銅死亡相關(guān)LncRNA預(yù)測(cè)胃癌的預(yù)后及免疫反應(yīng)

白紅艷 王碩 費(fèi)素娟 苗蓓

收稿日期：2023-07-24；修回日期：2023-09-01。

作者簡(jiǎn)介：白紅艷，碩士研究生。

* 通信作者：苗蓓，副教授，主要從事胃腸道常見病及腸腦互動(dòng)紊亂疾病等的研究。E-mail： miaobei@ xzhmu.edu.cn。

摘 要：基于生物信息學(xué)分析構(gòu)建預(yù)后相關(guān)的預(yù)測(cè)模型，探討銅死亡相關(guān)LncRNA與胃癌（GC）在免疫和預(yù)后方面的關(guān)系。從癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫下載胃癌患者的RNA測(cè)序和臨床數(shù)據(jù)，基于共表達(dá)分析篩選出銅死亡相關(guān)LncRNA，通過LASSO回歸和多因素Cox回歸分析構(gòu)建出與胃癌預(yù)后密切相關(guān)的銅死亡相關(guān)LncRNA風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型，并計(jì)算所有胃癌患者樣本的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。通過Kaplan-Meier生存分析、回歸分析和受試者工作特征（ROC）曲線等證實(shí)模型的預(yù)后預(yù)測(cè)性能，并分析風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與通路富集分析、免疫浸潤細(xì)胞、免疫檢查點(diǎn)基因、體細(xì)胞基因突變及抗癌藥物敏感性的相關(guān)性。差異表達(dá)分析結(jié)果表明，LncRNA HAGLR在腫瘤組織中的表達(dá)上調(diào)。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)LncRNA HAGLR在69例行根治性手術(shù)胃癌患者的癌組織及癌旁組織的表達(dá)。結(jié)果表明，相比于癌旁組織，胃癌組織中HAGLR表達(dá)上調(diào)，且與腫瘤大小、浸潤深度、腫瘤TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成明顯相關(guān)性（P<0.05）。本研究構(gòu)建的銅死亡相關(guān)LncRNA預(yù)后模型具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值，并且與免疫細(xì)胞浸潤異質(zhì)性明顯相關(guān)，在預(yù)測(cè)患者免疫治療效果及指導(dǎo)化療藥物選擇方面具有一定的臨床價(jià)值。

關(guān)鍵詞：銅死亡；LncRNA；胃癌；免疫逃避；預(yù)后

中圖分類號(hào)：R735.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.05.009

Cuproptosis-related LncRNA Predict Prognosis and Immune Response in Gastric Cancer

BAI Hongyan， WANG Shuo， FEI Sujuan， MIAO Bei*

（Department of Gastroenterology， Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University， Xuzhou 221004， China）

Abstract： Based on bioinformatics analysis， a prognosis-related prediction model was constructed to explore the relationship between copper death-related LncRNA and gastric cancer （GC） in immunity and prognosis. RNA sequencing and clinical data of gastric cancer patients were downloaded from the Cancer Genome Atlas （TCGA） database， copper death-related LncRNA were screened based on co-expression analysis， and a copper death-related LncRNA risk prediction model closely related to the prognosis of gastric cancer patients was constructed by LASSO regression and multivariate Cox regression analysis， and the risk scores of all gastric cancer patient samples were calculated. The prognostic prediction performance of the model was confirmed by Kaplan-Meier survival analysis， regression analysis and ROC curve， and the correlation between risk score and pathway enrichment analysis， immune infiltrating cells， immune checkpoint genes， somatic gene mutations and anticancer drug sensitivity was analyzed. The results of differential expression analysis showed that the expression of LncRNA HAGLR in tumor tissues was upregulated. The expression of LncRNA HAGLR in cancer tissues and paracancerous tissues in 69 patients with radical surgery was detected by quantitative real-time PCR （qRT-PCR）. The qRT-PCR results showed that the expression of HAGLR in gastric cancer tissues was upregulated compared with adjacent tissues， and was significantly correlated with tumor size， the depth of invasion， clinical stage， degree of differentiation and lymph node metastasis （P<0.05）. The prognostic model constructed from copper death-related LncRNA has high prognostic value and is significantly related to the heterogeneity of immune cell infiltration， and has certain clinical value in predicting the effect of immunotherapy and guiding the selection of chemotherapy drugs in patients.

