馬氏珠母貝Perlucin基因序列特征及其SNP與耐低溫性狀的關(guān)系

王 成，賴卓欣，宋欣霖，鐘如卓，鄭 哲,2,3,4，王慶恒,2,3,4

(1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/2.廣東省珍珠養(yǎng)殖與加工工程技術(shù)研究中心/3.廣東省珍珠科技創(chuàng)新中心/4.廣東省水產(chǎn)動(dòng)物病害防控與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088)

C-型凝集素（C-type Lectins,CTL）是一類廣泛分布于生物中的糖類結(jié)合蛋白，主要通過細(xì)胞黏附和聚集[1,2]、細(xì)菌清除[3]和酚氧化酶原激活[4,5]等參與先天性免疫應(yīng)答，也是固有免疫系統(tǒng)中的重要模式識(shí)別受體。Perlucin 是一種典型的C 型凝集素蛋白，在水產(chǎn)動(dòng)物先天性免疫過程中發(fā)揮重要作用：凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）[6]、雜色鮑（Haliotis diversicolor）[7]、香港牡蠣（Crassostrea hongkongensis）[8]在病原菌感染后Perlucin表達(dá)量均顯著升高，表明Perlucin 參與了三者的免疫應(yīng)答；香港牡蠣重組蛋白ChPerlucin 有抑菌效果[8]。此外，Perlucin 還參與響應(yīng)環(huán)境因子脅迫：在菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）、馬尼拉蛤蜊（Costellipitar manillae）[9]、海螺（Panopea generosa）[10-11]、悉尼牡蠣（Crassostrea commereialis）[12]、紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）[13]和墨西哥象拔蚌（Panopea abrupta）[14]等貝類中均發(fā)現(xiàn)Perlucin 參與海洋酸化脅迫響應(yīng)，在近江牡蠣（Crassostrea ariakensis）中發(fā)現(xiàn)Perlucin參與高鹽脅迫的適應(yīng)調(diào)節(jié)過程[15]。

溫度是限制動(dòng)物生長(zhǎng)、繁殖和分布的極為重要的環(huán)境因子。CTL 參與溫度脅迫響應(yīng)：菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）鰓組織中的CTL 在低溫脅迫下表達(dá)量顯著上升[16]；高溫脅迫會(huì)誘導(dǎo)大菱鲆（Scophthalmus maximus）肝臟中的CTL 同源基因SmLec1表達(dá)量上升[17]；在鹽沼貽貝（Geukensia demissa）中首次發(fā)現(xiàn)Perlucin 和Perlucin-like 蛋白在高溫脅迫下表達(dá)顯著上升[18]；在菲律賓蛤仔中，高溫和低溫脅迫均會(huì)誘導(dǎo)Perlucin在鰓組織中的表達(dá)[19]。由此可見，Perlucin等CTL 可能在貝類的溫度脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用。

