一例肉雞傳染性支氣管炎與H9亞型禽流感混合感染的病例分析

林仲寅，李世恒，黃兵，李繼桐，魏可欣，格日勒圖，馬秀麗*

（1.內蒙古農業(yè)大學獸醫(yī)學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.山東省農業(yè)科學院家禽研究所/山東省禽病診斷與免疫重點實驗室/山東省家禽育種工程技術研究中心，山東 濟南 250100）

近年來，隨著國內養(yǎng)禽業(yè)規(guī)模不斷擴大，呼吸道疾病的危害日趨嚴重，而且混合感染現象頻發(fā)，臨床上難以區(qū)分。其中禽傳染性支氣管炎和H9 亞型禽流感仍是危害肉雞的主要呼吸道疾病。禽傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）是套式病毒目、冠狀病毒科、γ 冠狀病毒屬成員，全長大約有27.6 kb，是有囊膜的單股正鏈RNA 病毒，感染宿主后可以引起禽傳染性支氣管炎（Infectious Bronchitis, IB）[1,2]。IB 是一種急性、高度接觸性的呼吸道疾病，主要侵害宿主的呼吸、消化和泌尿系統(tǒng)[3]。目前發(fā)現的基因型有GI ～G Ⅶ 7 個亞型，亞型又有三十多個分型，目前國內主流基因型有GI-1、GI-7、GI-13、GI-19和GI-22 等[4]。

禽流感（Avian Influenza, AI）是由正粘病毒科禽流感病毒（Avian Influenza virus, AIV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病[5]，分為高致病性禽流感（Highly Pathogenic Avian Influenza Virus,HPAIV）和低致病性禽流感（Low Pathogenic Avian Influenza Virus, LPAIV）。禽流感病毒根據血凝素(Hemagglutinin, HA)和神經氨酸酶 (Neuraminidase, NA)抗原性的差異分型，分為18 個HA（H1 ～H18） 亞型和11 個NA（N1 ～N11）亞型[6]。目前流行的主要基因型有H9N2(LPAIV)、H7N9 和H5N6（HPAIV），Liu 等[7]對H9N2 亞型創(chuàng)建了一種新型譜系劃分的方法，更有利于統(tǒng)計該基因型的流行情況。

2023 年山東某雞場部分肉雞發(fā)生不同程度的呼吸困難，并伴有零星死亡，死亡雞剖檢可見氣管出血、支氣管栓塞、部分雞有尿酸鹽沉積。為探明其發(fā)病原因，實驗室對采集的病料優(yōu)先進行PCR 快速診斷，然后進行病毒分離鑒定，進一步探索分離毒株主要基因的遺傳變異情況，為當地采取有效的防控措施提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 毒株來源與發(fā)病情況

2023 年6 月，山東某養(yǎng)雞場飼養(yǎng)的20 日齡肉雞陸續(xù)出現氣管啰音、咳嗽、呼吸困難等呼吸道癥狀，且陸續(xù)出現死亡，發(fā)病原因尚不清楚。

1.2 剖解變化

解剖病死雞，可見支氣管栓塞，部分雞腎臟有尿酸鹽沉積。

2 實驗室診斷

2.1 SPF 雞胚與試劑

SPF 雞胚購于山東昊泰實驗動物繁育有限公司；IBV、H9 亞型AIV 陽性血清由山東省農業(yè)科學院家禽研究所保存；AxyPrep 體液病毒DNA/RNA 試劑盒購于杭州AXYGEN 公司；Onestep RT-PCR 試劑盒、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司；DL 2000 DNA Marker 購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；pMD18-T Vector Cloning Kit 購自大連寶生物有限公司；Biospin 膠回收和PCR 產物純化試劑盒購自BioFlux 公司。

2.2 病料處理及PCR 檢測

取采集的氣管、支氣管、腎臟等病料加入5倍其體積的生理鹽水進行研磨，反復凍融3 次后取出，8 000 r/min 離心5 min，提取核酸，備用。使用IBV、H9 亞型AIV、傳染性喉氣管炎（ILTV）和雞毒支原體（MG）等檢測引物對其進行PCR鑒定，根據檢測結果進行下一步試驗。