Key words： cuproptosis; LncRNA; gastric cancer; immune invasion; prognosis

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（5）： 460-472）

胃癌（gastric cancer，GC）是全球惡性腫瘤中第三大最常見的死亡原因［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年新增病例1 089 103例，死亡病例768 793例［2］。隨著早期診斷技術(shù)的發(fā)展，胃癌的發(fā)病率呈現(xiàn)一定的下降趨勢(shì)，但晚期患者無法手術(shù)，且對(duì)抗癌藥物的反應(yīng)各不相同，5年生存率仍然很低，預(yù)后仍然很差［3］。手術(shù)和術(shù)后輔助治療是GC的主要治療方法，而近年來，腫瘤免疫療法顯示出使腫瘤消退的強(qiáng)大作用，已成為治療中越來越重要的一部分。然而，大量患者對(duì)這些療法沒有反應(yīng)，迫切需要探索治療耐藥機(jī)制，尋求有效的生物標(biāo)志物，以更好地預(yù)測(cè)預(yù)后和指導(dǎo)臨床治療。

銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡不同于其他形式的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡［4］。細(xì)胞對(duì)銅的耐受性有一定的閾值，過量的銅會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激和細(xì)胞毒性［5］。銅在線粒體中的積累和直接結(jié)合驅(qū)動(dòng)脂酰化TCA循環(huán)酶的聚集［6］。作為一種關(guān)鍵的微量元素，銅也是免疫系統(tǒng)功能所必需的。缺銅可能會(huì)影響免疫細(xì)胞在組織中的分布或白細(xì)胞的成熟模式［7］。此外，瘤內(nèi)銅可以調(diào)節(jié)程序性死亡配體（programmed death-ligand 1，PD- L1）表達(dá)并影響腫瘤免疫逃避［8］。許多研究表明，銅死亡與癌癥（包括乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌和肺癌）的進(jìn)展、預(yù)后及治療密切相關(guān)［9-10］。重要的是，銅死亡抑制胃癌細(xì)胞生長［11］并誘導(dǎo)抗腫瘤活性［12］。因此，銅死亡在新興免疫療法中發(fā)揮著重要作用，靶向誘導(dǎo)銅死亡為胃癌提供了有效的治療方向。

長鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，LncRNA）是一類長度超過200個(gè)核苷酸的非編碼轉(zhuǎn)錄本［13］，除了參與基因組轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后修飾等過程［14］，還在腫瘤中發(fā)揮重要調(diào)控作用［15］。例如，LncRNA參與免疫系統(tǒng)的基因表達(dá)，并調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫反應(yīng)［16］。此外，最近的研究觀察到，LncRNA與癌細(xì)胞中的程序性細(xì)胞死亡相關(guān)［17］，這表明，LncRNA與銅死亡之間存在潛在聯(lián)系。值得關(guān)注的是，關(guān)于胃癌與銅死亡相關(guān)LncRNA之間關(guān)系的研究較少，銅死亡相關(guān)LncRNA在胃癌預(yù)后和免疫反應(yīng)中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

本研究旨在篩選出與銅死亡相關(guān)的LncRNA，構(gòu)建適用于胃癌患者的預(yù)測(cè)生存結(jié)局和免疫反應(yīng)的預(yù)后模型，同時(shí)對(duì)胃癌組織樣本進(jìn)行LncRNA HAGLR的表達(dá)分析，以期為改善胃癌患者預(yù)后、開辟新的治療靶點(diǎn)提供證據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)集

