牛磺酸對幼刺參生長、抗氧化和代謝酶活性的影響

李培玉，王美琪，宋志東，胡順鑫，劉財禮，李 璐，劉經未，陸國峰

（1.山東省海洋資源與環境研究院，山東 煙臺 264006；2.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306）

牛磺酸是一種有機酸，最早從牛膽汁中分離獲得[1]。它只存在于動物蛋白中，幾乎不存在于植物中[2]。牛磺酸作為一種以游離形式存在的含硫氨基酸，不參與蛋白質的生物合成，但是卻參與了水生動物體內廣泛的基本生理功能，包括滲透調節[3]、膽鹽結合[4]、視覺和視網膜發育[5]、免疫反應調節[6]和抗氧化活性[7-8]。水產動物缺乏牛磺酸會產生一些癥狀，如肝膽代謝紊亂[9]、溶血性貧血[3]。水生動物通常可通過多種途徑合成牛磺酸。半胱氨酸亞硫酸脫羧酶（CSD）和半胱氨酸雙加氧酶（CDO）是半胱氨酸亞磺酸途徑的兩種限速酶，催化蛋氨酸或半胱氨酸轉化為牛磺酸。最近研究表明CDO 和CSD 的活性以及魚類對這兩種酶催化效率的調節機制與魚類內源牛磺酸的合成能力有關[10-12]。一般認為，內源性牛磺酸的產生不足以滿足大多數水生動物的需求，因此需要額外在飼料中添加牛磺酸[2]。多項研究表明，添加外源性牛磺酸可促進魚蝦的生長和飼料利用，然而各水產動物對牛磺酸的最佳需求量存在較大差異，如凡納賓對蝦（Litopenaeus vannamei）對飼料牛磺酸需求量為質量分數0.17%[13]，尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）為質量分數0.97%[14]，牙鯛（Dentex dentex）為2 g/kg[15]，草魚（Cenopharyngodon idella）為2.50 g/kg[16]，黃 條（Seriola lalandi）為7.50 g/kg[17]，虹鱒（Oncorhynchus mykiss）為5 g/kg[18]。牛磺酸添加量受多種因素影響，不僅與動物種類有關，還與配方中含硫氨基酸有關。

近年來，刺參（Apostichopus japonicus）消費需求不斷上升，推動刺參養殖業的快速發展。野生刺參主要攝取有機沉積物，包括細菌、原生動物、藻類或動物的碎屑[19]。而在養殖實踐中，刺參飼料的原料來自鼠尾藻（Sargassum thunbergii）、海帶（Laminaria japonica）與馬尾藻（Scagassum）等牛磺酸含量較低的水生植物[20]，這與刺參體內高含量的牛磺酸形成明顯對比[21-22]。明確刺參是否具有在體內合成牛磺酸的能力，并確定刺參生長過程中對牛磺酸的需要量極為重要。因此，本研究以幼參為對象，研究了不同水平的牛磺酸及其代謝中間體（半胱氨酸和磺基丙氨酸）對刺參生長性能、體成分、代謝和抗氧化酶活性的影響，為牛磺酸在刺參配合飼料中的科學應用奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 制備包被氨基酸

將牛磺酸晶體（純度99.0%）粉碎成粉末，與蒸餾水以質量比1∶4 混合，配制成氨基酸溶液。向氨基酸溶液中加入與牛磺酸同等質量的β-環糊精，完全混合成糊狀，然后在水浴（95 ℃）中加熱并連續攪拌30 min，冷凍干燥，研磨，用250 μm 篩網過篩，然后在-18 ℃下儲存。

