基于孟德爾隨機(jī)化方法探討炎癥性腸病與骨質(zhì)疏松性骨折的因果關(guān)系

陳尚桐, 陳躍平, 宋世雷, 黃川洪

(1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院, 廣西 南寧 530001; 2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院創(chuàng)傷骨科與手外科, 廣西 南寧 530011)

骨質(zhì)疏松癥是一種以全身骨量下降合并骨組織微結(jié)構(gòu)損壞、骨脆性增加,易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病[1］。骨質(zhì)疏松性骨折是骨質(zhì)疏松癥最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,其定義是指受到輕微外傷即發(fā)生病理性骨折[2］。基于多項研究表明,全身性的炎癥反應(yīng)與骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)生的關(guān)系密切,其中最為重要的病理機(jī)制在于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在炎癥因子的介導(dǎo)下加速破骨細(xì)胞成熟,導(dǎo)致骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生[3-4］。炎癥性腸病包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病,是一種自身免疫性的慢性非特異性腸道炎癥性疾病,且炎癥性腸病的發(fā)病率逐日上升[5］。炎癥性腸病能夠誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng),既往有研究表明炎癥性腸病可使患者骨密度降低,引發(fā)全身性骨質(zhì)疏松癥,導(dǎo)致病理性骨折頻發(fā),嚴(yán)重影響患者的身心健康[6］。目前炎癥性腸病患者骨密度降低的發(fā)病機(jī)制尚不明確,針對該類患者骨密度降低的治療仍缺乏有力的證據(jù)支持,炎癥性腸病與骨質(zhì)疏松性骨折之間是否存在因果關(guān)系尚無基因?qū)用娴拿鞔_定論,因此學(xué)術(shù)界對于炎癥性腸病患者骨密度降低的問題仍未獲得足夠重視[7］。然而,骨質(zhì)疏松性骨折作為老年患者致殘和致死的主要原因,進(jìn)一步明確炎癥性腸病是骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)病的危險因素,對制定有效的預(yù)防及治療措施具有重要的指導(dǎo)意義。

孟德爾隨機(jī)化(Mendelian randomization,MR)能夠達(dá)到模擬隨機(jī)對照試驗的目的,以遺傳變異為工具變量,遵循等位基因在受孕時隨機(jī)分配且固定的原則,能排除混雜因素的潛在干擾,有效降低因果關(guān)系估計值的偏倚,加強(qiáng)了因果推斷[8］。因此本研究選取炎癥性腸病中潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病,以及骨質(zhì)疏松性骨折樣本進(jìn)行孟德爾隨機(jī)化的研究,以明確炎癥性腸病與骨質(zhì)疏松性骨折之間存在的因果關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究設(shè)計

本研究將骨質(zhì)疏松性骨折作為結(jié)局變量,選取與炎癥性腸病(暴露因素)中的克羅恩病與潰瘍性結(jié)腸炎顯著相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)作為工具變量,使用兩樣本孟德爾隨機(jī)化分析的方法進(jìn)行暴露因素與結(jié)局變量因果關(guān)聯(lián)分析。為驗證結(jié)果可靠性,采用異質(zhì)性檢驗、敏感性分析、多效性分析來排除結(jié)果偏倚。本文采用了以下三個關(guān)鍵假設(shè)達(dá)成孟德爾隨機(jī)化滿足:① 工具變量與暴露因素之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性;② 工具變量與暴露因素-結(jié)局變量關(guān)聯(lián)的任何混雜因素不相關(guān);③ 工具變量只能通過與暴露因素的關(guān)聯(lián)影響結(jié)局。

1.2 數(shù)據(jù)來源

通過IEU數(shù)據(jù)庫分別獲得炎癥性腸病和骨質(zhì)疏松性骨折的遺傳數(shù)據(jù)。其中克羅恩病與潰瘍性結(jié)腸炎的數(shù)據(jù)均來源于Liu JZ團(tuán)隊的GWAS研究[9］,克羅恩病數(shù)據(jù)集的樣本量為20 883,SNPs數(shù)量為12 276 506;潰瘍性結(jié)腸炎樣本量為47 745,SNPs數(shù)量為156 116。骨質(zhì)疏松性骨折的遺傳數(shù)據(jù)則來自于芬蘭數(shù)據(jù)庫(The FinnGen Biobank),該數(shù)據(jù)庫收集并分析了來自50萬芬蘭參與者的基因組和健康數(shù)據(jù),其樣本量為173 619,SNPs數(shù)量為16 380 281。為避免因人種差異相關(guān)混雜因素,研究人群的遺傳背景選擇歐洲人種。基本信息見表1。

