兩段階梯加熱成膜工藝對蛋白基復合材料疏水性和阻隔性能的影響

王 滋 雷 橋,2,3 張文惠

(1. 上海海洋大學食品學院,上海 201306;2. 上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306;3. 農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室〔上?！?上海 201306)

乳清分離蛋白—酪蛋白酸鈉(whey protein isolate-sodium caseinate,WPI-NaCas)復合膜具有良好的力學性能和阻隔性能。普魯蘭多糖(pullulan,PUL)制備的薄膜具有均一、透明、高韌性、可熱封、高阻隔的特點。有研究[1]表明,乳清蛋白在35 ℃以上,二聚體開始解聚成單體,溫度在70 ℃以上,球狀分子開始展開,疏水基團外露,通過巰基與其他含硫蛋白質相互作用,形成小聚體,進而團聚形成高分子聚集體。Cheng等[2]發現,單獨加熱豌豆分離蛋白1 h后,能使薄膜抗拉強度(TS)增強27.7%,水蒸氣滲透率降低58%,說明濕加熱改善了薄膜性能。董爽等[3]發現,在高壓濕熱改性條件下,薄膜體外酶解抗性和抗拉強度明顯增強;通過傅里葉紅外光譜分析發現,濕熱改性使玉米醇溶蛋白的β-轉角結構向結構更加有規則的無規卷曲、β-折疊和α-螺旋結構轉變。孫宏霞等[4]指出大豆蛋白質的變性與紅外加熱的時間和溫度,以及水有很大的關聯。上述研究表明,熱誘導變性后的結構主要由新的分子間作用力維持,特別是暴露的巰基之間的共價鍵;熱誘導變性會改變分子結構,從而影響薄膜各項理化指標。

前人研究采用單一溫度條件加熱的方式忽視溫度梯度變化對蛋白質多肽鏈的解鏈過程和程度的影響,少有學者提出分梯段加熱蛋白膜溶液探究薄膜成膜性能的變化,為了補充這一研究領域的空白。研究擬采用低溫誘導肽鏈的解鏈和高溫不可逆變性重新產生聚集體的階梯加熱的方法來制備可食性薄膜,以期改良薄膜阻隔性能和力學性能。

1 材料與方法

1.1 原材料和試劑

乳清分離蛋白粉:蛋白質質量分數≥98%,美國Isopure公司;

酪蛋白酸鈉:蛋白質質量分數≥99.21%,上海麥克林生化科技有限公司;

普魯蘭多糖:質量分數為98%,上海薩斯化學技術有限公司;

丙三醇(甘油):分析純,上海麥克林生化科技有限公司;

去離子水:實驗室自制;

其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

紫外分光光度計:U-3900型,日本日立高新技術科學公司;

色差儀:CR-400型,日本柯尼卡美能達有限公司;

接觸角測量儀:JC2000C型,上海中晨數字技術設備有限公司;

氧氣透過率測試儀:OX-TRAN2/2H型,美國MOCON公司;

水蒸氣透過率測試儀:PERMATRAN-W1/50G型,美國MOCON公司;

智能電子拉力試驗機:XLW(EC)型,濟南藍光機電技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 兩段加熱復合膜的制備 在郄梓含等[5]的方法上進行改進,CK1、CK2為對照組分別代表空白組25 ℃溶解、一段加熱85 ℃,A、B、C、D、E為試驗組分別代表兩段階梯加熱35 ℃/85 ℃、40 ℃/85 ℃、45 ℃/85 ℃、50 ℃/85 ℃、50 ℃/85 ℃。溶解:用分析天平稱量13.6 g乳清分離蛋白,20 g普魯蘭多糖,10.22 g酪蛋白酸鈉,分別溶解在200 mL去離子水中,在25 ℃水浴中分別攪拌2 h充分溶解后,將酪蛋白酸鈉與乳清分離蛋白、普魯蘭多糖混合后攪拌均勻1 h,等分為5份,分別在35,40,45,50,55 ℃磁力水浴鍋攪拌1 h進行一段低溫誘導使蛋白鏈展開,再二段加熱,85 ℃恒溫水浴15 min,使球狀蛋白質中的疏水基團暴露出來便于重新聚合。增塑:將85 ℃變性的蛋白溶液冷卻至室溫,加入質量分數為35%的甘油,攪拌1 h。脫氣和干燥:攪拌后的溶液冷卻至室溫后,于室溫、真空度0.098 MPa條件下脫氣1 h,肉眼觀察無氣泡,脫氣結束。倒入平面皿,在65 ℃鼓風干燥箱中干燥5～6 h形成復合膜,再將膜放在30 ℃,濕度50%的恒溫箱中靜置24 h待測。

