POU1F1基因SNP位點與尼羅羅非魚體質量和形態性狀的相關性

高風英，佟延南，曹建萌，劉志剛，王 淼，衣萌萌，可小麗，盧邁新，朱 海

(1.中國水產科學研究院珠江水產研究所/農業部熱帶亞熱帶水產資源利用與養殖重點實驗室，廣東 廣州 510380；2.海南省海洋與漁業科學院，海南 海口 570206）

垂體特異性正轉錄因子1（POU1F1）（亦稱PIT-1 或GHF-1）是一種在垂體前葉中表達的組織特異性轉錄因子[1,2]，在生長激素（GH）和催乳素（PRL）基因的轉錄調節中有一定作用[3,4]，還參與激活促甲狀腺激素b 亞基（TSHb）、POU1F1基因[5-6]和生長激素釋放激素受體基因[7]，對促體細胞、促乳細胞以及促甲狀腺細胞的分化、繁殖和生存亦至關重要[5]，是有育種潛力的候選基因，值得在羅非魚中深入研究。此外，由于POU1F1的下游靶基因和調控細胞在物理生長中起著直接作用，POU1F1中的一些SNP 與畜禽的生長性狀密切相關[8-13]。在水產領域，僅杜芳芳等[14]對大口黑鱸（Micropterus salmoides）POU1F1基因多態性與生長相關性狀關聯性進行了研究，獲得了生長相關基因型。

目前，已廣泛實施分子標記輔助育種（Marker Assisted Selection，MAS），以改善水產動物生產性能[15-16]。羅非魚是我國重要的淡水養殖魚類之一，以尼羅羅非魚為主。據《2022 中國漁業統計年鑒》，2020 和2021 年我國羅非魚產量超過世界總產量的30%，在國民經濟中占有重要地位，羅非魚的選育研究有重要意義。羅非魚的選育目標主要是生長速度。尼羅羅非魚引入我國后，經多年的選育，不同選育群體間因選育技術不同，生長速度不同。為繼續選育尼羅羅非魚，篩選生長相關分子標記以輔助選育非常必要。POU1F1基因多態性與家畜的生長和肉質性狀相關，為探索羅非魚中是否存在與體質量以及全長、體長、頭長、體高、體寬等形態性狀相關的POU1F1多態位點，本研究選取POU1F1基因，在尼羅羅非魚高要親代群體中篩選SNP，并與生長數據相結合，篩選與體質量和形態性狀相關的SNP，并將這些SNP在高要子代群體、番禺群體以及海南群體中進行普適性驗證，旨在為羅非魚以生長性狀為目標的選育提供有效分子標記。

1 材料與方法

1.1 材料

篩選SNP 位點樣品：尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）吉富品系，取自珠江水產研究所水產良種基地，40 尾魚的鰭條樣本，置20 ℃無水乙醇中保存。

體質量和形態性狀關聯分析樣品：尼羅羅非魚吉富品系高要親代及子代群體取自珠江水產研究所水產良種基地，“廣特超”新吉富羅非魚（番禺群體）取自廣東羅非魚良種場，尼羅羅非魚海南群體取自海南省水產科學院。高要親代群體為2020 年的秋苗，取1 000 尾同塘養殖越冬至次年7 月；高要子代群體為2021 年用傳統土塘繁殖的春苗，取200尾同水泥池養殖3個月（經激素處理，全雄）；番禺群體為2021 年春苗（經激素處理，全雄），取200 尾，同水泥池養殖3個月；海南群體為2021年春苗1萬尾，放至1/3 hm2的土塘中養殖3 個月（未經激素處理的正常雌雄群體）。取高要群體162 尾，番禺群體175尾，分別測量體質量、全長、體長、頭長、提高、體寬，海南群體300尾，測量體質量。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 的提取 采用磁珠法基因組DNA 提取試劑盒（NanoMagBio）提取基因組DNA，具體方法步驟參照試劑盒說明書。用瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA質量。

