉樣,加入10 mL 50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)后,在冰浴中勻漿2 min,4 ℃ 10 000×g離心20 min,取上清液,為肌漿蛋白提取物;再次向沉淀中加入等體積緩沖液,渦旋后離心除掉上清液中的可溶性蛋白,再向沉淀中加入10 mL含6 mol/L尿素和1 mol/L硫脲的50 mmol/L Tris-HCl渦旋5 min,4 ℃ 10 000×g離心20 min,將上清液置于活化后的透析袋中4 ℃透析過夜,即得肌原纖維蛋白提取液。

1.3.8 SDS-PAGE分析 用BCA蛋白定量試劑盒測量提取的肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的濃度,并用磷酸鹽緩沖液調至2 mg/mL。以體積比3∶1加入4×蛋白上樣緩沖液,在沸水中煮5 min至變性。SDS-PAGE條件:分離膠質量分數12%,濃縮膠質量分數5%,上樣量10 μL,先以80 V電壓電泳直到條帶于濃縮膠與分離膠臨界處,然后以140 V電壓電泳直到指示條帶至分離膠底端,用考馬斯亮藍套裝染色、脫色后觀察。

1.4 數據統計與分析

每個試驗平行重復3次,結果以“平均值±標準差”表示;采用SPSS 27.0.1軟件中單因素方差分析數據是否具有顯著性差異,P<0.05表示差異顯著。

2 結果與討論

2.1 剪切力值的變化

由圖1可知,兩種成熟方式的剪切力值均隨時間延長呈顯著下降趨勢(P<0.05),這一過程是由蛋白酶的作用或鈣離子在成熟過程中引起肌原纖維間Z線降解引起的[15]。相比于干法成熟,濕法成熟對嫩度有更好的改善作用(P<0.05),是由于無氧狀態下宰后肌肉發生糖酵解等生化反應使pH值下降[16],變性的肌原纖維蛋白成為組織蛋白酶B、蛋白酶體6等蛋白酶系統更容易作用的靶點,在牛肉嫩化方面也很重要[17-18]。

小寫字母表示同種成熟方式不同成熟時期差異顯著(P<0.05);大寫字母表示相同時期不同成熟方式間差異顯著(P<0.05)

2.2 水分含量的變化

由圖2可知,干法成熟過程中牛肉水分含量隨成熟時間延長呈下降趨勢,且顯著低于濕法成熟組(P<0.05)。濕法成熟的水分含量穩定歸因于真空包裝,而干法成熟由于環境濕度的影響,在牛肉解僵和成熟過程中汁液流失過多,水分含量降低。肌肉中的水分含量一定程度上會影響肉的嫩度,牛肉脫水使肌纖維空隙增大[19],因此干法成熟牛肉的嫩度低于濕法成熟樣品。

小寫字母表示同種成熟方式不同成熟時期差異顯著(P<0.05);大寫字母表示相同時期不同成熟方式間差異顯著(P<0.05)

2.3 pH值的變化

pH值對宰后牛肉的嫩度和持水力等都有一定的影響[20]。由圖3可知,干法成熟牛肉的pH值隨時間延長呈上升趨勢,濕法成熟的相反。這可能是由于微生物的作用,干法成熟牛肉表面的低水分環境有利于酵母菌的增殖[21],蛋白質分解產生胺類等堿性物質使得成熟期間pH值升高。而濕法成熟樣品由于真空包裝隔絕氧氣,乳酸菌增殖導致成熟期間pH值降低[22]。有研究表明,在濕法成熟過程中,pH值下降增強了caspase-3的激活和線粒體功能障礙誘導的細胞凋亡[23],或由于低pH值改變了質子的穩態,降低了肌原纖維蛋白之間的靜電斥力,引起肌肉纖維不可逆側向收縮,使牛肉嫩度提升[24]。

小寫字母表示同種成熟方式不同成熟時期差異顯著(P<0.05);大寫字母表示相同時期不同成熟方式間差異顯著(P<0.05)

