人參皂苷Rg3對人晶狀體上皮細胞氧化應激損傷的影響

張 可,李 莉

1.河南省許昌市鄢陵縣中醫院眼科，許昌 461200；2.鄭州大學第一附屬醫院眼科，鄭州 450000

年齡相關性白內障是一種以晶狀體進行性渾濁為特征的致盲性眼病。晶狀體上皮細胞是晶狀體的一道生物屏障，研究發現，氧化應激造成晶狀體上皮細胞氧化損傷和細胞凋亡是導致白內障的主要機制之一［1］。人參皂苷Rg3可緩解過氧化氫誘導的人腎小球系膜細胞氧化應激損傷，抑制腎小球系膜細胞凋亡［2］。人參皂苷Rg3可增強糖尿病腎病大鼠血清中抗氧化酶的活性，抑制腎臟細胞凋亡［3］。核因子E2 相關因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）/血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）信號通路與氧化應激密切相關，苦參水提取物通過激活Nrf2/HO-1 信號通路抑制脂多糖誘導的巨噬細胞炎癥反應和氧化應激［4］。柚皮素通過激活Nrf2/HO-1 信號通路增強糖尿病小鼠抗氧化反應，可降低心肌炎癥反應，抑制心肌細胞凋亡［5］。本研究通過過氧化氫誘導建立晶狀體上皮細胞氧化應激損傷模型，探討人參皂苷Rg3 對晶狀體上皮細胞氧化應激損傷的緩解作用及其機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

全自動酶標儀（美國Bio-Rad 公司）；電泳儀（美國BD 公司）。

1.2 試藥

人參皂苷Rg3（成都曼思特生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathioneperoxidase，GSH-Px）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；噻唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）；DMEM 培養基及胎牛血清均購自美國Gibco 公司；AnnexinV-FITC/PI 流式細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技公司）；Nrf2、Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白1（Kelch like epichlorohydrin related protein 1，Keap1）和HO-1 抗體均購自美國Abcam 公司；過氧化氫（美國Sigma 公司）。

1.3 細胞

人晶狀體上皮細胞株SRA01/04（中國科學院上海細胞庫）。

2 方法

2.1 MTT 法檢測人參皂苷Rg3 對細胞存活率的影響

將復蘇后的SRA01/04 細胞培養于含100 g·L-1胎牛血清的DMEM 培養基中，置于培養箱中培養，細胞生長至80%融合時，胰蛋白酶消化傳代，取第3代對數生長期細胞，用DMEM 培養基將細胞制成單細胞懸液，密度為5×104個·mL-1，接種于96 孔板，每孔200 μL，用質量濃度分別為0、10、20、40、80 μg·mL-1的人參皂苷Rg3處理細胞6 h，每個質量濃度設置3 個復孔，棄掉培養基，用200 μmol·mL-1過氧化氫處理12 h，每孔加入MTT 溶液（5 g·L-1） 20 μL，置于培養箱中培養4 h，每孔加入DMSO 溶液200 μL，振蕩混勻，用全自動酶標儀測定570 nm 處的吸光度（A）值。細胞存活率（%）=（實驗組A值/對照組A值）×100%。

2.2 MTT 法檢測細胞存活率

取第3 代對數生長期細胞，用DMEM 培養基將細胞制成單細胞懸液，密度為5×104個·mL-1，接種于96 孔板，每孔200 μL，待細胞貼壁生長后，將細胞隨機分為正常組（培養基中加入DMSO）、氧化損傷組（培養基中加入過氧化氫200 μmol ·mL-1處理12 h）、人參皂苷Rg3低劑量組（培養基中先加入人參皂苷Rg340 μg·mL-1處理6 h，更換培養基后加入過氧化氫200 μmol·mL-1處理12 h）和人參皂苷Rg3高劑量組（培養基中先加入人參皂苷Rg380 μg·mL-1處理6 h，更換培養基后加入過氧化氫200 μmol·mL-1處理12 h），每組設定3 個復孔。按照2.1 項下方法測定細胞存活率。

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率

取第3 代對數生長期的細胞，按照2.2 項下方法進行分組處理，預冷PBS 清洗3 次，離心后，加入結合緩沖液500 μL 將細胞重懸，再加入 Annexin V-FITC和 PI 各5 μL，充分混勻，室溫下避光反應15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.4 氧化應激損傷指標的檢測