2.3 病毒分離與純化

將病料以9 000 r/min 離心30 min 取上清液，加5 000 U 青鏈霉素充分作用，分別加入IBV 和H9 亞型AIV 的陽性血清中和，作用30 min 后分別將病毒液接種9 日齡SPF 雞胚，每組接種10 個SPF 雞胚；設陰性對照組，放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每12 h 照胚一次，棄去24 h 內死亡雞胚。H9 亞型AIV 陽性血清中和組，48 h 收獲1/2 雞胚的尿囊液，進行PCR 檢測；IBV 陽性血清中和組，96 h 收獲1/2 雞胚的尿囊液，進行HA 試驗；同時用H9 陽性血清中和后進行HA 試驗。剩余的雞胚培養(yǎng)至168 h，觀察雞胚變化。

2.4 分離株基因擴增及序列分析

利用實驗室設計的引物分別擴增分離病毒的S1 基因和HA 基因全長，RT-PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將含有目的條帶的純化產物送至青島擎科生物有限公司測序。采用DNASTAR軟件與GenBank 中下載的參考株的IBV S1 或H9亞型AIV HA 基因序列進行比較分析。MEGA5.0軟件繪制進化樹，在線生物軟件NetNGlyc 1.0 Server 進行N-糖基化位點分析[8]，進一步分析IBV 或H9 亞型AIV 分離毒株的遺傳變異情況。

3 結果

3.1 PCR 鑒定結果

將提取的RNA 模板用AIV 通用、H9 亞型-AIV、IBV、NDV（新城疫病毒）、MG、IBDV（傳染性法氏囊病毒）和ITLV 等檢測引物進行檢測，檢測結果顯示AIV 通用、H9 亞型-AIV 及IBV 擴增出目的片段，分別為230、250 bp 和470 bp，與預期片段大小一致（圖1），其他引物未見特異性條帶，說明該病料中可能存在著IBV 和H9 亞型AIV 的混合感染。

圖1 PCR鑒定結果

3.2 病毒分離與雞胚接種

病料樣品分別接種SPF 雞胚后，未出現雞胚死亡，其中H9 亞型AIV 陽性血清中和組收獲尿囊液PCR 檢測為IBV 陽性，命名為SDDZ/202301（簡稱DZ01）。繼續(xù)培養(yǎng)至168 h 的雞胚發(fā)育矮小，且身體蜷縮為團狀，為IBV 典型的侏儒胚；而IBV 陽性血清中和組的雞胚正常，無明顯病變。

3.3 血凝試驗

將收獲的尿囊液進行HA 試驗，H9 亞型AIV陽性血清中和組收獲的尿囊液無HA 效價，其血凝特性能被H9 亞型AIV 陽性血清中和掉；而IBV 陽性血清中和組尿囊液對1%紅細胞的血凝效價為7 log2，其血凝特性能被H9 亞型AIV 陽性血清中和掉，進一步表明該分離毒為H9 亞型AIV，命名為SDDZ/202302（DZ02）。

3.4 分離株進化樹和同源性分析

以分離毒RNA 為模板，分別用AIV-H9 HA F/R 和IBV-S1 F/R 兩對引物進行RT-PCR 擴增，擴增片段大小分別約為1 676 bp和1 629 bp（圖2）。回收目的片段克隆至pMD18-T 載體，送青島擎科生物有限公司測序。

圖2 RT-PCR擴增結果

DZ01 S1 基因核苷酸（氨基酸）同源性分析結果顯示，DZ01 與所有參考株的核苷酸和氨基酸同源性分別是60.2%～96.7%和50.3%～95.6%,其中與GI-19（LX4）同源性最高，分別為96.7%和95.6%；蛋白裂解位點為HRRRR，與GI-19 型參考株一致。與疫苗株GI-1、GI-13和GI-22的核苷酸（氨基酸）同源性分別為77.2%（76.8%），78.3%（78.9%）和80.4%（78.3%）。基于S1基因構建的進化樹（圖3），顯示DZ01 分離株與GI-19（LX4）屬于同一分支，親緣關系最近，說明DZ01 未發(fā)生明顯變異，仍屬于當前流行的優(yōu)勢IBV。