1.3 工具變量

以千人堿基對項目作為本次研究的參照[10］。選擇與暴露因素顯著相關(guān)并且相互獨立的SNPs,相關(guān)參數(shù)設(shè)置為:P<5.0×10-8,單個SNP的F>10,計算公式為F=β2/SE2,其中β為等位基因頻率,SE為估計標(biāo)準(zhǔn)誤差。為排除連鎖不平衡的干擾,設(shè)置連鎖不平衡參數(shù)r2閾值為0.001,千堿基對為10 000 kb。采用MR PRESSO檢驗將存在顯著異質(zhì)性的SNP剔除,篩選出與暴露因素顯著相關(guān)的有效SNP作為本次研究的工具變量。

1.4 孟德爾隨機(jī)化分析

采用R 4.2.0中的“TwoSampleMR”包進(jìn)行孟德爾隨機(jī)化分析,本次研究使用逆方差加權(quán)(IVW)法作為主要分析,評估暴露因素與結(jié)局之間存在的風(fēng)險。采用MR-Egger回歸法、加權(quán)中位數(shù)(Weighted Median,WME)法、簡單模式(Simple Mode)法以及加權(quán)模式(Weighted Mode)法進(jìn)行輔助因果推斷,以此評估IVW結(jié)果的可靠性,若上述結(jié)果的方向均與IVW結(jié)果一致,即認(rèn)為孟德爾隨機(jī)化分析結(jié)果可靠,P<0.05為存在統(tǒng)計學(xué)差異。F值設(shè)定為>10,即表示不存在弱工具變量偏倚,計算公式為F=R2(N-2)/(1-R2)[11］,其中R2為暴露數(shù)據(jù)庫中由SNPs解釋的變異占比,N為暴露的GWAS樣本量。

1.5 異質(zhì)性檢驗、敏感性分析、多效性分析

本研究采用IVW法、MR-Egger法進(jìn)行異質(zhì)性檢驗,當(dāng)P>0.05時,認(rèn)為SNPs之間不存在異質(zhì)性。采用MR_leaveoneout_plot函數(shù)進(jìn)行敏感性分析并將結(jié)果可視化,剔除單個SNP觀察是否對最終結(jié)果存在影響。采用MR_pleiotropy_test函數(shù)以及MR PRESSO法進(jìn)行多效性分析,當(dāng)P>0.05時,表示不存在多效性[12-13］。

2 結(jié)果

2.1 工具變量

在使用clumped函數(shù)去除連鎖不平衡后,克羅恩病剩余52個SNPs,潰瘍性結(jié)腸炎剩余88個SNPs。本次研究單一SNP對應(yīng)的F值均>10,不存在弱工具變量偏倚,本結(jié)果可靠。

2.2 孟德爾隨機(jī)化分析結(jié)果

在克羅恩病與骨質(zhì)疏松性骨折分析結(jié)果中,IVW法具有統(tǒng)計學(xué)意義[OR(95%CI):1.12(1.03-1.22),P=0.006],提示克羅恩病是骨質(zhì)疏松性骨折的危險因素;WME法分析結(jié)果同樣證明克羅恩病合并骨質(zhì)疏松性骨折風(fēng)險增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義[OR(95%CI):1.15(1.01-1.32),P=0.02];MR-Egger回歸[OR(95%CI):1.16(0.94-1.44),P=0.15]、Simple Mode法[OR(95%CI):1.15(0.88-1.50),P=0.28]以及Weighted Mode法[OR(95%CI):1.16(0.97-1.39),P=0.10]不支持克羅恩病是骨質(zhì)疏松性骨折的危險因素,但5種方法的因果效應(yīng)方向均一致。在潰瘍性結(jié)腸炎與骨質(zhì)疏松性骨折分析結(jié)果中,IVW法、MR Egger法、WME法的結(jié)果均具有統(tǒng)計學(xué)意義,OR(95%CI)分別為1.15(1.03-1.28),1.35(1.03-1.75),1.18(1.01-1.37),P均<0.05,提示潰瘍性結(jié)腸炎是骨質(zhì)疏松性骨折的危險因素;Simple Mode法[OR(95%CI):1.15(0.86-1.55),P=0.32]以及Weighted Mode法[OR(95%CI):1.19(0.96-1.47),P=0.10]結(jié)果不支持克羅恩病是骨質(zhì)疏松性骨折的危險因素,但5種方法的因果效應(yīng)方向均一致。見圖1。數(shù)據(jù)可視化分析說明5種方法下暴露因素克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎整體SNP的效應(yīng)升高,結(jié)局變量骨質(zhì)疏松性骨折的SNP效應(yīng)同樣升高。并且當(dāng)暴露因素SNP效應(yīng)為0時,結(jié)局變量同樣為0,說明該結(jié)果不受水平多效性的影響。見圖2。