馬氏珠母貝（Pinctada fucata martensii）是我國(guó)培育海水珍珠的主要養(yǎng)殖貝類之一,屬于暖水性貝類，對(duì)低溫的耐受能力弱，自然群體主要分布在深圳以南海域。除目前的主養(yǎng)殖區(qū)廣東湛江、廣西北海和海南等地外，廣東北部和福建南部等歷史分布區(qū)的耐低溫種群已消失[20]；主養(yǎng)殖區(qū)曾多次發(fā)生冬季寒潮，導(dǎo)致馬氏珠母貝養(yǎng)殖群體大規(guī)模死亡，因此培育耐低溫品系是馬氏珠母貝抵御寒潮乃至北移養(yǎng)殖的前提。賴卓欣[21]通過繼代選擇構(gòu)建了馬氏珠母貝耐低溫選育系，并通過基因組重測(cè)序發(fā)現(xiàn)，與北部灣野生群體相比，耐低溫群體包括Perlucin在內(nèi)的部分基因受到了選擇壓力。本研究從馬氏珠母貝基因組中鑒定到Perlucin基因，通過RACE克隆技術(shù)獲得馬氏珠母貝Perlucin基因（PIN_GLEAN_10008410）cDNA 序列全長(zhǎng)，對(duì)其序列特征、組織表達(dá)模式以及群體間SNP 位點(diǎn)進(jìn)行分析，探究該基因在馬氏珠母貝低溫脅迫和耐受中的功能，為其耐低溫群體培育和種群恢復(fù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用馬氏珠母貝均采自廣東省雷州市后洪村海區(qū)，為外觀正常、生長(zhǎng)旺盛、規(guī)格基本相似[殼長(zhǎng)（69.23±3.80）mm]的1.5 齡馬氏珠母貝。將馬氏珠母貝表面附著物清理干凈，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，在22 ℃海水中暫養(yǎng)48 h。隨機(jī)取馬氏珠母貝8 只，剪取閉殼肌、鰓、性腺、肝胰腺、足和外套膜（8 個(gè)生物學(xué)重復(fù)），經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)移至—80 ℃冰箱，備用。另將100 只馬氏珠母貝隨機(jī)分成2 組，分別養(yǎng)殖于300 L實(shí)驗(yàn)桶中，以17 ℃為低溫脅迫溫度[22]、22 ℃為對(duì)照在空調(diào)房中進(jìn)行溫度脅迫實(shí)驗(yàn)：將室內(nèi)溫度分別設(shè)定為17、22 ℃，使環(huán)境溫度一致。每天換水前將經(jīng)過三層沙濾的海水溫度分別調(diào)至17、22 ℃，并用控溫器和冰盒進(jìn)行溫度保持，換水時(shí)使用相同溫度海水以保證養(yǎng)殖溫度的穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)期間每天投喂等量的小球藻（Chlorella vulgaris），保持微充氣。實(shí)驗(yàn)6、12、24、48、72 h 時(shí)，每組分別隨機(jī)取8 個(gè)個(gè)體，剪取鰓組織，經(jīng)液氮速凍，置于-80 ℃冰箱冷凍保存。

1.2 方法

1.2.1Perlucin基因全長(zhǎng)克隆 參考劉雅[22]采用Trizol 法提取馬氏珠母貝閉殼肌、外套膜、鰓、足、性腺和肝胰腺的總RNA，RNA 用20～40 μL DEPC 水（焦碳酸二乙酯處理并經(jīng)高溫高壓滅菌的去離子水）溶解。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 完整性，用Nano DropND1000 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 的純度及濃度。參照SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit的說明書制備5?RACE、3?RACE模板。

利用巢式PCR 擴(kuò)增獲得Perlucin基因未知的3?和5?序列。反應(yīng)體系（10μL）：Ex Taq DNA 聚合酶0.1μL，10×Buffer 1μL，dNTPs 1.6μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 模板0.4 μL，去RNA 酶水5.3 μL。反應(yīng)程序：95 ℃5 min；95 ℃30 s，60℃30 s，72℃40 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物片段長(zhǎng)度，將與目的片段長(zhǎng)度一致的PCR 產(chǎn)物連接到pMD19-T 載體，并轉(zhuǎn)化到DH5α大腸埃希菌細(xì)胞中，用LA（含有氨芐）選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑取陽性菌送往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。用軟件DNAMAN將測(cè)序獲得的3?和5?序列與基因組中已知部分（已驗(yàn)證）[23]拼接，得到全長(zhǎng)序列。根據(jù)文獻(xiàn)[23]的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Perlucin的部分序列，用軟件Primer Premier5.0 根據(jù)引物設(shè)計(jì)要求設(shè)計(jì)引物（表1）。