從TCGA數(shù)據(jù)庫獲得胃癌患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床資料。本研究共獲得371例患者樣本。臨床資料包括性別、年齡、腫瘤分期、腫瘤分級(jí)、生存狀況、生存時(shí)間。從先前發(fā)表的一項(xiàng)研究中提取了49個(gè)與銅死亡相關(guān)的基因［4］。本研究獲得徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，倫理批號(hào)：XYFY2023-KL263。遵照倫理相關(guān)規(guī)定收集了69例GC患者（年齡為28～92歲，平均年齡為63歲）的腫瘤組織和匹配的鄰近癌旁組織（距離腫瘤邊緣至少5 cm）。這些患者于2021年1月至2022年12月在徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院接受了常規(guī)根治性手術(shù)。

1.2 銅死亡相關(guān)LncRNA的篩選

“l(fā)imma”包用于進(jìn)行LncRNA和銅死亡基因相關(guān)性分析，篩選出與49個(gè)銅死亡基因共表達(dá)的LncRNA，設(shè)定閾值為|Cor|>0.4和P<0.05。

1.3 基于銅死亡相關(guān)LncRNA的預(yù)后模型構(gòu)建

采用等效抽樣方法將樣本分為訓(xùn)練組（260例）和驗(yàn)證組（111例）。進(jìn)行單變量Cox回歸分析以篩選出訓(xùn)練組中與預(yù)后有關(guān)的銅死亡相關(guān)LncRNA（0.05作為閾值），并繪制森林樣地圖。為了提高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性和避免過度擬合，使用“survival”和“glmnet”包進(jìn)行最小絕對(duì)收縮和選擇算子（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）Cox回歸分析，并進(jìn)行1 000倍交叉驗(yàn)證。最后，通過多變量Cox回歸分析識(shí)別風(fēng)險(xiǎn)基因并計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分計(jì)算公式如下：

風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分 =系數(shù)×LncRNA

訓(xùn)練組中風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)設(shè)為臨界值，將胃癌樣本分為高危組和低危組。

1.4 銅死亡相關(guān)LncRNA預(yù)后模型的驗(yàn)證

采用Kaplan-Meier方法比較兩組的總體生存時(shí)間差異，并使用ggplot2軟件包創(chuàng)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與患者生存狀態(tài)之間的危險(xiǎn)因素關(guān)聯(lián)圖。進(jìn)行包括風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和臨床資料在內(nèi)的單變量和多變量Cox回歸分析，以確定該模型是否可以作為臨床預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。根據(jù)受試者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線和無進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）分析評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)模型預(yù)測(cè)GC患者的總生存期（overall survival，OS）和PFS的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，并構(gòu)建一致性指數(shù)模型進(jìn)一步驗(yàn)證它們的預(yù)測(cè)能力。

1.5 免疫檢查點(diǎn)基因分析

為了探究免疫檢查點(diǎn)基因阻斷的治療效果，我們根據(jù)TCGA-LIHC基因表達(dá)譜，將篩選出的12個(gè)LncRNA與關(guān)鍵免疫檢查點(diǎn)基因建立共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（P<0.05），包括LILRB4、CTLA4、CD86和CD274等，并分析關(guān)鍵免疫檢查點(diǎn)基因與銅死亡相關(guān)LncRNA的相關(guān)性。

1.6 腫瘤免疫細(xì)胞浸潤與免疫應(yīng)答分析

使用“ssGSEA”包進(jìn)行單樣本基因集富集分析（single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）以評(píng)估23種免疫細(xì)胞在所有患者的富集差異和免疫功能。隨后，利用“ESTIMATE”包計(jì)算樣本腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironmrnt，TME）中免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的成分。運(yùn)行腫瘤免疫功能障礙與排斥算法（tumor immune dysfunction and exclusion，TIDE）計(jì)算數(shù)據(jù)集（http：//tide.dfci.harvard.edu）中每個(gè)患者的免疫治療評(píng)分，展示風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和免疫檢查點(diǎn)阻斷治療之間的關(guān)系。