圖1 孟德爾隨機(jī)化分析森林圖

圖2 孟德爾隨機(jī)化分析結(jié)果圖

2.3 異質(zhì)性檢驗、敏感性分析、多效性分析

異質(zhì)性檢測中,克羅恩病與骨質(zhì)疏松性骨折的IVW法P=0.55,MR-Egger法P=0.52;潰瘍性結(jié)腸炎與骨質(zhì)疏松性骨折的IVW法P=0.23,MR-Egger法P=0.25,均提示SNPs之間并不存在異質(zhì)性。漏斗圖呈現(xiàn)出大致對稱的形狀,提示本次研究受異質(zhì)性的影響造成結(jié)果偏倚的可能性小(圖3)。敏感性分析采用MR_leaveoneout_plot函數(shù)逐個提出SNP后,克羅恩病與骨質(zhì)疏松性骨折、潰瘍性結(jié)腸炎與骨質(zhì)疏松性骨折的IVW分析結(jié)果與納入全部SNPs的分析結(jié)果接近,未發(fā)現(xiàn)對因果關(guān)聯(lián)估計值影響較大的SNP(圖4)。多效性分析中,克羅恩病與骨質(zhì)疏松性骨折的MR_pleiotropy_test函數(shù)結(jié)果提示P=0.69,MR PRESSO法P=0.55;潰瘍性結(jié)腸炎與骨質(zhì)疏松性骨折的MR_pleiotropy_test函數(shù)結(jié)果提示P=0.20,MR PRESSO法P=0.24;結(jié)果均提示本次研究不受水平多效性影響。

圖3 兩樣本孟德爾隨機(jī)化結(jié)果漏斗圖

圖4 “Leave-one-out”敏感性分析結(jié)果

3 討論

本次兩樣本孟德爾隨機(jī)化研究驗證了炎癥性腸炎和骨質(zhì)疏松性骨折之間的因果關(guān)系。其中在克羅恩病與骨質(zhì)疏松性骨折分析結(jié)果中,IVW法、WME法分析結(jié)果存在統(tǒng)計學(xué)意義,其余方法分析結(jié)果方向一致;在潰瘍性結(jié)腸炎與骨質(zhì)疏松性骨折分析結(jié)果中,IVW法、MR Egger法以及WME法結(jié)果存在統(tǒng)計學(xué)意義,其余方法分析結(jié)果方向一致。因此該結(jié)果提示炎癥性腸炎和骨質(zhì)疏松性骨折的因果效應(yīng)保持穩(wěn)定。Lewandowski等[14］對431例樣本研究發(fā)現(xiàn),有7.3%的炎性腸炎患者合并骨質(zhì)疏松癥,炎性腸炎患者患骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險顯著高于健康者。Ratajczak等[15］研究結(jié)果表明36%的炎性腸炎患者合并骨質(zhì)疏松癥。Saadah等和Jin等[16-17］學(xué)者發(fā)現(xiàn)患克羅恩病的兒童及青少年相較于成人同樣存在較高骨密度降低的風(fēng)險。Targownik等[18］研究結(jié)果表明,克羅恩病患者中一個或多個部位(雙側(cè)髖關(guān)節(jié)、股骨頸、大粗隆、腰椎)的骨質(zhì)疏松性骨折風(fēng)險相對增加約50%。Hidalgo等[19］的Meta分析中,炎性腸炎與骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)生風(fēng)險存在顯著相關(guān)性。Bartko等[20］在531例炎癥性腸病患者的臨床研究中發(fā)現(xiàn),炎性腸炎與老年患者的髖部骨折密切相關(guān),并且克羅恩病女性中死亡風(fēng)險顯著升高。Wong等[21］針對小兒炎癥性腸病的研究結(jié)果表明,炎性腸炎能夠引起全身的慢性炎癥,即使不使用糖皮質(zhì)激素,椎體骨折的風(fēng)險也會增加。本次孟德爾隨機(jī)化結(jié)果與上述臨床觀察一致,進(jìn)一步說明了結(jié)果的可靠性。