表1 本研究的引物序列Table 1 Primers used in perlucin expression analysis

1.2.2Perlucin的生物信息學(xué)分析 用軟件DNAMAN 推導(dǎo)Perlucin基因全長(zhǎng)的氨基酸序列；用ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）找到Perlucin的開放閱讀框；通過Pfam（https://pfam.xfam.org/search）預(yù)測(cè)該基因的保守結(jié)構(gòu)域；用ExPASy-ProtParam tool 分析氨基酸的理化性質(zhì)，SignalP5.1軟件預(yù)測(cè)信號(hào)肽；TMHMM Server軟件分析氨基酸的跨膜結(jié)構(gòu)；采用NCBI COBALT（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/）和DNAMAN9進(jìn)行多序列比對(duì)，Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）預(yù)測(cè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)；用MegaX構(gòu)建生物系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3Perlucin的組織表達(dá)及溫度脅迫下的差異分析 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析Perlucin基因的mRNA 表達(dá)。以β-actin為內(nèi)參基因[22-24]，利用2-ΔΔCt法計(jì)算Perlucin基因在不同組織以及在實(shí)驗(yàn)溫度下各時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量。qRTPCR 反應(yīng)體系（10 μL）：上下游引物各0.4 μL，cDNA模板0.4 μL，2×PerfectStart Green qPCR SuperMix 5 μL，滅菌ddH2O 3.8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃15 s，72 ℃15 s，45 個(gè)循環(huán)；熔解曲線為95 ℃10 s，65 ℃60 s，95 ℃1 s。每組各3個(gè)樣本。使用SPSS 22.0 軟件對(duì)各表達(dá)量數(shù)據(jù)均值進(jìn)行單因素方差分析，如數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則對(duì)相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)（ln）轉(zhuǎn)換，使數(shù)據(jù)符合方差齊性檢驗(yàn)，再對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行鄧肯分析，設(shè)定顯著性水平為0.05。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。

1.2.4Perlucin基因SNP 篩選及分析 外顯子區(qū)SNP位點(diǎn)分析的耐低溫選育系F3代（R）和北部灣野生群體（W）30 個(gè)個(gè)體的基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)參考文獻(xiàn)[21]。根據(jù)文獻(xiàn)[21]獲得R 和W 的全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)，提取Perlucin的外顯子SNP位點(diǎn)；分別利用軟件Popgene32、PIC_CALC、HAP1loview4.2、SPSS22.0 計(jì)算SNP 的基因型、基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）與哈迪-溫伯格平衡（哈-溫平衡，HWE）等遺傳參數(shù)，進(jìn)行群體R和W的卡方檢驗(yàn)和SNP的差異統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Perlucin序列分析

馬氏珠母貝Perlucin全序列總長(zhǎng)為631 bp，5?端非編碼區(qū)（UTR）為55 bp，3?UTR為116 bp，開放閱讀框（ORF）為459 bp，共編碼152 個(gè)氨基酸（圖1）。分析其蛋白序列的理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其相對(duì)分子質(zhì)量為17 137，分子式為C772H1158N220O206S10，等電點(diǎn)為9.50，具有10 個(gè)負(fù)電荷的殘基（Asp+Glu）和20 個(gè)帶正電荷的殘基數(shù)（Arg+Lys）；總平均親水性為-0.184，屬于親水性蛋白。經(jīng)預(yù)測(cè)，其保守結(jié)構(gòu)域有1個(gè)C型凝集素結(jié)構(gòu)域（Lectin-C），位 于24—149（圖1）。Perlucin 還具有1 個(gè)信號(hào)肽，位于1—20，預(yù)測(cè)出1 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)（圖2），位于4—16。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，Perlucin 蛋白序列由28.95%α 螺旋、25.66%延伸鏈、4.61%β轉(zhuǎn)角和40.79%無規(guī)卷曲組成。

