依匹哌唑對結腸癌細胞系HCT116和SW620細胞內膽固醇合成的影響及其機制

李婷，龍小藝，劉肖潔，陳衛

川北醫學院基礎醫學與法醫研究所，四川 南充 637000

結直腸癌是世界上最常見的三大癌癥之一，發病率和死亡率都很高［1］。在目前手術、化療、放療等標準治療下，結直腸癌患者5年相對生存率為65%。然而，在IV 期結直腸癌患者中，這一比例降至12%［2］。因此，尋找新的抗癌機制和藥物對結直腸癌的防治具有重要意義。到目前為止，已有多項研究［3］發現結直腸癌與血清高膽固醇水平之間存在關聯，這意味著結直腸癌的發生進展與膽固醇合成代謝密切相關。膽固醇是細胞的能量來源之一，可由哺乳動物細胞通過甲羥戊酸途徑合成［4］。此外，膽固醇還參與細胞膜的合成，并作為信號分子參與信號級聯［5-6］。因此，膽固醇合成代謝在腫瘤發生發展中起著重要作用［7］。近年來，非典型抗精神病藥物被報道對多種癌癥有潛在的治療效果［8］，比如新型抗精神病藥物依匹哌唑。2015年，依匹哌唑被FDA批準用于治療重度抑郁和成人精神分裂癥，不良反應小且安全性好［9］。研究［10-12］表明，依匹哌唑具有一定的抗癌作用，可在胰腺癌、非小細胞肺癌、膠質母細胞瘤的癌細胞和癌癥干細胞中發揮抗癌效應。然而依匹哌唑在結直腸癌中的作用及其機制尚不明確。2022年10月—2013年2月，我們觀察了依匹哌唑對結腸癌細胞系HCT116 和SW620 細胞內膽固醇合成的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 依匹哌唑、細胞、試劑 依匹哌唑購于上海畢得醫藥科技有限公司。人結腸癌細胞系HCT116 和SW620 均購買于武漢普諾賽生命科技有限公司。McCoy's 5A 培養基購自索萊寶公司；胎牛血清、DMEM 培養基、雙抗購自Gibco公司。CCK-8試劑購自Dojindo 公司。逆轉錄酶試劑盒、PCR 擴增試劑（TB Green?Premix Ex Taq? Ⅱ）購于日本TaKaRa 公司。所用引物由Primer6 軟件設計并由上海生工公司合成。總膽固醇（TC）檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 細胞培養及分組 HCT116、SW620 細胞分別選用McCoy's 5A 培養基、DMEM 高糖培養基在5%CO2、37 ℃的環境中進行培養，培養基中均添加有10% FBS 及1% 雙抗。取對數生長期HCT116、SW620 細胞，分別分為依匹哌唑組和對照組，依匹哌唑組加入含20 μmol/L 依匹哌唑的培養基，對照組加入等量完全培養基，各組細胞繼續培養24 h 后用于后續實驗。

1.3 兩組細胞中總膽固酮（TC）檢測 采用微板法。取兩組細胞，胰酶消化、PBS 重懸后加入96 孔板中，使用超聲破碎機破碎細胞20 min，加入TC 測定試劑，使用酶標儀于510 nm 處測定細胞OD 值，計算各組細胞中TC含量。

1.4 兩組細胞中人3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶（HMGCR）、人3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶1（HMGCS1）mRNA和蛋白檢測

1.4.1 兩組細胞中HMGCR、HMGCS1 mRNA 檢測 采用實時熒光定量PCR 法。取兩組細胞，使用TRIzol 試劑提取細胞總RNA，取1 μg 總RNA 逆轉錄為cDNA 后，使用SYBR Premix Ex TaqTM 試劑進行PCR 擴增。引物序列如下：HMGCR 上游引物為5′-TGATTGACCTTTCCAGAGCAAG-3′，下游引物為5′-CTAAAATTGCCATTCCACGAGC-3′；HMGCS1 上游引物為5′-CATTAGACCGCTGCTATTCTGTC-3′，下游引物為5′-TTCAGCAACATCCGAGCTAGA-3′；內參基因GAPDH 上游引物為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物為3′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-5′。反應體系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA 模板2 μL，滅菌水8.5 μL。PCR 反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40 個循環。以2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達量。