1.2 實驗飼料制備

以魚粉、海藻粉、蝦粉等為主要蛋白源，添加α-淀粉、卡拉膠以及海泥（采自山東蓬萊長島網箱養殖區域）等配制成基礎飼料（Tau 0，對照），在該配方上添加質量分數0.30%、0.60%、0.90%、1.20%、1.50%的包被牛磺酸（Tau 0.3、Tau 0.6、Tau 0.9、Tau 1.2和Tau 1.5）以及0.60%的半胱氨酸（CY）、0.60%的半胱酸（CA），形成8 種等氮等脂的實驗飼料（表1），其常規營養組成見表2。實測飼料中牛磺酸質量分數為0.08%、0.22%、0.37%、0.51%、0.74%、1.04%、0.07%和0.08%（以下含量數值均以質量分數計）。將所有干成分充分混勻后，加入蒸餾水攪拌均勻，然后冷擠壓成條帶（1.00 cm × 0.50 cm × 0.08 cm）。采用如下方法測定飼料中牛磺酸溶失率：稱取5 g飼料置于裝有25 mL 水的燒杯中靜置，不同時間取樣測定水中牛磺酸含量，根據水的體積推算牛磺酸溶出量（圖1）。經測定對比，牛磺酸經包被后，其在飼料中的溶失率低于未包被牛磺酸，因此在本實驗飼料制作中牛磺酸的添加形式為包被后牛磺酸。

圖1 包被與未包被飼料的牛磺酸浸出率Fig.1 Taurine dissolution rate of feeds containg coated-taurine and crystal taurine

表1 實驗飼料組分質量分數Table 1 Mass fraction of experimental diet components %

表2 實驗飼料的常規營養組成質量分數及能量（干基）Table 2 Proximate composition of experimental diets(dry mass basis)

1.3 實驗管理

刺參幼參從山東安源種業科技有限公司（蓬萊）購得，在東營某實驗基地的玻璃纖維桶（400 L）中馴化2 周。實驗桶底部設置聚乙烯波紋板作為遮蔽物。實驗開始前停飼24 h，然后隨機選擇大小相似的健康幼參[（11.40 ± 0.04）g]，分配到24 個養殖桶（30 頭/桶）。每3 桶投喂1 種實驗飼料，日投喂1 次（16:00），投喂量為刺參體質量3%。收集剩余殘餌和糞便，記錄每天攝食量，持續8 周。養殖期間，采用自然海水養殖，pH 為7.50～8.20，溶解氧＞6 mg/L，鹽度為28～30，日換水率為600%，溫度保持在（16±1）℃。

1.4 取樣及計算

實驗結束對每桶刺參進行稱質量和計數。測定各養殖桶刺參數量和體質量，計算增重率（WGR）、特定生長率（SGR）和存活率（SR）。每桶隨機抽取10頭幼參，解剖體壁、呼吸樹和腸道樣本，在-80 ℃下儲存以供分析。

生長性能根據以下公式計算：

1.5 體成分分析

樣品水分含量是在105 ℃下干燥至恒重測得。粗蛋白質含量采用凱氏定氮儀（Kieltec 8400，FOSS Analytical A/S）測定，脂肪含量采用索氏提取法（Soxtex 2050，FOSS Analysis A/S）測定，粗灰含量采用馬弗爐燃燒法在550 ℃下測定，總能量采用熱量計（IKA?C6000，Janke&Kunkel KG，IKA-werk）測定。肌肉和飼料的氨基酸組成采用酸解法測定，即樣品用6 mL HCl（6 mmol/L）在110 ℃下水解22 h，除酸后獲得的最終水解液通過氨基酸分析儀（Hitachi L8900，Hitachi High-Technologies Corporation，Japan）測定。組織和飼料的牛磺酸含量采用GB 5009.169—2016標準方法測定[23]。

1.6 酶活性分析

腸道低溫勻漿后在4 000 r/min、4 ℃下離心10 min，分離上清液用于酶活性分析。淀粉酶（Amylase）、脂肪酶（Lipase）、蛋白酶（Protease）、葡萄糖激酶（GK）、丙酮酸激酶（PK）、谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）活性均使用試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定。半胱氨酸亞硫酸酯脫羧酶（CSD）和半胱氨酸雙加氧酶（CDO）的活性根據Goto 等[24-25]的方法進行測定，通過牛磺酸與β-丙氨酸的面積比計算牛磺酸含量作為酶活性單位。