2.2 Perlucin多序列比對(duì)以及進(jìn)化樹構(gòu)建

馬氏珠母貝Perlucin 與紫貽貝（Mytilus galloprovincialisVDH90866.1）、長(zhǎng)牡蠣（Crassostrea gigasXP_034311602）、棘冠海星（Acanthaster planciXP_022090740）、海星（Patiria miniataXP_038045941）、歐文蟲（Owenia fusiformisCAH1798313.1）、圓毛好轉(zhuǎn)蟲（Dimorphilus gyrociliatusCAD5122556.1）、果蠅（Drosophila pseudotakahashiiKAH8352600.1），黑腹果蠅（Drosophila melanogasterNP_001137766）、劍尾魚（Xiphophorus helleriiXP_032422573）、白梭吻鱸（Sander luciopercaXP_031150883）、擬鱷龜（Chelydra serpentineKAG6923368.1）、棱皮龜（Dermochelys coriaceaXP_038234280）、彩冠雉（Penelope pileataNXC48108.1）、鵲雁（AnseranassemipalmataNXI73468.1）Perlucin 的多序列比對(duì)結(jié)果（圖3）顯示，Perlucin 在不同物種間的N 端保守性較低，但結(jié)構(gòu)域CLECT所在區(qū)域較為保守。

圖3 Perlucin的多序列比對(duì)分析結(jié)果Fig.3 Multiple sequence alignment of Perlucin

上述15個(gè)物種的Perlucin蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹和結(jié)構(gòu)域分析（圖4）顯示，馬氏珠母貝與長(zhǎng)牡蠣、紫貽貝的Perlucin聚為一支。

圖4 Perlucin的系統(tǒng)發(fā)育樹和結(jié)構(gòu)域Fig.4 Phylogenetic tree and domains of Perlucin

2.3 Perlucin三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖5可見，馬氏珠母貝Perlucin蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)與紫貽貝、白梭吻鱸和棱皮龜基本一致。

圖5 馬氏珠母貝(a)、紫貽貝(b)、白梭吻鱸(c)和棱皮龜(d)Perlucin蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 Spatial structure of Perlucin protein in Pinctada fucata martensii(a),Mytilus galloprovincialis(b),Sander lucioperca(c)and Dermochelys coriacea(d)

2.4 Perlucin組織表達(dá)及低溫脅迫下的差異表達(dá)

在分析健康組織表達(dá)數(shù)據(jù)及低溫脅迫時(shí)鰓組織表達(dá)數(shù)據(jù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)（ln）轉(zhuǎn)換后，數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，組織表達(dá)、低溫脅迫鰓組織表達(dá)數(shù)據(jù)的方差齊性檢驗(yàn)顯著性分別為0.053、0.352，均符合方差齊性檢驗(yàn)。分析顯示：Perlucin在馬氏珠母貝閉殼肌、鰓、性腺、足、肝胰腺和外套膜中均有表達(dá)，在閉殼肌中表達(dá)量極低，在鰓中表達(dá)量顯著高于除肝胰腺和足以外的其他組織（P ＜0.05）（圖6）；在低溫17 ℃組，馬氏珠母貝Perlucin的表達(dá)量先升高后下降，其中在12～48 h顯著高于對(duì)照組（P ＜0.05）（圖7）。

圖6 Perlucin基因在馬氏珠母貝不同組織中的表達(dá)Fig.6 Perlucin gene expression in different tissues of Pinctada fucata martensii

圖7 17、22 ℃下馬氏珠母貝鰓中Perlucin基因的時(shí)序表達(dá)Fig.7 Temporal expression of Perlucin gene in gills of Pinctada fucata martensii at 17 and 22 ℃

2.5 Perlucin基因SNP位點(diǎn)遺傳多態(tài)性分析

Perlucin基因的外顯子共發(fā)現(xiàn)30 個(gè)SNP 位點(diǎn)。這些SNP 位點(diǎn)PIC 為0.016 3～0.371 0，其中，21 個(gè)位點(diǎn)為低度多態(tài)性（PIC ＜0.25），9 個(gè)為中度多態(tài)性（0.25 ＜PIC ＜0.50）；Ho為0.016 7～0.533 3；He為0.016 7～0.495 2（表2）。