1.7 功能富集分析

采用R編程語言（4.1.3）版本中的clusterProfiler包進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，以確定涉及GC的關(guān)鍵基因和通路。

1.8 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與腫瘤突變負(fù)荷的關(guān)系

腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden，TMB）是每兆堿基腫瘤DNA的總外顯子突變計(jì)數(shù)。使用R包“maftools”計(jì)算每位患者基于LIHC樣本突變數(shù)據(jù)的TMB評(píng)分。

1.9 藥物敏感性評(píng)估

使用“pRRophetic”R包對(duì)如塞卡替尼、達(dá)沙替尼、吉非替尼和甲氨蝶呤等藥物進(jìn)行藥敏分析，并采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較高危組和低危組的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）差異。數(shù)據(jù)來自腫瘤藥物敏感性基因組學(xué)（genomics of drug sensitivity in cancer，GDSC）數(shù)據(jù)庫（https：//www.cancer-rxgene.org/）。

1.10 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

高靈敏度染料法定量PCR檢測(cè)試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。利用Trizol試劑快速提取法提取組織中總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明，在20 μL體系中加2 μg總RNA進(jìn)行cDNA的合成。采用2×SYBR Green PCR Master Mix對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。LncRNA HAGLR上游引物：5'-CATTCTCCTCCTGTATTCTCT-3'，下游引物：5'-GTCCTGGTCACTGGTAAG- 3'；內(nèi)參GAPDH上游引物：5'-GACTCATGACCACAAGTCCATGC-3'，下游引物：5'-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG- 3'。每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，以GAPDH作為內(nèi)參照。采用2-△△Ct法［18］將LncRNA相對(duì)的表達(dá)量計(jì)算出來，△Ct值=樣本和內(nèi)參基因的Ct值之差。

1.11 統(tǒng)計(jì)處理

單變量和多變量Cox回歸分析用于計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比并確定獨(dú)立的風(fēng)險(xiǎn)因素。利用ROC曲線評(píng)估預(yù)后模型的敏感度和特異性。利用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行兩組之間基因差異分析，Spearman相關(guān)檢驗(yàn)分析基因表達(dá)間的相關(guān)性。qRT-PCR試驗(yàn)采用兩組配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用R語言（版本4.1.3）進(jìn)行。P<0.05被認(rèn)為是顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 在GC樣本中鑒定銅死亡相關(guān)LncRNA

使用GENCODE數(shù)據(jù)庫在TCGA-LIHC表達(dá)矩陣中鑒定了16 876個(gè)LncRNA。Pearson分析鑒定出801個(gè)銅死亡相關(guān)LncRNA。這些LncRNA與ABCB6、BACE1、COX19、DAXX、FDX1、GLS、SNCA等49個(gè)銅死亡相關(guān)基因相關(guān)。從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲得371例GC患者的詳細(xì)臨床病理特征，隨機(jī)分為訓(xùn)練組和驗(yàn)證組，兩組臨床指標(biāo)基本一致，具有可比性。數(shù)據(jù)見表1。

2.2 銅死亡相關(guān)LncRNA預(yù)后模型的構(gòu)建

利用單因素Cox回歸分析篩選出與胃癌患者OS顯著相關(guān)的260個(gè)銅死亡相關(guān)LncRNA（P<0.05），圖1a顯示了前24個(gè)的風(fēng)險(xiǎn)比和P值，其中13個(gè)均為HR>1的危險(xiǎn)基因（P<0.05）。然后，采用LASSO Cox回歸分析和多變量Cox回歸分析篩選得到12個(gè)與預(yù)后最相關(guān)的變量，構(gòu)建了風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型（圖1b～1c）。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=（0.29×Expression HAGLR）+（0.86×Expression AC244100.3）-（1.00×Expression STX18-AS1）+（0.40×Expression AC093627.5）-（1.15×Expression AC139019.1）-（0.52×Expression AC026412.3）+（0.78×Expression AP000894.2）+（0.91×Expression AC002480.2）-（0.40×Expression AC016394.2）+（0.51×Expression AL590705.3）-（0.66×Expression AC007277.1）+