2.4 肌原纖維小片化指數變化

由圖4可知,兩種成熟方式的肌原纖維小片化指數均隨時間延長呈上升趨勢,且濕法成熟顯著高于干法成熟組(P<0.05),分別達到339.8±16.6和231.6±19.0。肌原纖維小片化指數在一定程度上能夠間接預測肉的嫩度,變化趨勢反映出牛肉結構蛋白水解程度隨成熟時間的延長而升高,并被降解為片段[25]。肌纖維間I帶斷裂、肌聯蛋白降解等變化降低肌原纖維結構強度,使肉的嫩度提高[12]。

2.5 肌纖維特性變化

延邊黃牛肉干法成熟和濕法成熟過程中肌纖維結構特性如圖5和表1所示。干法成熟組肌纖維特性隨時間延長均無顯著差異(P>0.05),濕法成熟組肌纖維面積和直徑均隨時間延長呈降低的趨勢,肌纖維密度顯著升高(P<0.05)。濕法成熟組的肌內膜邊緣降解,逐漸模糊、厚度變小,肌纖維之間排列緊密,幾乎沒有間隙,這可能是導致濕法成熟樣品嫩度提升的原因之一。推測肌內膜和肌束膜等結締組織的變化對肉的嫩度一樣起著關鍵作用[26]。宰后成熟是改善肉品質的重要途徑,控制細胞凋亡能夠調控肉品嫩化的進程,或通過調節蛋白酶活性及產生作用的持續時間來控制[27]。

表1 延邊黃牛肉宰后成熟過程中肌纖維組織學特性?

2.6 肌漿蛋白和肌原纖維蛋白SDS-PAGE分析

如圖6可知,兩種成熟方式在成熟30 d時,Ⅰ肌漿(180 kDa蛋白條帶)處出現新的條帶,可能是大分子肌漿蛋白降解的結果;肌漿蛋白是水溶性蛋白,包括糖酵解途徑的許多酶[28],其中肌酸激酶和醛縮酶(35～48 kDa范圍內兩條蛋白條帶)隨成熟時間延長逐漸降解;干法成熟組Ⅱ肌漿(25 kDa蛋白條帶)和Ⅲ肌漿(11 kDa以下蛋白條帶)明顯深于濕法成熟。以上條帶的變化說明干法成熟更容易使牛肉中相對分子質量高的肌漿蛋白分解成為相對分子質量低的蛋白,且種類增多,濃度增大。

圖6 延邊黃牛肉宰后成熟過程中肌漿蛋白的降解

如圖7可知,肌球蛋白和肌動蛋白變化不明顯,但隨著成熟時間的延長,原肌球蛋白(35～45 kDa處蛋白條帶)和肌鈣蛋白(17 kDa蛋白條帶)出現,肌球蛋白輕鏈(25 kDa蛋白條帶)逐漸加深,由以上蛋白條帶變化可知,肌原纖維蛋白的降解主要發生在17～48 kDa范圍內,濕法成熟樣品由于內源酶作用蛋白水解更強烈[18],出現的新條帶可能是肌動蛋白和肌球蛋白的降解產物[29],肌原纖維是肌肉結構蛋白,牛肉成熟過程中肌原纖維蛋白降解和肌原纖維小片化指數增加顯示出肌原纖維結構被破壞。

圖7 延邊黃牛肉宰后成熟過程中肌原纖維蛋白的降解

3 結論

干法成熟和濕法成熟均能夠提升延邊黃牛肉的嫩度,剪切力值、肌原纖維小片化指數以及蛋白降解等嫩度相關指標隨時間延長存在顯著變化(P<0.05)。由于濕法成熟組牛肉蛋白降解快,肌原纖維破裂指數顯著高于干法成熟組,并且從肌纖維結構可以觀察到濕法成熟組肌纖維內膜邊緣降解,肌纖維排列緊密,肉質更嫩(P<0.05)。干法成熟組在11～25 kDa范圍內的肌漿蛋白條帶明顯加深,說明延邊黃牛肉在成熟過程中肌漿蛋白降解為相對分子質量小的蛋白,改善肉的嫩度。研究宰后成熟過程中蛋白質降解、肌纖維結構變化對牛肉嫩度的影響有利于延邊黃牛肉高檔產品的加工貯藏,在后續的試驗中應更加深入研究濕法成熟過程中內源性蛋白酶如半胱氨酸蛋白酶和鈣蛋白酶等對肌肉細胞凋亡、結締組織降解的影響。