表2 Perlucin基因的SNP多態(tài)性Table 2 Haplotype of SNPs in Perlucin gene

2.6 Perlucin基因SNP位點(diǎn)與耐低溫關(guān)聯(lián)性分析

表3 表明，Perlucin外顯子區(qū)域的30 個(gè)SNP 位點(diǎn)中，13個(gè)SNP位點(diǎn)在群體W 和R之間存在顯著差異（P ＜0.05），表明這13 個(gè)SNP 與耐低溫性狀顯著相關(guān)。頻率差異最大的前2 個(gè)位點(diǎn)如下：g.40078865 的GT 基因型在群體R 和W 中的頻率分別為76.7%和30.0%；g.40078913 的基因型CT 在兩個(gè)群體中的頻率分別為73.3%和26.7%；僅在R 群體被檢測(cè)到的位點(diǎn)共2 個(gè)，分別是位點(diǎn)g.40078856、g.40078945。其中位點(diǎn)g.40078856 為同義突變，位點(diǎn)g.40078945 為非同義突變，在R 群體中AG 基因型，該位點(diǎn)處編碼的氨基酸由精氨酸變?yōu)橘嚢彼帷?/p>

表3 Perlucin外顯子SNP位點(diǎn)及其基因型在群體R和W間分布頻率Table 3 Frequency distribution of Perlucin exon SNP loci and their genotypes in populations R and W

3 討論

凝集素在無脊椎動(dòng)物免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮作用，在軟體動(dòng)物的免疫識(shí)別和逆境應(yīng)答中擔(dān)任極重要角色。本研究擴(kuò)增得Perlucin的全長(zhǎng)序列，其具有1 個(gè)信號(hào)肽，1 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，屬于跨膜蛋白；存在1 個(gè)典型的C 型凝集素結(jié)構(gòu)域，說明它屬于典型的C 型凝集素成員。C 型凝集素結(jié)構(gòu)域包含多個(gè)糖識(shí)別域，可參與吞噬作用[25]，細(xì)胞因子釋放[26]、聚集[27]，抗菌活性和細(xì)胞黏附[1,28-29]等多種免疫反應(yīng)。馬氏珠母貝Perlucin 氨基酸結(jié)構(gòu)域序列部分與其他物種的Perlucin相似性較高，表明Perlucin的功能在物種間較為保守，且Perlucin系統(tǒng)發(fā)育樹與長(zhǎng)牡蠣、紫貽貝等軟體動(dòng)物聚為一支，區(qū)別于脊椎動(dòng)物和其他無脊椎動(dòng)物，表明Perlucin在物種分化過程中較為保守。

Dodenhof 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，Perlucin基因是珍珠層有機(jī)基質(zhì)的蛋白質(zhì)之一，在生物礦化過程中發(fā)揮重要作用。本研究表明，Perlucin基因在與礦化有關(guān)的外套膜組織[31]中表達(dá)量極低，說明馬氏珠母貝Perlucin基因可能不參與貝殼的鈣化。Perlucin在馬氏珠母貝的鰓和肝胰腺等組織中表達(dá)量較高。在香港牡蠣中有類似結(jié)果：在多種組織中均有表達(dá),在唇瓣中表達(dá)量最高,其次是消化腺（包含肝胰腺）[8]。鰓組織是雙殼貝類抵御外界刺激的第一道防線，是與外界環(huán)境接觸的主要器官，在機(jī)體抵抗逆境時(shí)起重要作用[32]。菲律賓蛤仔通過調(diào)節(jié)鰓組織的脂肪酸代謝來響應(yīng)低溫的脅迫[16]，高溫下蝦夷扇貝鰓組織結(jié)構(gòu)變化明顯[33]，說明鰓是貝類響應(yīng)溫度脅迫的重要器官。本研究對(duì)馬氏珠母貝進(jìn)行低溫脅迫，發(fā)現(xiàn)低溫處理組在12 h 時(shí)，鰓組織中Perlucin基因的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，說明低溫脅迫下，Perlucin基因可能參與馬氏珠母貝的低溫脅迫應(yīng)答。