1.3.2 薄膜力學性能測定

(1) 厚度:根據Sukyai等[6]的方法修改如下:薄膜的厚度是利用0～25 mm量程,精度為0.001的電子數顯螺旋測微儀進行測量。選取薄膜隨機的5個位點,取平均值。

(2) 機械性能:根據Pankaj等[7]的方法修改如下:使用XLW(EC)智能電子拉力試驗機測量薄膜的拉伸強度和斷裂伸長率。待測的薄膜被切成20 mm×150 mm的矩形,有效夾持長度為65 mm,拉伸速度為300 mm/min,每種薄膜測量3次,取平均值。

1.3.3 透光率測定 根據Han等[8]的方法修改如下:將薄膜裁剪為0.8 cm寬,2.0 cm長的矩形,貼在紫外分光光度計的比色皿內壁,使用紫外分光光度計在200～800 nm波長范圍內測定薄膜對光的吸收特性,不放置樣品的比色皿為空白對照。每組薄膜測量3次取平均值。

1.3.4 氧氣透過率測定 根據Gounga等[9]的方法進行測定,用樣品切割器將薄膜切成直徑約為50 mm的樣品,氣體輸出壓力調節至0.50 MPa,用于測試薄膜兩側之間的壓力為101.3 kPa,在25 ℃下測定薄膜的氧氣滲透率,每組薄膜測量3次取平均值。

1.3.5 水溶性測定 根據Carvalho等[10]的方法測試薄膜的水溶性。將樣品切成2.0 cm×2.0 cm的小塊,在105 ℃的烘箱中干燥24 h稱量初始重量記為W1,將薄膜置于50 mL蒸餾水中24 h。取出未溶解的薄膜樣品于105 ℃下再次干燥,直至恒重,最終質量記為W2。每個樣品測定均重復3次。根據式(1)計算薄膜的水溶性(water solubility,WS)。

(1)

式中:

S——水溶性,%;

W1——薄膜初始重量,g;

W2——薄膜干燥至恒重質量,g。

1.3.6 薄膜表面接觸角測定 裁剪1.0 cm×3.0 cm的薄膜放置于垂直液滴下0.5 cm處,將3～4 μm的蒸餾水滴在薄膜表面用測角儀相機快速拍攝液滴和薄膜接觸圖像,每張薄膜測量3個不同的位點用ImageJ軟件對獲取的圖像進行分析。

1.3.7 水蒸氣透過率測定 根據文獻[11]采用PERMATRAN-W1/50G型水蒸氣透過率測試儀測定。儀器參數設置:兩側相對濕度10%/100%,測試溫度37.8 ℃。每種薄膜測量3次,求平均值。

1.3.8 紅外光譜分析 將成膜基質放于65 ℃烘箱中干燥5～6 h去除水分,測試環境濕度保持在35%以下,分辨率4 cm-1,掃描范圍4 000～500 cm-1,掃描次數16次,采用Omnic8.0軟件進行光譜分析[12]。

1.3.9 薄膜色差分析 選擇色差儀測定薄膜的顏色,每種薄膜測量3次;標準白板(L′=92.16,a′=1.13,b′=3.96)對儀器背景值進行校準,測定膜的L、a和b值。按式(2)計算總色差。

(2)

式中:

ΔE——膜與標準白板的色差值;

L、L′——薄膜、標準白板亮度;

a、a′——薄膜、標準白板紅綠色度;

b、b′——薄膜、標準白板黃藍色度。

1.3.10 聚丙烯酰胺凝膠電泳 根據Laemmli[13]和尹燕霞等[14]的方法修改如下:蛋白膜溶液用去離子水稀釋10倍,在25 ℃水浴中磁力攪拌15 min后進行蛋白質電泳,分離膠和濃縮膠的質量分數分別為12%,5%。電泳后,用考馬斯亮藍對凝膠進行蛋白質染色。

1.3.11 差示掃描量熱(DSC) 根據Tavares等[15]的方法修改如下:稱量薄膜樣品(約5 mg)密封在鋁盤內,空樣品鋁盒作為對照,在氮氣保護下(吹掃氣流為20 mL/min),以10 ℃/min的加熱速率從0 ℃到200 ℃進行加熱。

1.4 統計分析

每組樣品測量3次平行樣。使用SPSS 20軟件通過ANOVA對數據進行統計處理和分析。數據表示為平均值±標準差,并使用Origin 9.0進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 薄膜力學性能

CK1處理條件下乳清分離蛋白僅具有弱的相互作用,如靜電力、疏水和親水相互作用薄膜力學性能較低,與Guckian等[16]所報道的結論相似。階梯加熱的加工工藝方式使蛋白質疏水核心的基團裸露出來,在疏水作用力的影響下形成新的鏈間二硫鍵,二硫鍵與其他次級鍵的共同作用下增強了成膜基材的內聚力,天然蛋白在熱變性后具有強的相互作用力。如圖1所示,階梯加熱的處理方式對比對照組CK1、CK2薄膜的抗拉強度(TS)、斷裂伸長率(EAB)變化顯著(P<0.05)。處理C與A、B、D、E以及對照組相比TS、EAB較大,變化顯著(P<0.05),分析其主要原因可能是:45 ℃/85 ℃兩段階梯加熱的第一段加熱溫度為45 ℃對比25,35,40 ℃第一段加熱溫度較高蛋白質肽鏈舒展程度更高,成膜基質多糖、甘油、酪蛋白酸鈉分子之間作用更加充分,蛋白肽鏈之間或蛋白鏈和多糖、甘油的聚合程度高,分子之間作用力強,薄膜的韌性和強度也有所增強。50,55 ℃較高溫度可能會破壞一些弱的次級鍵如氫鍵的形成,影響分子之間的團聚,繼而影響薄膜的力學性能。階梯加熱對蛋白質解鏈的可調性是影響薄膜性能的關鍵原因。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 氧氣透過率變化

如圖2所示,處理C薄膜的最低氧氣滲透率(OP)與CK1、CK2、A、B、E的具有顯著性差異(P<0.05)。這與蛋白質交聯程度的加強,二硫鍵數目的增加有關。二硫鍵數目的增加會使蛋白質肽鏈之間自由體積減少,可提高薄膜對氧氣的阻隔性能。這與Schmid等[17]的研究結果相似。45 ℃/85 ℃處理的蛋白質與多糖的交聯共軛更充分,這些綜合作用使成膜溶液的空間三維結構改變,形成黏度更大、更致密的聚集體。說明薄膜致密結構越緊湊薄膜的OP值越小。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3 水蒸氣透過系數變化

如圖3所示,階梯加熱45 ℃/85 ℃處理的薄膜具有最低的水蒸氣透過系數(WVP),表現出更好的水蒸氣阻隔性能,有較強的阻隔水蒸氣交換或者遷移的能力。原因是45 ℃/85 ℃階梯加熱使球狀蛋白的疏水核心基團如巰基、含苯環的芳基、酯基等由于肽鏈的舒展而裸露,減少了薄膜的親水位點,薄膜的WVP減小顯著。Fang等[18]指出一些疏水性官能團的加入也可以減少薄膜的親水位點,增強薄膜的水蒸氣阻隔性能。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