1.7 統計分析

數據采用SPSS 17.0（SPSS 股份有限公司，Chicago）進行單因素方差分析和鄧肯多重比較，P＜0.05即為各處理組之間的差異具有統計學意義。采用SPSS軟件分段線性回歸模型對特定生長率、糞便產生率以及呼吸樹和腸道牛磺酸含量進行擬合預測折點，分析各個評價指標與牛磺酸水平的相關性。

2 結果

2.1 飼料牛磺酸水平對刺參生長性能的影響

如表3 所示各組SR、腸壁比（IBR）和臟壁比（VBR）無明顯差異（P＞0.05）。隨著牛磺酸添加水平的上升，WGR 及SGR 呈現先升高后平穩趨勢，各牛磺酸添加組均提高了WGR 和SGR（P＜0.05）。添加質量分數0.60%～1.50%牛磺酸顯著提高了刺參的排糞率（FPR）（P＜0.05）。CY 組刺參WGR 和SGR 與對照組相比并無顯著差異（P＞0.05），而CA組刺參WGR 和SGR 均高于對照組（P＜0.05）。以SGR 和FPR 為評價指標對飼料牛磺酸水平建立折現回歸模型，分析得出，初始體質量為（11.40 ±0.04）g幼參對飼料中牛磺酸的最適需求量為質量分數0.42%～0.51%（圖2）。

圖2 刺參特定生長率及糞便產生率與飼料中牛磺酸含量的階段線性回歸分析Fig.2 Broken line analysis of specific growth rate and fecal production rate,taurine actual level in feed for Apostichopus japonicus

表3 刺參生長性能Table 3 Growth performance of Apostichopus japonicus

2.2 飼料牛磺酸水平對全參基本營養成分和氨基酸組成的影響

如表4、5 和6 所示，添加牛磺酸并未改變全參水分和粗脂肪含量以及全參異亮、賴、精、絲、谷、丙、酪等氨基酸含量（P＞0.05），但是1.20% 和1.50%牛磺酸組全參灰分含量顯著高于對照組（P＜0.05）。全參粗蛋白在0.60%～1.20%的添加水平下顯著高于對照組（P＜0.05），但是在1.50%的添加水平下反而呈下降趨勢。與對照組相比，添加0.60%～1.20%牛磺酸顯著提高了全參蘇氨酸含量（P＜0.05），添加0.30%～1.50%牛磺酸提高了纈氨酸含量（P＜0.05），添加0.90%～1.20%牛磺酸提高了蛋氨酸含量（P＜0.05），添加0.90%～1.50%牛磺酸提高了半胱氨酸含量（P＜0.05）。亮氨酸含量先上升后降低，最高值出現在0.90%牛磺酸添加組。組氨酸含量則呈現持續下降的趨勢。與對照組相比，CY和CA 組均提高了全參亮氨酸含量而降低了組氨酸含量（P＜0.05）。添加CY 顯著提高全參半胱氨酸含量（P＜0.05），而添加CA 則降低半胱氨酸含量（P＜0.05）。

表4 刺參全參營養成分質量分數(干物質)Table 4 Mass fraction of nutrition component of whole body of Apostichopus japonicus(dry matter) %

表5 刺參全參必需氨基酸質量分數（干基）Table 5 Mass fraction of essential amino acid of whole body of Apostichopus japonicus（dry matter basis）%

表6 刺參全參非必需氨基酸質量分數（干基）Table 6 Mass fraction of non-essential amino acid of whole body of Apostichopus japonicus(dry matter basis) %