圖3 IBV分離株DZ01與參考株S1基因進化樹

DZ02 與所有AIV-H9 參考株的核苷酸和氨基酸同源性為78.1%～95.1%和79.4%～94.2%，而與2017、2018、2019 年和2022 年毒株核苷酸（氨基酸）同源性分別為91.3%～93%（92.1%～94.1%）、91.1%～92.9%（91.8%～94.2%）、89.6%～92.7%（92.3%～94.1%）和93.1%～95.1%（92.2%～93.4%）。基于HA 基因構建的進化樹（圖4），顯示DZ02與實驗室2017～2022 年的大部分分離株親緣關系較近，均屬于H9.4.2.5 分支，說明該地區(qū)分離株仍為主流基因型H9.4.2.5 基因型。

圖4 AIV H9分離株DZ02與參考株HA基因進化樹

3.5 分離株N-糖基化位點分析

DZ01 與GI-19 型參考株進行氨基酸對比分析后，發(fā)現有13 個位點的氨基酸發(fā)生突變，分別是23（S）、65（G）、86（S）、140（F）、156～157（SR）、226（K）、275（A）、342（D）、422（T）、436（N）、486（P）、511（I），其中38～67 位氨基酸突變位于S1 基因高變區(qū) Ⅰ（HVR Ⅰ），91～141位氨基酸突變點位于HVR Ⅱ，第274～387 氨基酸突變位點則位于HVR Ⅲ。糖基化位點分析結果顯示DZ02 具有15 個N-糖基化位點，與參考株GI-19（LX4）相比較在141 位點（NGS）缺乏一個N-糖基化位點，其余位點均一致。DZ02 糖基化位點分析結果顯示有8 個N-糖基化位點，較參考株H9.4.2.5 在495（NGS）位置少一個N-糖基化位點，其余位點相同。

4 討論

近年來，因肉雞規(guī)模化程度高、養(yǎng)殖密度大，呼吸道疾病呈高發(fā)趨勢。因呼吸道疾病導致雞群抵抗力下降后感染多種傳染病的情況也比較常見，混合感染使得雞群的病死率驟升，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經濟損失[9]。張建軍等[10]曾報道IBV和AIV 混合感染后導致呼吸道出現炎性滲出物并堵塞支氣管。我們報道的病例也出現了支氣管的栓塞，結合實驗室PCR 診斷、病原分離鑒定及測序分析，明確該病例為IBV（GI-19 型）和AIVH9(H9.4.2.5 分支)混合感染。

進一步分析發(fā)現，IBV 分離株DZ01 盡管與GI-19 型親緣距離最近，屬于同一基因型，但其S1 基因發(fā)生了13 個氨基酸的突變，其中高變區(qū)Ⅰ（HVR Ⅰ）有1 個突變，HVR Ⅱ有1 個突變，HVR Ⅲ有2 個突變。這些氨基酸位點的突變是否與其致病性的改變有關值得去關注。此外，Zheng等[11]研究發(fā)現IBV 在不同位置的N-糖基化位點可能對S 蛋白介導的融合、病毒感染性和復制性產生不同的影響。高緒慧等[12]在對山東地區(qū)流行的17 株H9N2 毒株基因組遺傳進化分析時，曾推測潛在的糖基化位點可能會影響致病性。而在本研究中，DZ01 株較GI-19 型參考株在141 位點（NGS）少一個位點， DZ02 較H9.4.2.5 參考株在495（NGS）位置少一個N-糖基化位點，分離毒株的基化位點改變是否對病毒致病性和抗原性有影響需要進一步探索。

傳染性支氣管炎病毒和H9 亞型禽流感病毒均屬于條件性病原，一旦出現環(huán)境應激、飼養(yǎng)條件改變等影響，雞群感染這兩種病的概率就會大大增加。因此，養(yǎng)殖場管理者要不斷提升飼養(yǎng)管理水平，加強生物安全意識，如有發(fā)病跡象，及時進行實驗室確診，迅速采取措施，降低經濟損失。

疫苗接種仍是預防雞傳染性支氣管炎和H9 亞型禽流感的重要措施，因此，養(yǎng)殖企業(yè)要密切關注當地毒株的流行現狀，有針對性地調整免疫程序，加強抗體的監(jiān)測，掌握雞群的免疫效果，做到科學防控。