成膜溶液在一段加熱(25 ℃)條件下,羥基、羧基、氨基和增塑劑甘油能夠與極性水分子親和,水分子更容易穿越薄膜而不被阻攔和排斥,薄膜親水性較強,水蒸氣透過率較高。處理C與其他處理條件A、B、D、E有顯著性差異(P<0.05),主要原因是解鏈程度對分子之間的作用強度有關,與疏水核心非極性基團的暴露數目和氫鍵數目有關。圖3表明,較高的處理溫度(處理D)不利于氫鍵的形成和分子團聚而影響薄膜對水蒸氣的阻隔性能。階梯加熱由于改變了蛋白的疏水基團的暴露程度和結構致密程度從而改變薄膜的水蒸氣阻隔性能。

2.4 水溶性變化

如圖4所示,兩段階梯加熱45 ℃/85 ℃處理的薄膜水溶性(WS)最小,表明其抵抗水破壞的能力最強。兩段階梯加熱過程中,熱變性使肽鏈舒展延伸在肽鏈之間形成強相互作用的二硫鍵[19],所以兩段階梯加熱薄膜對比CK1表現出水溶性較低。Jafari等[20]提出了相似的觀點即熱變性使分子之間相互作用力增強,可以降低成膜基材在水中的溶解度,分子間的作用力和非極性共價鍵是薄膜力學性能、阻隔性能重要的影響因素。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

一段加熱的薄膜CK1在去離子水中,薄膜的完整性被破壞,出現斷裂。原因是薄膜的凝膠化和交聯程度不足,空間網絡結構強度較低,肽鏈或肽鏈之間的半胱氨酸由于無法充分裸露而未形成強的二硫鍵,二硫鍵是穩定蛋白質分子結構的重要因素。對比處理C與CK1、A、B、D和E可知,蛋白解鏈后基團的裸露程度增大、關鍵基團之間的相互作用力變化、巰基數目的增加增強了基團之間的作用效果,繼而顯著影響薄膜各項指標。通過水溶性分析發現,增強蛋白質的變性程度可能直接影響較強共價鍵的形成,從而降低了薄膜在水中的溶解度。

2.5 接觸角表征薄膜疏水性變化

如表1所示,所有薄膜接觸角都小于90°,表現為較弱的親水性。引入疏水性較強的非極性共價鍵和基團可以改良薄膜表面疏水性[21]。兩段階梯加熱(45 ℃/85 ℃處理)的薄膜,相對而言接觸角較大,可能的原因:① 兩段階梯加熱過程中,蛋白凝膠化增強,多糖、甘油、小分子低聚物蛋白充斥在這種致密網絡結構中并形成較強的分子間作用力和次級鍵,這種致密結構形成的薄膜具有阻隔其他液相(水或油)滲透的能力;② 乳清蛋白、酪蛋白酸鈉與多糖的共軛。試驗結果表明,在45 ℃/85 ℃處理的階梯加熱中,蛋白質疏水核心暴露得越充分,形成新的共價基團的可能性增大,薄膜性能更趨于穩定。

表1 薄膜接觸角變化?

2.6 阻光性變化

圖5 紫外光譜吸收圖

2.7 薄膜色差分析

試驗組與對照組在ΔL值(L-L′)上沒有明顯的差異(表2),且值均大于85,表現出較強的亮度,Δa值(a-a′)為負值,其負值越小薄膜的顏色越偏向綠色,Δb值(b-b′)為正值,其值越大,薄膜的顏色越偏向黃色。試驗組與對照組薄膜整體呈明亮的弱黃色,可能是由于:① 乳清分離蛋白和酪蛋白酸鈉自身具有微黃的原始顏色;② 薄膜在制備干燥(65 ℃烘干)過程中蛋白和多糖發生了美拉德反應。蛋白質的賴氨酸ε-氨基、組氨酸、色氨酸的咪唑基和吲哚基團,以及蛋白質和肽鏈末端氨基酸殘基的α-氨基與還原性多糖羰基縮合,形成席夫堿,發生美拉德非酶褐變反應[25]。

表2 薄膜色差的變化?