2.3 飼料牛磺酸水平對刺參體壁、呼吸樹和腸道牛磺酸含量的影響

由表7可知，隨著飼料中牛磺酸水平上升，各組織中牛磺酸含量呈逐漸上升后平穩趨勢。0.60%～1.50%添加組刺參體壁和呼吸樹中牛磺酸含量均顯著高于對照組（P＜0.05），0.30%～1.50%添加組的刺參腸道中牛磺酸含量顯著高于對照組（P＜0.05）。CY 組呼吸樹和腸道牛磺酸含量與對照組無顯著性差異（P＞0.05），但CA 組腸道中牛磺酸含量顯著高于對照組（P＜0.05）。分別以呼吸樹和腸道牛磺酸含量對飼料牛磺酸添加水平進行模型擬合（圖3），預測牛磺酸添加量分別為質量分數0.41%和0.47%。

圖3 刺參呼吸樹及腸道中牛磺酸含量與飼料中牛磺酸含量的階段線性回歸分析Fig.3 Broken line analysis of the taurine content in the respiratory tree and intestine and taurine actual level in feed for A.japonicas

表7 刺參體壁、呼吸樹和腸道牛磺酸質量分數Table 7 Taurine mass fractions in body wall,respiratory tree and intestine of Apostichopus japonicus mg/kg

2.4 飼料牛磺酸水平對刺參腸道消化和代謝酶活性的影響

如表8所示，各組間腸道蛋白酶、ALT和AST活性無顯著差異（P＞0.05）。但是隨著牛磺酸添加量的升高，刺參腸道脂肪酶、淀粉酶和PK 等活性呈先升高后下降趨勢，且均在0.90%水平下達到最大值；所有牛磺酸組刺參腸道的GK、AKP 等活性均高于對照組（P＜0.05）。另外，腸道CDO 活性隨著飼料中牛磺酸含量的增加呈下降趨勢，在1.20%～1.50%添加水平下顯著低于對照組（P＜0.05），而CSD 活性在0.60%～1.5%水平下低于對照組（P＜0.05）。

表8 刺參腸道消化與代謝酶活性Table 8 Activity of intestinal digestive and metabolic enzymes of Apostichopus japonicus

2.5 飼料牛磺酸水平對刺參腸道抗氧化性能的影響

如表9 所示，腸道CAT 和SOD 活性隨牛磺酸水平的上升均呈先升高后下降趨勢，添加0.90%牛磺酸顯著提高了腸道CAT 活性，0.60%～1.50% 添加水平顯著提高了SOD 活性（P＜0.05）。腸道丙二醛（MDA）含量變化則呈現相反趨勢，0.90%～1.50%添加水平下刺參腸道MDA含量顯著低于對照組（P＜0.05）。CY 組腸道CAT 和SOD 活性與對照組無差異（P＞0.05），但是CA 組腸道CAT 和SOD 活性顯著高于對照組（P＜0.05）。

表9 刺參腸道抗氧化性能Table 9 Antioxidation abilities ofApostichopus japonicus intestine

3 討論

3.1 牛磺酸對刺參生長性能的影響

研究證明飼料中添加牛磺酸能夠促進魚類攝食和生長、提高脂肪的吸收沉積以及增強抗氧化能力[7,26-27]，且魚類能夠調節牛磺酸合成的相關代謝酶基因的表達和酶活性[28]。牛磺酸在魚類飼料中應用較多，但是在刺參飼料中的應用研究較少。本實驗中，牛磺酸添加水平在0.30%～0.90%時，刺參生長隨牛磺酸添加量上升而提高，說明刺參單靠內源牛磺酸的合成可能無法滿足自身需要，飼料中添加牛磺酸能夠改善刺參的生長性能。這一研究與Zhao等[22]的結論有很大差異，可能是本實驗中牛磺酸采用包被方式，降低了牛磺酸溶失，提高了刺參有效攝食濃度。另有相關研究表明添加牛磺酸可以改善飼料的適口性，提高動物的采食率[29]。本實驗中由于殘餌崩解造成收集困難，無法測算攝食率，但是攝食率和糞便產生率具有正相關性[30-31]。幼參糞便產生率隨著牛磺酸含量的升高而提高，說明添加牛磺酸改善了飼料的誘食性，這與在象牙貝（Babylonia areolate）[32]以及方斑東風螺（Babylonia areolata）[33]等上的研究結果一致。根據折線回歸模型可見，在以藻粉、魚粉、蝦粉以及豆粕為主飼料中，添加0.42%～0.51%牛磺酸可以明顯改善幼參的飼料利用和生長。這一估測值明顯低于象牙貝（1.50%～2.00%）[32]、鲇（Pangasianodon hypophthalmus）（1.505%～1.631%）[34]等的需求量，但是接近于凡納濱對蝦（Litopenaeus vannemei）（0.43%）[35]、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）（0.40%～0.80%）[7]、真鯛（Pagrus major）（0.50%）[36]、黃鱔（Monopterus albus）（0.37%）[26]等的需求量，說明牛磺酸的需求量有種屬差異性。