目前,炎癥性腸病被認(rèn)為與骨量降低、脊柱炎、關(guān)節(jié)炎以及全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后并發(fā)癥等骨科疾病關(guān)系密切[22-23］。有研究表明炎癥性腸病患者體內(nèi)的鈣、鎂、鋅和磷等電解質(zhì)水平偏低,鈣、鎂、鋅、磷的代謝異常均能誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生[24-26］。炎癥性腸病患者腸道吸收不良,維生素D、維生素K的缺乏同樣是影響患者骨密度的重要因素[27-28］。炎癥性腸病誘導(dǎo)的全身炎癥是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松性骨折的又一重要原因[29］。本研究中rs2188962位于5號染色體上、是C5orf56基因的內(nèi)含子,rs1887428位于9號染色體上、是JAK2基因5′端的非翻譯區(qū),有文獻(xiàn)報道稱該類遺傳變異與全身炎癥的關(guān)系密切[30-31］。學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為核因子κB受體活化因子配體(RANKL)與骨保護(hù)素(OPG)比值的失衡在炎癥性腸病導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥中起到關(guān)鍵的作用。炎癥性腸病通過全身多種免疫細(xì)胞介導(dǎo)引起全身炎癥反應(yīng),大量細(xì)胞因子在該過程中被激活,例如腫瘤壞死因子(TNF)、白介素1(IL-1)或IL-6等,該類細(xì)胞因子通過免疫受體酪氨酸激活基序(ITAM)蛋白介導(dǎo)的SYK信號通路參與破骨細(xì)胞的活化,并且能夠通過下調(diào)OPG的表達(dá),上調(diào)RANKL的表達(dá),以此來增強(qiáng)破骨細(xì)胞功能,并抑制成骨細(xì)胞功能[32］。全身炎癥反應(yīng)同樣能夠激活RANKL,激活的RANKL與破骨細(xì)胞表面的核因子κB受體活化因子(RANK)結(jié)合,進(jìn)而激活破骨細(xì)胞。在RANK和RANKL相互作用下,最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。此外,文獻(xiàn)報道RNA測序結(jié)果提示在結(jié)腸炎的微炎癥環(huán)境刺激下,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的Wnt信號傳導(dǎo)下調(diào),導(dǎo)致結(jié)腸炎小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在微炎癥環(huán)境下傾向于分化為脂肪細(xì)胞而不是成骨細(xì)胞,因此可以通過外泌體的骨靶向藥物作用緩解炎癥性腸病中的成骨細(xì)胞損失和骨質(zhì)流失[33］。目前,間充質(zhì)干細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞療法已成為治療炎癥性腸病的新興治療方式,主要是通過分泌抗炎物質(zhì)、改善微環(huán)境以及免疫調(diào)節(jié)來治療炎癥性腸病,或許間充質(zhì)干細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞療法能成為預(yù)防炎癥性腸病導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松性骨折的重要治療手段,這仍需要進(jìn)一步研究。

本研究中的IVW法結(jié)果表明,克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎是骨質(zhì)疏松性骨折的高危因素,考慮到遺傳變異的作用時間長,作用效果穩(wěn)定,因此可以把骨質(zhì)疏松性骨折列為炎癥性腸病的潛在并發(fā)癥之一。近年來,炎癥性腸病在我國發(fā)病率呈顯著上升的趨勢,且克羅恩病的發(fā)病人群多見于青少年,因此有必要在炎癥性腸病患者中進(jìn)行骨質(zhì)疏松指標(biāo)的篩查,若診斷為骨質(zhì)疏松癥,應(yīng)及時及早行抗骨質(zhì)疏松治療,防止骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生。但本次研究也存在局限性:① 本研究納入的GWAS數(shù)據(jù)為歐洲族裔,后續(xù)還需要在東亞人及其他族裔中進(jìn)行孟德爾隨機(jī)化分析;② 納入數(shù)據(jù)缺少具體國家、地域及性別、年齡等,未能進(jìn)行分層分析,研究結(jié)果可能存在偏倚。