2.8 傅里葉紅外光譜分析

圖6 傅里葉紅外光譜圖

2.9 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析不同處理條件下的成膜溶液

乳清分離蛋白主要的成分是α-乳白蛋白(α-La)、β-乳球蛋白(β-Lg),兩者含有豐富的鏈間二硫鍵和游離巰基。如圖7所示,CK1、CK2、A、B的處理條件下,顯示出更強的條帶,C、D、E條帶變弱,這是由于第一階段加熱溫度較高導致第二階段更高程度的蛋白質變性、聚集和交聯,降低了蛋白質的溶解度[29],這與薄膜水溶性較低保持一致。電泳條帶分析表明,兩段階梯加熱能增強薄膜變性解鏈的程度,蛋白鏈的基團之間反應效果越明顯,蛋白質越容易聚集交聯形成團聚物。數據分析表明,薄膜的各項指標與蛋白質解鏈后分子之間作用力有關,成膜基質之間作用力越強,形成的高度聚合物越穩定。

圖7 一段加熱和兩段加熱電泳圖

2.10 DSC分析

如圖8所示,所有薄膜都顯示出吸熱峰,各組的DSC曲線在150～175 ℃范圍內有兩處尖銳的熔融吸收峰,對應其兩段熔融吸收峰溫度(Tm)。從左往右第一個峰可能是弱的相互作用力和一些弱的次級鍵轉換熱吸收峰,第二個峰是薄膜主要的熱吸收峰,它可以反映出薄膜的有序結構或化學鍵在熱力作用下的破壞情況[30]。溫度處理的不同方式CK2、A、B、C、D、E的熔融峰發生了低位移且試驗組Tm呈先增大后回落的現象。45 ℃/85 ℃處理的薄膜Tm值分別為165,171 ℃,高于其他各組薄膜,表現出更高的熱穩定性,意味著打破該條件下蛋白質的結構需要更多的能量。結合電泳條帶分析,45 ℃/85 ℃處理的蛋白溶液變性程度更高,分子之間作用力更強致使薄膜的穩定性更強。二硫鍵斷裂形成新的鏈間二硫鍵使蛋白質的結構更加穩定限制了蛋白質鏈的移動,此外還與這種穩定的網絡結構強度有關,進一步解釋了兩段加熱的處理方式改變了成膜溶液分子之間的作用力,這與紅外圖譜的結論相似。

圖8 不同處理溫度條件下的薄膜DSC曲線分析圖

3 結論

研究通過改變成膜加熱方式優化成膜工藝,對薄膜幾個關鍵指標進行系統的表征。兩段階梯加熱的方式對改善聚合物之間的內聚力,增強薄膜基材之間的相互作用效果有調控的作用。電泳、紅外光譜、紫外光譜分析表明,聚合物基質的結構變化、分子之間的作用力強度、網絡結構的致密性與蛋白質解鏈程度有很大關系。兩段階梯加熱的處理方式優化了成膜工藝,增強了成膜基材之間的作用效果,使薄膜具有更高的力學性能、阻隔性能,更低的水溶性、水蒸氣透過性。兩段階梯加熱工藝制備的薄膜具有優良的氧氣阻隔性,試驗組45 ℃/85 ℃的兩段加熱法對提高阻氧阻濕性能、力學性能最為顯著,疏水性能有所改善,試驗制備的薄膜機械強度與低密度聚乙烯相當,但是不如高密度聚乙烯的機械強度,薄膜的機械性雖能達到包裝食品的要求,但對比其他高強度薄膜還有很大的改良空間,解決薄膜力學性能較弱的方法可以引入含有共價鍵較多的基材。第一段階梯加熱為50,55 ℃的兩段加熱方式對薄膜性能沒有進一步改善,推測更高溫度的兩段加熱方式對薄膜性能的優化效果較小,這一觀察結果節省了研究成本。