1.2.2POU1F1基因SNP 位點的篩查 根據POU1F1基因（GenBank accession No.XM_019352661，NC_031987）3?區域序列，利用Primer Primer 5.0 軟件設計2 對上下游引物：POU1F1-3end_1-F(15631-15655)（CGTACAAAATATGCCATTTACCAAG）、POU1F1-3end_1-R(16976-16995)（ACTTTATCAAGGCAGCGACG），POU1F1-3end_2-F(16749-16772)（GCTTTAACCAA ATGAATGTAGCTG）、POU1F1-3end_2-R(18139-18160)（TTTCAGTCTCCACTTTATCCCC），以及測序引物POU1F1-3end_2-seqf1（GAGTGGTTTTCACTGTGAC）。以上述高要親代群體中40個個體的DNA為模板，進行PCR 擴增。反應體系（30μL）：2×Taq PCR Master Mix 15μL，基因組DNA 1μL（約20 ng），10 pmol/μL上下游引物各1μL，ddH2O 12μL。反應條件：95 ℃5 min；95 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃45 s，35 個循環；72 ℃5 min，16 ℃1 min，PCR 產物4 ℃下保存。條帶符合理論目的大小的PCR 產物送Sanger 測序，測序平臺為ABI 公司的3730xl DNA Analyzer 測序儀。2 對引物分別做雙向測序后正反向拼接，且兩段檢測區域有重疊，以保證2 對引物測通全長。由于尾端有POLY 結構，因此多設計一條加測引物pou1f1-3end_2-seqf1，以避開POLY 結構。將測序良好的全長序列在SeqMan 軟件中進行多序列比對，篩查POU1F1基因中的SNP位點。

1.2.3 POU1F1 基因SNP 位點的分型分析 采用

1.2.2 中PCR 產物測序法分析SNP 位點分型。反應體系和反應條件同1.2.2.。共分析3 個群體：首先分析高要親代群體213 尾的SNP 位點分型，并分析SNP 位點基因型與體質量和形態性狀的相關性，將獲得的與體質量和形態性狀相關的SNP 位點在高要子代群體（162 尾）以及番禺群體（175 尾）中進行分型分析，分析SNP 位點基因型（下文基因型中“I”代表TC 插入、CC 插入、TTTG 插入、C 插入、CTC 插入、T 插入；“D”代表缺失）與體質量和形態性狀的相關性，驗證親子代群體間體質量和形態性狀相關SNP 位點的可重復性，以及不同群體間的可重復性。

1.2.4POU1F1基因SNP 位點的分型驗證 將與高要親代群體、高要子代群體以及番禺群體體質量和形態性狀相關的位點，在海南群體中進行擴增，并用SeqMan 軟件統計基因型，分析SNP 位點基因型與體質量和形態性狀的相關性，從而進一步驗證所獲得的體質量和形態性狀相關SNP 位點的可重復性。

1.2.5 遺傳信息統計 利用PIC-CALC 0.6 分析SNP位點的多態信息含量（polymorphism information content,PIC）。利用Popgene 3.2 進行哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium,HWE）狀態的卡方檢驗，并計算觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）)、有效等位基因數（Ne）、基因頻率及等位基因頻率。采用HaploView 4.2 軟件對SNP 位點進行連鎖不平衡分析和單倍塊構建。利用單倍型手動分析出雙倍型。

1.3 數據的關聯分析

采用SPSS17 軟件一般線性模型中的多元方差分析模塊分析SNP 位點不同基因型與全長、體長、頭長、體高、體寬、體質量等6個生長性狀的相關性。數據以平均值±標準差形式表達，差異顯著性水平α=0.05。

2 結果分析

2.1 POU1F1基因部分序列SNP位點

將PCR 擴增獲得的2 341 bp片段（登錄號：NC_031987）進行序列比對，獲得28個SNP位點（表1）。

2.2 各群體中POU1F1基因SNP位點的遺傳多樣性

2.2.1 高要親代群體 表2 可見：高要親代群體POU1F1基因28 個SNP 位點的多樣性較為豐富，有效等位基因數（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）平均值分別為1.359 3、0.240 7、0.156 6；多態信息含量（PIC）平均為0.298，有6 個位點低度多態（PIC ＜0.25），20 個位點中度多態（0.25 ＜PIC ＜0.50），2 個位點高度多態。位點S1(A-198G)、S2(C-201T)、S4(A-469T)、S6(A-881G)、S7(A-888G) 在 群體中符合Hardy-Weinberg 平衡定律（下稱“H-W 平衡”），其余23個位點均偏離H-W平衡。

2.2.2 高要子代群體 表3 可見：高要子代群體POU1F1基因12 個SNP 位點的多樣性比較豐富，Ne、Ho、He平均值分別為1.1873、0.1542、0.1556；PIC平均為0.155，12個位點均低度多態（PIC ＜0.25）；12個位點在群體中均符合H-W平衡。

表3 POU1F1基因12個SNP位點在尼羅羅非魚高要子代群體的遺傳信息Table 3 Genetic information of twelve SNP loci of POU1F1 gene in Gaoyao offspring population of Nile tilapia