3.2 牛磺酸對刺參基本營養成分的影響

刺參具有鈣質骨片，本實驗中，高水平的牛磺酸（1.20%和1.50%）添加提高了體壁灰分，說明牛磺酸能夠促進鈣等礦物質在刺參體壁中沉積，與在黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）上的研究結果一致[29]。在一些動物模型上的研究也發現牛磺酸可以通過與鈣作用促進骨的形成從而提高骨密度[37-38]。另外，隨飼料牛磺酸水平上升全參蛋白含量顯著提高，說明牛磺酸在促進蛋白沉積上扮演重要角色，在大菱鲆（Scophthalmus maximus）、花鱸（Lateolabrax japonicus）也發現類似現象[39,40]。雖然牛磺酸不參與機體蛋白合成，但是卻參與含硫氨基酸的代謝轉化。添加適量牛磺酸發揮氨基酸節約作用，使得蛋氨酸和胱氨酸等含硫氨基酸可以更多地參與到蛋白質合成代謝中，促進機體蛋白質沉積[41]。氨基酸組成測定結果也證實了這一推斷：適量牛磺酸添加不僅提高了含硫氨基酸含量，也顯著提高了其它幾種氨基酸如蘇氨酸、纈氨酸的含量。牛磺酸與這些氨基酸的代謝之間的關聯作用，需要進一步實驗研究。

3.3 牛磺酸添加水平對幼參牛磺酸合成能力以及組織中分布的影響

研究發現，CDO和CSD酶活性主要取決于水產動物種類。如黃尾鲴（Xenocypris davidi）、大黃魚（Pseudosciaena crocea）、貽貝（Mytilus edulis）和疣荔枝螺（Reishia clavigera）等物種中CSD 的活性很低[24]，而虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、鱸（Lateolabrax japonicus）、泥蚶（Tegillarca granosa）、芝麻螺（Monodonta labio）、疣荔枝螺（Reishia clavigera）等則活性很高[42-43]。CDO的表達也受多種因素調節，如含硫氨基酸、外源牛磺酸等[44-45]。本實驗發現，隨著飼料中牛磺酸添加水平的升高，刺參腸道CSD和CDO活性均呈現下降趨勢，而添加半胱酸卻能夠提高CSD活性，這與在大菱鲆[46]、卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）[28]、虹鱒以及牙鲆（Paralichthysolivaceus）[11]上的結果一致。牛磺酸合成酶的可調節性說明刺參具有一定程度的牛磺酸合成能力，因此也解釋了刺參生長的低牛磺酸需求。本實驗還發現添加CA能夠改善幼參生長、提高牛磺酸組織含量等，而CY卻不能明顯提高組織牛磺酸含量，這說明在CY 轉化成CA 過程中存在一定障礙，這也說明了飼料中添加牛磺酸的必要性。

水產動物對牛磺酸既存在器官蓄積差異，也存在種屬差異[28,47-48]。本實驗中發現，刺參的腸道和呼吸樹對牛磺酸蓄積較多，而體壁則蓄積較少，這說明牛磺酸可能參與調節呼吸樹和腸道的一些生理功能活性，反映了器官組織對牛磺酸需求的差異性。腸道和呼吸樹牛磺酸蓄積水平隨飼料牛磺酸添加水平呈現先升高后平穩趨勢，符合二段式線性回歸特點，其折點代表了組織所能容納牛磺酸的最大量，也暗示了組織代謝所需要的最低量。根據估算，飼料中牛磺酸達到0.41%～0.47%可滿足刺參腸道和呼吸樹代謝的需求。這一估測值與生長模型所預測的牛磺酸需求量基本一致，說明0.41%～0.47%的牛磺酸能同時滿足代謝和生長的需要。