1.4.2 兩組細胞中HMGCR、HMGCS1 蛋白檢測采用Western Blotting 法。取兩組細胞，用RIPA 裂解液（含PMSF、磷酸酶抑制劑）于4 ℃裂解30 min 后離心提取總蛋白。通過SDS-PAGE 膠分離出蛋白，并轉移到PVDF 膜上，快速封閉液封閉10 min，4 ℃分別敷育一抗，β-actin（1∶2000）、HMGCR（1∶2000）、HMGCS1（1∶1000）過夜。次日，洗膜后敷育二抗1 h后，將顯影液滴加在PVDF 膜上，用ECL 化學發光儀顯影并拍照。以β-actin 為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.5 兩組細胞中PI3K/Akt-SREBP2 信號通路蛋白p-PI3K、p-AKT、SREBP2 表達檢測 采用Western Blotting 法。檢測步驟參照“1.4.2”，一抗濃度分別為p-PI3K（1∶1000）、p-AKT（1∶1000）、SREBP2（1∶1000），以β-actin為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.6 統計學方法 采用SPSS24.0 和Graphpad Prism 5.0統計軟件。計量資料呈正態分布時以±s表示，比較用配對t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組細胞中TC 含量比較 對照組、依匹哌唑組HCT116 細胞中TC 含量分別為（0.210± 0.054）、（0.039± 0.022）gprot/L，兩組相比，P＜0.05。對照組、依匹哌唑組SW620 細胞中TC 含量分別為（0.140± 0.025）、（0.014± 0.007）gprot/L，兩組相比，P＜0.05。

2.2 兩組細胞中HMGCR、HMGCS1 mRNA 和蛋白相對表達量比較

2.2.1 兩組細胞中HMGCR、HMGCS1 mRNA 相對表達量比較 對照組、依匹哌唑組HCT116 細胞中HMGCR mRNA 相對表達量分別為1.00± 0.00、0.61± 0.02，兩組相比，P＜0.05；對照組、依匹哌唑組HCT116 細胞中HMGCS1 mRNA 相對表達量分別為1.00± 0.00、0.56± 0.03，兩組相比，P＜0.05。對照組、依匹哌唑組SW620 細胞中HMGCR mRNA 相對表達量分別為1.00± 0.00、0.70± 0.02，兩組相比，P＜0.05；對照組、依匹哌唑組SW620 細胞中HMGCS1 mRNA 相對表達量分別為1.00± 0.00、0.53± 0.03，兩組相比，P＜0.05。

2.2.2 兩組細胞中HMGCR、HMGCS1 蛋白相對表達量比較 對照組、依匹哌唑組HCT116 細胞中HMGCR 蛋白相對表達量分別為2.10± 0.10、0.50± 0.14，兩組相比，P＜0.05；對照組、依匹哌唑組HCT116 細胞中HMGCS1 蛋白相對表達量分別為3.00± 0.20、1.10± 0.09，兩組相比，P＜0.05。對照組、依匹哌唑組SW620 細胞中HMGCR 蛋白相對表達量分別為1.30± 0.02、0.33± 0.04，兩組相比，P＜0.05；對照組、依匹哌唑組SW620 細胞中HMGCS1蛋白相對表達量分別為1.10± 0.06、0.36± 0.06，兩組相比，P＜0.05。