作為最理想的DNA分子標(biāo)記，SNP在水產(chǎn)動(dòng)物的育種研究中有重要作用，陳曉敏等[34]和Du等[35]發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦功能基因CAT、all-53308外顯子SNP位點(diǎn)可能會(huì)發(fā)生改變，影響到機(jī)體的抗逆性。在功能基因轉(zhuǎn)錄過程中，前體RNA中的內(nèi)含子區(qū)域剪除后留下的外顯子區(qū)域轉(zhuǎn)為成熟的mRNA，然后翻譯成蛋白質(zhì)。因此，外顯子區(qū)域的SNP 位點(diǎn)不僅可作為分子標(biāo)記，其多態(tài)性變化還會(huì)影響基因功能。其中，位于編碼區(qū)的SNP 位點(diǎn)變化會(huì)產(chǎn)生同義突變和非同義突變兩種效應(yīng)。同義突變雖不引起編碼氨基酸的改變，但可影響基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯等；非同義突變引起蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而可能影響蛋白質(zhì)的功能，導(dǎo)致生物性狀的改變[36]。例如，在人類基因組中，多藥耐藥1 多肽是藥物或其他外源性物質(zhì)的多特異性外排轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白。編碼該蛋白的基因外顯子區(qū)域SNP 3435C ＞T 同義突變，影響了RNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致RNA 穩(wěn)定性變化，進(jìn)而導(dǎo)致mRNA 表達(dá)的差異[37]。此外，編碼區(qū)SNP 多態(tài)性還會(huì)引發(fā)非同義突變，從而引起蛋白功能的變化。例如，在葡萄糖-6-磷酸酶（G6PC2）基因中的4 個(gè)非同義突變導(dǎo)致其酶活性降低[38]。本研究分析了馬氏珠母貝群體R 和W 的Perlucin的外顯子區(qū)域，共檢測(cè)到30 個(gè)SNP 位點(diǎn)，其中13 個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率在群體W 和R 間差異顯著，位點(diǎn)g.40078856和位點(diǎn)g.40078945的AG 基因型在群體R和W 中的頻率分別為30%和0%，表明在三代的人工選育后形成選擇壓力，其位點(diǎn)基因型頻率的改變可能與選育系低溫耐受能力之間有密切關(guān)系，相似于陳琨等[24]和Lai 等[39]對(duì)馬氏珠母貝PEPCK和PIAS基因的研究結(jié)果。此外，位于基因編碼區(qū)的SNP 位點(diǎn)除作為分子標(biāo)記以外，也可能會(huì)引起基因功能變化。本研究中，Perlucin基因有兩個(gè)SNP 位點(diǎn)g.40078856(G ＞A)和g.40078945(G ＞A)僅在R 群體被檢測(cè)到。位點(diǎn)g.40078856 為同義突變，提示其可能會(huì)影響該基因mRNA 的轉(zhuǎn)錄或穩(wěn)定性，導(dǎo)致基因表達(dá)的變化。g.40078945在R 群體中出現(xiàn)的G 突變導(dǎo)致其發(fā)生非同義突變，由精氨酸變?yōu)橘嚢彼帷煞N氨基酸均屬于堿性氨基酸，但賴氨酸的堿性弱于精氨酸，且非同義突變位置在結(jié)構(gòu)域內(nèi)部，提示其可能會(huì)影響到蛋白質(zhì)的功能，但對(duì)蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生的影響還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。以上研究結(jié)果可為進(jìn)一步深入研究Perlucin基因在馬氏珠母貝應(yīng)對(duì)環(huán)境溫度變化的作用機(jī)制提供重要參考。

4 結(jié)論

本研究通過基因克隆獲得Perlucin基因，開展低溫脅迫實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)馬氏珠母貝Perlucin基因表達(dá)量在17°C 低溫組先升高后下降，其中Perlucin的表達(dá)量在12～48 h 時(shí)比對(duì)照組顯著升高。同時(shí)通過對(duì)馬氏珠母貝R群體和W 群體Perlucin基因SNP分析顯示，位點(diǎn)g.40078856、g.40078945 的基因型AG只在R 群體中被檢測(cè)到，說明R 群體中該基因受到了選擇壓力。