取第3 代對數生長期的細胞，按照2.2 項下方法進行分組處理，收集各組細胞培養上清液，根據試劑盒說明書檢測SOD、MDA 和GSH-Px 含量。

2.5 蛋白印跡法（Western blotting）檢測細胞中蛋白的表達情況

取第3 代對數生長期的細胞，按照2.2 項下方法進行分組處理，預冷PBS 清洗細胞3 次，加入RIPA裂解液裂解，4 ℃以12 000 r min-1離心10 min，收集上清液，用二奎啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒測定蛋白質量濃度，調整蛋白質量濃度，加入5 倍量上樣緩沖液，煮沸變性。每孔加入蛋白樣品20 μL，用SDS-PAGE 電泳凝膠，設定恒壓120 V電泳1.5 h，設定恒流0.3 A 進行濕轉，用TBST 洗膜3 次，室溫封閉1 h，加入Nrf2、Keap1、HO-1 和GAPDH 一抗（1∶1 000），在4 ℃孵育過夜，用TBST洗膜3 次，加入二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，用TBST 洗膜3 次，滴加發光液顯色，用Image J 分析條帶灰度值。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH 條帶灰度值。

2.6 統計學方法

用SPSS 21.0 統計學軟件分析數據，計量資料均以（±s）表示，多樣本計量資料比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 人參皂苷Rg3對細胞存活率的影響

細胞存活率隨人參皂苷Rg3質量濃度的增加而升高（P＜0.05）。見表1。

表1 不同質量濃度人參皂苷Rg3對細胞存活率的影響 （±s，n=3）Tab.1 Effects of different concentrations of ginsenoside Rg3 on cell survival rate （±s，n=3）

表1 不同質量濃度人參皂苷Rg3對細胞存活率的影響 （±s，n=3）Tab.1 Effects of different concentrations of ginsenoside Rg3 on cell survival rate （±s，n=3）

注：與0 μg·mL-1 比較，aP＜0.05；與10 μg·mL-1 比較，bP＜0.05；與20 μg·mL-1 比較，cP＜0.05；與40 μg·mL-1 比較，dP＜0.05。

人參皂苷Rg3質量濃度/（μg·mL-1）0 10 20 40 80 FP細胞存活率30.22%±3.39%53.69%±5.16%a 67.51%±3.67%ab 78.79%±2.61%abc 91.09%±3.78%abcd 114.118＜0.001

3.2 MTT 法檢測的結果

細胞存活率組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常組比較，氧化損傷組細胞存活率降低（P＜0.05）；與氧化損傷組比較，人參皂苷Rg3低劑量組和人參皂苷Rg3高劑量組的細胞存活率升高（P＜0.05）；與人參皂苷Rg3低劑量組比較，人參皂苷Rg3高劑量組的細胞存活率升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組細胞存活率的比較 （±s，n=3）Tab.2 Comparison of cell survival rate in each group （±s，n=3）

表2 各組細胞存活率的比較 （±s，n=3）Tab.2 Comparison of cell survival rate in each group （±s，n=3）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與氧化損傷組比較，bP＜0.05；與人參皂苷Rg3低劑量組比較，cP＜0.05。

項目正常組氧化損傷組人參皂苷Rg3低劑量組人參皂苷Rg3高劑量組FP細胞存活率97.46%±2.03%58.14%±4.04%a 75.84%±4.12%ab 84.41%±4.51%abc 56.454＜0.001

3.3 流式細胞儀檢測的結果

細胞凋亡率組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常組比較，氧化損傷組細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與氧化損傷組比較，人參皂苷Rg3低劑量組和人參皂苷Rg3高劑量組細胞凋亡率降低（P＜0.05）；與人參皂苷Rg3低劑量組比較，人參皂苷Rg3高劑量組細胞凋亡率降低（P＜0.05）。 見表3、圖1。

圖1 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況Fig.1 The cell apoptosis detected by flow cytometry

表3 各組細胞凋亡率的比較 （±s，n=3）Tab.3 Comparison of cell apoptosis rate in each group （±s，n=3）