（0.56×Expression AL139351.3）。Kaplan-Meier生存曲線表明，高危組的OS明顯低于低危組（圖1d～1f）。患者的死亡例數(shù)隨著風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的上升明顯上升（P<0.05），這表明風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和生存時(shí)間顯著相關(guān)，見圖1g～1h。熱圖展示出高危和低危組中12個(gè)LncRNA的表達(dá)含量差異（圖1i）。

2.3 銅死亡相關(guān)LncRNA預(yù)后模型的預(yù)后價(jià)值

單變量Cox回歸分析結(jié)果表明，年齡（P=0.004，HR=1.026，95%CI［1.008，1.044］）、腫瘤分期（P<0.001，HR=1.534，95%CI［1.241，1.896］）和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（P<0.001，HR=1.082，95%CI［1.056，1.108］）是胃癌進(jìn)展的危險(xiǎn)因素，見圖2a。多變量Cox回歸分析結(jié)果表明，在調(diào)整其他混雜因素影響后，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（P<0.001，HR=1.085，95%CI［1.058，1.113］）仍為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素（圖2b）。低危組GC患者具有更好的PFS（P<0.05，圖2c）。時(shí)間依賴性ROC曲線分析結(jié)果顯示，1年、3年和5年OS的預(yù)后LncRNA模型的曲線下面積（area under curve，AUC）值分別為0.736、0.763和0.740（圖2d）。分類ROC曲線顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的AUC值遠(yuǎn)高于其他臨床因素的AUC值，一致性指數(shù)再次證實(shí)模型具有優(yōu)于臨床病理特征的預(yù)測(cè)預(yù)后能力，見圖2e～2f。

2.4 免疫檢查點(diǎn)基因分析

多個(gè)免疫檢查點(diǎn)（包括CTLA4、CD274、CD86和LILRB4）與銅死亡相關(guān)LncRNA及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分明顯相關(guān)（P<0.05，圖3a），CD86和LILRB4表達(dá)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈正相關(guān)，而CTLA4和CD274表達(dá)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（圖3b～3e），這4個(gè)免疫檢查點(diǎn)基因可能受12個(gè)銅死亡相關(guān)LncRNA調(diào)控。

2.5 基于預(yù)后模型亞組的綜合免疫浸潤分析

采用ssGSEA分析評(píng)估高危組和低危組GC患者13種免疫相關(guān)功能的狀態(tài)。如熱圖所示，type＿II＿IFN＿response、APC＿co＿stimulation、CCR和MHC＿class I在高危組和低危組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4a）。分析TCGA腫瘤免疫浸潤數(shù)據(jù)，兩組之間大多數(shù)免疫細(xì)胞的浸潤存在顯著差異。高危人群的適應(yīng)性免疫細(xì)胞浸潤特別豐富，例如，γδT細(xì)胞、未成熟的樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（圖4b）。盡管兩組之間的免疫評(píng)分沒有顯著差異，但低危組患者表現(xiàn)出更高的腫瘤純度和較低的基質(zhì)成分（圖4c～4d）。兩組之間的TIDE評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4e）。據(jù)報(bào)道，腫瘤基質(zhì)細(xì)胞參與免疫調(diào)節(jié)［19］，能夠阻止免疫細(xì)胞進(jìn)入腫瘤實(shí)質(zhì)，還可以阻止T細(xì)胞殺死腫瘤細(xì)胞［20］。TIDE分析可以評(píng)估不同風(fēng)險(xiǎn)模式患者的免疫治療反應(yīng)是否存在差異。高危組GC患者的基質(zhì)成分和TIDE評(píng)分明顯高于低危組。這表明低危組患者的免疫治療效果可能更好。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分可作為GC患者免疫治療效果的有意義的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