2.2.3 番禺群體 表4 可知：番禺群體POU1F1基因12 個SNP 位點的多樣性比較豐富，Ne、Ho、He平均值分別為1.2643、0.2038、0.2044；PIC 平均為0.182，有10 個位點低度多態（PIC ＜0.25），2 個位點高度多態；有11 個位點在群體中均符合H-W 平衡，有1 個位點偏離H-W平衡。

表4 POU1F1基因12個SNP位點在尼羅羅非魚番禺群體的遺傳信息Table 4 Genetic information of twelve SNP loci of POU1F1 gene in Panyu population of Nile tilapia

2.2.4 海南群體 表5 表明：海南群體雌性個體POU1F1基因6 個SNP 位點的多樣性比較豐富，Ne、Ho、He平均值分別為1.2918、0.1933、0.2201；PIC 平均為0.202，有5 個位點低度多態（PIC ＜0.25）；有3個位點在群體中均符合H-W 平衡，有3 個位點偏離H-W平衡。

表5 POU1F1基因3個SNP位點在尼羅羅非魚海南雌性群體的遺傳信息Table 5 Genetic information of 3 SNP loci of POU1F1 gene in Hainan female population of Nile tilapia

表6表明：海南群體雄性個體POU1F1基因6個SNP 位點的多樣性比較豐富，Ne、Ho、He平均值分別為1.2434、0.1767、0.1936；PIC 平均為0.185，6 個位點均低度多態（PIC ＜0.25）；有5 個位點在群體中符合H-W平衡（表6），有1個位點偏離H-W平衡。

2.3 POU1F1基因SNP位點與各群體體質量和形態性狀的相關性

2.3.1 高要親代群體 表7 表明：POU1F1基因S3(A-400G)位點的AA 型個體與AG、GG 型個體在頭長上有顯著差異。S4(A-469T)位點TT、AT 型與AA型在體質量與全長上均有顯著差異。S5(I-539D)位點DD 型和ID 型與II 型在體寬上有顯著差異。S6(A-881G)位點AA 型與AG、GG 型在頭長上存在顯著差異。S7(A-888G)位點的GG 型與AA、AG 型在頭長上存在顯著差異。S12(C-1365T)位點的CT 與TT型在體質量和全長、體高、體寬上存在顯著差異，該位點CC 與TT 型在體長上有顯著差異，CC 與CT型在頭長上有顯著差異。差異顯著性水平均為0.05。

表7 POU1F1基因中與尼羅羅非魚高要親代群體體質量或形態性狀顯著相關的6個位點Table 7 6 SNP loci in POU1F1 gene significantly associated with body mass or morphological traits of Gaoyao parent population of Nile tilapia

2.3.2 高要子代群體 將高要親代群體中篩選出的與體質量和形態相關聯的SNP 位點，在高要子代群體中進行分型分析，這些SNP 位點各基因型與高要子代群體體質量和形態性狀關聯分析表明：S3(A-400G)位點的AA型個體與AG、GG型個體間在體質量、全長、體長、頭長、體高、體寬方面均有顯著差異；AA 型個體各指標平均值均低于AG、GG 型個體。S5(I-539D)位點的DD 型個體與ID、II型個體間在體質量、全長、體長、頭長、體高、體寬方面均存在顯著差異；S11(I-1358D)位點ID 型與II 型在體質量和體高方面有顯著差異，ID 型個體體質量和體高顯著高于TT 型；S13(C-1511T)位點CC 型與CT、TT 型個體間在體質量、體長、頭長、體高、體寬方面均有顯著差異，CC 型個體平均值均高于CT、TT 型；S14(A-1539T)位點AT 型與TT 型個體間在體質量和體高方面有顯著差異，AT 型個體的體質量、體高均值均高于TT型（表8）。

表8 POU1F1基因中與尼羅羅非魚高要子代群體體質量或形態性狀顯著相關的5個位點Table 8 5 SNP loci in POU1F1 gene significantly associated with body mass or morphological traits of Gaoyao offspring population of Nile tilapia

2.3.3 番禺群體POU1F1基因SNP 位點與番禺群體體質量和形態性狀關聯分析表明，12 個SNP 位點與番禺群體體質量和形態性狀均無關聯（數據略）。

2.3.4 海南群體POU1F1基因SNP 位點與海南雌性群體體質量性狀關聯分析表明，S4(A-469T)位點與海南雌性群體體質量具有相關性，AA 型個體體質量明顯高于AT、TT型（表9）。