表3 各組細胞凋亡率的比較 （±s，n=3）Tab.3 Comparison of cell apoptosis rate in each group （±s，n=3）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與氧化損傷組比較，bP＜0.05；與人參皂苷Rg3低劑量組比較，cP＜0.05。

項目正常組氧化損傷組人參皂苷Rg3低劑量組人參皂苷Rg3高劑量組FP細胞凋亡率2.31%±0.31%12.63%±1.10%a 8.67%±0.59%ab 5.25%±0.39%abc 131.450＜0.001

3.4 氧化應激損傷指標的檢測結果

SOD、MDA 和GSH-Px 含量組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常組比較，氧化損傷組MDA 含量升高，SOD 和GSH-Px 含量降低（P＜0.05）；與氧化損傷組比較，人參皂苷Rg3低劑量組和人參皂苷Rg3高劑量組MDA 含量降低，SOD 和GSH-Px 含量升高（P＜0.05）；與人參皂苷Rg3低劑量組比較，人參皂苷Rg3高劑量組MDA 含量降低，SOD 和GSH-Px 含量升高（P＜0.05）。見表4。

表4 各組細胞中SOD、MDA 和GSH-Px 含量的比較 （±s，n=3）Tab.4 Comparison of the contents of SOD, MDA and GSH-Px in each group （±s，n=3）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與氧化損傷組比較，bP＜0.05；與人參皂苷Rg3低劑量組比較，cP＜0.05。

項目正常組氧化損傷組人參皂苷Rg3低劑量組人參皂苷Rg3高劑量組FP SOD/（U·mL-1）84.50±7.79 31.23±7.66a 49.59±5.23ab 67.51±5.12abc 36.544＜0.001 MDA/（nmol·L-1）53.03±6.78 113.10±6.16a 88.35±4.12ab 69.66±2.96abc 72.790＜0.001 GSH-Px/（U·mL-1）171.23±13.23 73.74±6.88a 115.99±9.68ab 145.54±9.51abc 51.731＜0.001

3.5 Western blotting 檢測的結果

Nrf2、Keap1 和HO-1 蛋白的相對表達量組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常組比較，氧化損傷組Nrf2、Keap1 和HO-1 蛋白的相對表達量降低（P＜0.05）；與氧化損傷組比較，人參皂苷Rg3低劑量和人參皂苷Rg3高劑量組Nrf2、Keap1 和HO-1 蛋白的相對表達量升高（P＜0.05）；與人參皂苷Rg3低劑量組比較，人參皂苷Rg3高劑量組Nrf2、Keap1 和HO-1 蛋白的相對表達量升高（P＜0.05）。 見表5、圖2。

圖2 細胞中各蛋白表達Western blotting 圖Fig.2 The Western blotting of the expression level of proteins in cells

表5 各組細胞中Nrf2、Keap1 和HO-1 蛋白的相對表達量的比較 （±s，n=3）Tab.5 Comparison of the relative expression levels of Nrf2, Keap1 and HO-1 proteins in each group （±s，n=3）

表5 各組細胞中Nrf2、Keap1 和HO-1 蛋白的相對表達量的比較 （±s，n=3）Tab.5 Comparison of the relative expression levels of Nrf2, Keap1 and HO-1 proteins in each group （±s，n=3）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與氧化損傷組比較，bP＜0.05；與人參皂苷Rg3低劑量組比較，cP＜0.05。

項目正常組氧化損傷組人參皂苷Rg3低劑量組人參皂苷Rg3高劑量組FP Nrf2 0.98±0.05 0.16±0.02a 0.29±0.02ab 0.44±0.02abc 421.054＜0.001 Keap1 0.95±0.03 0.11±0.02a 0.21±0.03ab 0.34±0.02abc 655.808＜0.001 HO-1 0.97±0.02 0.13±0.02a 0.31±0.02ab 0.41±0.02abc 984.750＜0.001

4 討論

研究發現，晶狀體上皮細胞可保護晶狀體免受外界刺激，但是當其在某些刺激因子作用下發生過度凋亡時，上皮細胞的數量減少，滲透性增加，晶狀體纖維將無法保持透明狀態，從而發生渾濁，并進展為白內障［6-7］，而氧化應激引起的晶狀體上皮細胞凋亡是發生白內障的機制之一［8-9］。LU B 等［10］研究發現，miR-211 表達下調可增強晶狀體上皮細胞抗氧化應激能力，抑制細胞凋亡，促進細胞增殖。外源性過氧化氫可產生大量自由基，造成細胞氧化損傷，因此本研究通過過氧化氫誘導建立晶狀體上皮細胞氧化應激損傷模型，探討人參皂苷Rg3對晶狀體上皮細胞氧化損傷的作用及其機制。