2.3 兩組細胞中p-PI3K、p-AKT、SREBP2 蛋白相對表達量比較 對照組、依匹哌唑組HCT116 細胞中p-PI3K 蛋白相對表達量分別為2.20± 0.18、0.28±0.12，兩組相比，P＜0.05；對照組、依匹哌唑組HCT116 細胞中p-AKT 蛋白相對表達量分別為1.60± 0.14、0.46± 0.25，兩組相比，P＜0.05；對照組、依匹哌唑組HCT116細胞中SREBP2蛋白相對表達量分別為2.20± 0.05、1.60± 0.02，兩組相比，P＜0.05。對照組、依匹哌唑組SW620 細胞中p-PI3K 蛋白相對表達量分別為0.87± 0.13、0.10± 0.05，兩組相比，P＜0.05；對照組、依匹哌唑組SW620細胞中p-AKT 蛋白相對表達量分別為0.62± 0.07、0.29±0.05，兩組相比，P＜0.05；對照組、依匹哌唑組SW620 細胞中SREBP2 蛋白相對表達量分別為0.95± 0.07、0.20± 0.04，兩組相比，P＜0.05。

3 討論

結直腸癌的發生是一個緩慢、隱匿、多步驟的發展過程，從癌前病變到結直腸癌需要5～10年時間［13］，并且與患者一些風險因素（年齡、性別和家族易感體質）和環境（飲食、超重和吸煙）密切相關［14］。高膽固醇血癥已被認為是癌癥的重要危險因素。除血清膽固醇外，細胞內膽固醇也被證明在腫瘤進展的調節中起著至關重要的作用。研究［15］顯示，在腫瘤組織中細胞內膽固醇水平也升高，并促進了癌細胞的增殖、遷移和侵襲。靶向膽固醇合成途徑已被認為是一種抗腫瘤的策略［16］。

本研究證實，依匹哌唑能顯著降低結腸癌細胞內TC 含量，并下調膽固醇合成關鍵酶HMGCR 和HMGCS1 的表達，這些結果表明依匹哌唑能抑制結腸癌細胞內膽固醇合成。多項研究證實HMGCR 在膠質母細胞瘤、胃癌和前列腺癌細胞中有致癌作用，另有研究［17-18］表明HMGCR 還與結直腸癌的預后有關。此外，有報道［19-20］稱HMGCS1 在乳腺癌和胃癌中促進腫瘤生長。相反，抑制HMGCS1 可抑制結直腸癌細胞的增殖［21-22］。

固醇調節元件結合蛋白（SREBPs）是一個轉錄因子家族，由SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP2組成。SREBP前體（SREBP-P）在內質網膜上合成。在成熟時，SREBP 進入細胞核并促進脂肪生成基因的轉錄。SREBP2 主要通過調節膽固醇合成關鍵酶（如HMGCR 和HMGCS1）的表達進而影響膽固醇代謝［23］。Western Blotting 結果顯示，依匹哌唑顯著下調了SREBP2 蛋白表達。SREBP2 已被證實在多種癌癥中高表達，并促進腫瘤發生和進展。最近的一項研究［24］闡明了SREBP2 介導的膽固醇生物合成對結直腸癌的生長是必不可少的。PI3K/Akt 通路激活后通過調節SREBPs 的表達在脂質合成中發揮關鍵作用，許多研究也表明SREBPs 與PI3K/Akt 通路密切相關，從而促進細胞生長和存活［25］。本研究結果表明，依匹哌唑可抑制結腸癌細胞p-PI3K、p-AKT和SREBP2蛋白的表達。

綜上，依匹哌唑可抑制HCT116 和SW620 細胞的細胞內膽固醇合成，其機制可能與依匹哌唑抑制PI3K/Akt-SREBP2信號通路蛋白的表達有關。本研究為挖掘依匹哌唑新的藥用價值提供了實驗基礎和理論依據，然而，依匹哌唑是否通過調節膽固醇合成發揮抗結直腸癌作用，仍需深入探究。此外，本研究僅局限在細胞層面，后續還將進行動物實驗進一步驗證。