3.4 牛磺酸對刺參腸道消化代謝酶的影響

本實驗中，添加0.60%～0.90%牛磺酸可提高刺參腸道脂肪酶和淀粉酶活性，這一結果與Zhao等[49]一致，這說明添加牛磺酸有助于幼參對脂肪和碳水化合物的消化吸收。但是隨飼料牛磺酸水平進一步升高，脂肪酶和淀粉酶活性有所下降，說明過高牛磺酸反而抑制了這兩種酶的分泌，相似現象也在黃 鱔（Monopterus albus）[26]、紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）[50]、草 魚（Ctenopharyngodon idella）[51]等魚類上發現。在本實驗中，隨牛磺酸含量的增加，GK 和PK 活性呈現先增加后降低的趨勢，分別在0.60%和0.90%的添加水平下達到最高。由此可見，適量添加水平的牛磺酸可能調節腸道糖酵解代謝，提高葡萄糖利用能力。堿性磷酸酶對水產動物吸收水中鈣質具有重要作用，能夠催化各種含磷化合物水解。實驗結果表明，飼料中添加牛磺酸可改善刺參腸道堿性磷酸酶活性，與紅鰭東方鲀[50]、中華絨螯蟹[7]上的研究結果一致。刺參具有內骨片結構，因此堿性磷酸酶活性提高說明飼料牛磺酸在一定程度上能上調成骨細胞活力，促進刺參內骨片生長[52-53]。綜上，從刺參腸道消化代謝酶方面來看，飼料牛磺酸添加水平在0.60%～0.90%（飼料實際牛磺酸含量0.37%～0.51%）范圍，能夠促進刺參的消化和代謝活動。

3.5 牛磺酸對刺參腸道抗氧化性能的影響

本實驗中，飼料添加一定量的牛磺酸可以提高刺參腸道SOD和CAT活性，這一發現與Zhao等[49]的研究結果一致。可能添加牛磺酸增強了刺參腸道在線粒體膜潛力，改善呼吸鏈傳遞途徑介導的能量代謝[54]，并通過Nrf2 介導的信號通路作用于抗氧化酶系統，增強SOD和CAT等抗氧化酶的合成以消除活性氧[55-56]。相反，過量牛磺酸抑制SOD和CAT活性，導致刺參抗氧化能力的降低。說明過量牛磺酸對細胞產生一定毒性作用，從而抑制細胞分泌SOD 和CAT，這一結論在非洲鲇（Clarias gariepinus）上也得到證實[57]。MDA 是氧自由基攻擊多不飽和脂肪酸而形成的脂質過氧化物，反映細胞損傷和脂質過氧化程度。在本研究中，牛磺酸添加水平大于0.60%時，腸道MDA含量顯著低于對照組。隨著牛磺酸添加水平的增加，MDA 含量呈降低趨勢，與SOD 和CAT酶的變化趨勢基本相符。這也說明在刺參中添加牛磺酸高于0.60%時（實際牛磺酸含量0.37%）有助于提高機體抗氧化能力，降低脂質過氧化對細胞的毒性，從而保護機體免受自由基的損害。

4 結論

綜合特定生長率、糞便產生率、呼吸樹和腸道牛磺酸蓄積水平的回歸分析，并結合消化酶、抗氧化能力等，推測初始體質量為（11.40 ± 0.04）g 刺參幼參對飼料中牛磺酸的最適需求量為0.47%～0.51%，這個范圍內的牛磺酸添加水平，可以提高刺參幼參對營養物質的消化和代謝能力，增強幼參抗氧化性能，又可以促進幼參生長。