人參皂苷Rg3是從我國傳統中藥人參中提取的活性成分，具有廣泛的藥用價值，研究報道，人參皂苷Rg3可抑制肝癌細胞增殖和侵襲［11］。HUANG W C 等［12］研究表明，人參皂苷Rg3可降低卵清蛋白誘導的哮喘癥小鼠呼吸道炎癥反應和氧化應激水平，其可能是一種潛在的免疫調節劑。人參皂苷Rg3可改善對乙酰氨基酚引起的肝損傷，其主要是通過降低炎癥反應和氧化應激水平、抑制肝細胞凋亡發揮作用［13］。正常生理狀況下，機體抗自由基損傷的酶如SOD 和GSH-Px 可有效清除活性氧和自由基，在維持自由基產生與清除平衡方面發揮重要作用，因此SOD 和GSH-Px 是評估氧化反應的常用指標［14-15］。外源性過氧化氫可產生大量自由基，氧自由基引起細胞脂質過氧化反應，進一步生成MDA，因此MDA水平直接反映了氧自由基的代謝情況和細胞受自由基損傷的程度［16］。本研究結果顯示，氧化損傷組細胞MDA 水平高于正常組，而SOD 和GSH-Px 水平低于正常組，人參皂苷Rg3低劑量組和人參皂苷Rg3高劑量組MDA 水平低于氧化損傷組，而SOD 和GSH-Px 水平高于氧化損傷組，結果表明，人參皂苷Rg3可降低過氧化氫誘導的晶狀體上皮細胞氧化應激水平。研究表明，UHRF1 過表達可升高過氧化氫誘導的晶狀體上皮細胞中SOD 和GSH-Px 水平，同時逆轉由氧化應激引起的晶狀體上皮細胞凋亡，因此UHRF1 可能成為治療白內障的潛在治療靶點［17］。本實驗結果顯示，氧化損傷組的細胞存活率低于正常組，而細胞凋亡率高于正常組，人參皂苷Rg3低劑量組和人參皂苷Rg3高劑量組的細胞存活率高于氧化損傷組，而細胞凋亡率低于氧化損傷組。結果表明，人參皂苷Rg3可抑制過氧化氫誘導的晶狀體上皮細胞凋亡，提高其增殖活性。

Nrf2 是一種與抗氧化應激密切相關的核轉錄因子，一般情況下，Nrf2 存在于細胞質中，其被錨定于肌動蛋白細胞骨架上，與其阻遏蛋白Keap1 耦聯，可被泛素化蛋白酶體降解，僅有少部分Nrf2 與Keap1解離，并轉至細胞核發揮作用，Nrf2/Keap 信號通路在氧化應激反應中具有重要調控作用［18］。在氧化應激狀態下，一旦受到氧自由基的作用，Nrf2 從Keap1介導的泛素化降解途徑分離出來，轉移入細胞核，與抗氧化反應元件結合，啟動下游多種抗氧化蛋白類基因轉錄，調節多種抗氧化酶表達，如HO-1、SOD 以及GST 等，從而發揮細胞保護作用［19］。研究表明，葛根素通過激活Nrf2/HO-1 信號通路降低MDA 水平，增強SOD 活性，可防止糖尿病大鼠白內障的發生與進展［20］。本研究結果顯示，氧化損傷組Nfr2、Keap1 和HO-1 蛋白相對表達量均低于正常組，而人參皂苷Rg3低劑量組和高劑量組Nfr2、Keap1 和HO-1 蛋白相對表達量均高于氧化損傷組。結果表明，人參皂苷Rg3可激活Nrf2/HO-1 信號通路。

綜上所述，人參皂苷Rg3可抑制過氧化氫誘導的晶狀體上皮細胞凋亡，提高其增殖活性，可能是通過激活Nrf2/HO-1 信號通路發揮調控作用的，可為臨床治療白內障提供理論依據。