表9 POU1F1基因中各SNP位點與尼羅羅非魚海南雌、雄性群體體質量性狀的關聯分析Table 9 Association analysis of SNPs in POU1F1 gene with body mass traits of Hainan female and male population of Nile tilapia

表9 表明，海南雌性群體S3(A-400G)和S5(I-539D)位點與體質量性狀顯著相關，S3(A-400G)位點的AA 型個體體質量顯著高于AG、GG 型個體，S5(I-539D)位點的DD型個體體質量顯著高于ID、II型個體。

2.4 POU1F1基因雙倍型與各群體體質量和形態性狀的關聯分析

2.4.1 高要親代群體 將27 個SNPs 位點進行單倍型分析，得出雙倍型（圖1，表10），除去出現頻率低于3%的雙倍型，將其余5種雙倍型與體質量和形態性狀進行關聯性分析，結果表明：雙倍型D4、D7 個體的體寬顯著高于雙倍型D8 的個體。在實際的育種應用中，應選擇D4、D7雙倍型個體，以增加體寬。

圖1 尼羅羅非魚POU1F1基因SNPs在高要親代群體中的連鎖不平衡分析Fig.1 Map of pair-wise LD between POU1F1 SNPs in Gaoyao parent populations of Nile tilapia

表10 POU1F1基因雙倍型與尼羅羅非魚高要親代群體體質量和形態性狀關聯分析Table 10 Correlation analysis between body mass and morphological traits and diplotype in the POU1F1 gene in Gaoyao parent population of Nile tilapia

2.4.2 高要子代群體 將12 個SNPs 位點進行單倍型分析，利用單倍型分析出雙倍型，除去出現頻率低于3%的雙倍型，將其余2種雙倍型與體質量和形態性狀進行關聯性分析（表11）。結果表明，2 種雙倍型與高要子代群體體質量和形態性狀均無關聯。

表11 POU1F1基因雙倍型與尼羅羅非魚高要子代群體體質量和形態性狀關聯分析Table 11 Correlation analysis between body mass and morphological traits and diplotype in the POU1F1 gene in Gaoyao offspring population of Nile tilapia

2.4.3 番禺群體 將12 個SNPs 位點進行單倍型分析，利用單倍型分析出雙倍型，除去出現頻率低于3%的雙倍型，將其余3種雙倍型與體質量和形態性狀進行關聯性分析發現，3 種雙倍型與番禺群體體質量和形態性狀均無關聯（表12）。

表12 POU1F1基因雙倍型與尼羅羅非魚番禺群體體質量和形態性狀關聯分析Table 12 Correlation analysis between body mass and morphological traits and diplotype in POU1F1 gene in Panyu population of Nile tilapia

2.4.4 海南群體 6 個SNP 位點在雄性群體中獲得的雙倍型，除去出現頻率低于3%的雙倍型，剩余4種雙倍型。關聯性分析發現，4 種雙倍型與海南雄性群體體質量性狀均無關聯（表13）。

表13 POU1F1基因雙倍型與尼羅羅非魚海南雄性群體生長性狀關聯分析Table 13 Correlation analysis between body mass and diplotype in POU1F1 gene in Hainan male population of Nile tilapia

6 個SNP 位點在雌性群體中獲得的雙倍型，除去出現頻率低于3%的雙倍型，剩余5種雙倍型。關聯性分析發現，雙倍型為D6 的個體體質量顯著高于雙倍型為D2的個體（表14，圖2）。

圖2 尼羅羅非魚POU1F1基因SNPs在海南雌性群體中的連鎖不平衡分析Fig.2 Map of pair-wise LD between POU1F1 SNPs in Hainan female population of Nile tilapia

表14 POU1F1基因雙倍型與尼羅羅非魚海南雌性群體體質量性狀關聯分析Table 14 Correlation analysis between body mass traits and diplotype in the POU1F1 gene in Hainan female population of Nile tilapia

3 討論

3.1 POU1F1多態性

單基因的遺傳多樣性可反映某群體的遺傳多樣性，某個群體的遺傳多樣性比較低，則在某個基因上可反映出來[17]，本研究從單基因多態性方面分析群體遺傳多樣性，有一定實用性。

等位基因數、雜合度和多態信息含量等遺傳參數均可反映直接反映群體的基因豐富度和遺傳多樣性[18]。本研究的高要子代群體Ne、Ho兩個多樣性指標與親代群體相當，但He和PIC 低于親代群體?？赡苡勺哟后w分析中所采用的SNP 位點數少于親代群體導致，子代群體分析只采用了與親代群體生長相關的位點。高要親代群體PIC 均值為0.298，番禺群體為0.182，海南雌性群體為0.202，均稍低于王春曉等2015 年對這兩個群體在GHSR基因中檢測到的多樣性（0.278，0.310）[19]。這可能是因為本研究所用的高要群體和番禺群體經過幾年的選育后多樣性有所下降，也可能是因為不同基因的SNP 多樣性有所不同。本研究表明，各羅非魚群體具有較高的遺傳多樣性，可在此基礎上繼續進行良種選育。

3.2 生長相關位點的篩選

本研究篩選生長相關SNP 位點所用的區域均位于POU1F1基因的3?端非編碼區。這些位于非編碼區的SNP 位點，不參與蛋白編碼，也不能改變蛋白序列及結構，因此這些基因座對性狀的影響可能不直接，但這些位于非編碼區的突變位點可能與負責改變蛋白序列及結構的位點連鎖不平衡（具有連鎖不平衡的位點可影響動物的生產性狀[20]）。單倍型或雙倍型與性狀進行關聯分析，解決了單個標記分子存在的位點檢測和統計效率低等問題，從而能更真實反映所分析位點與性狀的關聯性[21]。王春曉等[19]在尼羅羅非魚GHSR基因中篩選的3 個SNP位點均與生長性狀無關聯，但3 個位點組成的雙倍型與生長性狀顯著相關。本研究在高要親代群體中獲得體寬相關雙倍型2 個，在海南雌性群體中獲得與體質量相關的雙倍型1個；但在高要子代群體、海南雄性群體中獲得與生長性狀相關的SNP 位點，而未獲得與生長性狀相關雙倍型：SNP 位點之間出現了拮抗。這與李紅霞等[22]對建鯉（Cyprinus carpiovar.Jian）鳥氨酸脫酶基因多態性與生長性狀的關聯分析結果類似，不同位點之間可能存在拮抗或協同的互作。

3.3 生長相關SNP位點在各群體中的普適性

本研究在高要親代群體中獲得的體質量和形態相關位點，與子代中篩選到的相關位點部分重合，但是親子代群體與重合位點關聯的體質量和形態性狀有所不同，如：親代群體位點S3 與頭長顯著相關，S4 與體質量、全長相關，S5 與體寬顯著相關，S11 與頭長顯著相關；但在子代群體中，位點S3 和S5與體質量、全長、體長、頭長、體高、體寬均顯著相關，S11 與體質量和體高顯著相關。這可能是親代群體與子代群體生長狀態不同導致的；也可能是因為魚類生長性狀是受多種基因控制的數量性狀，主效基因和微效基因在不同世代中會出現分離或整合現象，從而導致篩選的生長相關SNP 位點在不同世代之間的適用性較差[23]；還可能是本研究子代群體采樣數量少于親本導致的，增加子代采樣數量，有可能提高親代子代之間生長相關位點的契合度。本研究在高要子代群體中獲得的SNP 位點與番禺群體中相關SNP 位點沒有重疊，在番禺群體未篩選到體質量和形態性狀相關位點。高要子代中與生長性狀顯著相關的SNP 位點，在番禺群體中各基因型的體質量數據亦有部分差異，只是在統計學上未達到顯著性水平。這可能由取樣數量導致。影響標記-性狀連鎖分析準確性的一個重要因素是群體數量；但目前對用于標記-性狀連鎖分析的群體數量須達到什么標準篩選出的標記才可信，尚無明確的依據，因而并不能說在另外一個群體中未得到驗證的關聯標記不可信[24]。與高要子代群體生長性狀相關的這些位點在海南群體中進行進一步驗證表明：僅S4 位點與海南雌性群體體質量顯著相關，S3 和S5 位點與雄性群體體質量相關，其余位點與體質量性狀均不具有相關性。這可能是因為不同群體的遺傳背景差異會導致篩選到的生長相關SNP 位點在不同群體中的關聯性急劇下降。

本實驗獲得的與高要親代群體生長相關位點，在高要親代與子代之間普適性較弱，可能是因為取樣數量不夠大，導致親代、子代之間生長相關位點有些差異；這些與高要親代群體生長相關SNP 位點在不同群體間的普適性較差，可能是不同群體間遺傳背景的差異導致，也可能是因為取樣數量不夠大導致。擴大群體取樣數量，這些生長相關SNP 標記在不同群體之間的普適性可能就會提高。