2.6 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與腫瘤突變負(fù)荷相關(guān)性

根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫中GC患者的體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)，計(jì)算并比較兩組之間的TMB評(píng)分。結(jié)果表明，兩組之間TMB評(píng)分具有顯著差異，高危組的TMB水平更低（圖5a）。采用TMB中位數(shù)評(píng)分將GC患者分為高TMB組和低TMB組。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，高TMB組患者的OS明顯高于低TMB組（圖5b）。此外，我們以瀑布圖形式可視化了兩組的前15個(gè)高頻突變基因，兩組突變頻率最高的基因均為TTN（圖5c～5d）。

2.7 功能富集分析

為了了解導(dǎo)致高危組與低危組之間TME和PFS差異的潛在生物學(xué)機(jī)制，對(duì)兩組間差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO功能富集分析和KEGG通路分析。生物學(xué)過程參與受體-配體相互作用、糖胺聚糖結(jié)合和激素活性的調(diào)節(jié)。細(xì)胞成分主要在細(xì)胞外基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂蛋白復(fù)合物中調(diào)節(jié)。分子功能主要調(diào)節(jié)水解酶、激素運(yùn)輸和血漿脂蛋白。根據(jù)KEGG分析，銅死亡相關(guān)LncRNA主要富集于分解代謝、蛋白加工和激素分泌等過程（圖6a～6b）。

2.8 GC患者抗癌藥物敏感性預(yù)測(cè)

使用“pRRophetic”R包共鑒定出6種藥物，其敏感性（IC50）在高危組和低危組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖7），表明這些藥物可能有助于指導(dǎo)GC患者的個(gè)性化治療，并且阿糖胞嘧啶、達(dá)沙替尼和塞卡替尼可能是高危組患者治療的預(yù)測(cè)候選藥物。

2.9 胃癌LncRNA HAGLR表達(dá)

利用TCGA數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中LncRNA HAGLR表達(dá)明顯上調(diào)，胃癌組織和癌旁組織樣本中LncRNA HAGLR相對(duì)表達(dá)量分別為1.689和1.116，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖8a，P<0.05）。Kaplan-Meier生存曲線表明，LncRNA HAGLR與患者生存預(yù)后有關(guān)，高表達(dá)的患者具有較差的OS（圖8b）。qRT-PCR結(jié)果顯示，收集的胃癌組織和癌旁組織中LncRNA HAGLR相對(duì)表達(dá)量分別為1.39±0.70、0.75±0.39，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.663，P<0.01），見圖8c。并且LncRNA HAGLR的表達(dá)水平與性別、年齡及腫瘤部位無關(guān)（P>0.05），與腫瘤直徑、浸潤深度、分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

3 討論

鑒于胃癌的高度異質(zhì)性，可用于靶向治療的主要驅(qū)動(dòng)基因尚未確定，而免疫療法在治療晚期和復(fù)發(fā)性胃癌患者方面擁有放療和化療所不具備的優(yōu)勢(shì)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和前景。因此，識(shí)別腫瘤相關(guān)基因改變也許可以為胃癌的預(yù)后和免疫治療提供一定的思路。

作為一個(gè)新術(shù)語，銅死亡被用來描述由銅引起的獨(dú)特的生物過程。越來越多的研究表明，較高水平的銅與惡性腫瘤有關(guān)［21］。然而，許多研究都集中在銅死亡在癌癥進(jìn)展機(jī)制中的作用，預(yù)測(cè)癌癥存活率方面的研究很少。LncRNA是一類沒有編碼功能的RNA，可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)功能，形成復(fù)雜的監(jiān)管網(wǎng)絡(luò)。LncRNA的異常表達(dá)可直接或間接影響腫瘤微環(huán)境中的其他細(xì)胞，從而參與腫瘤免疫的形成［22］。隨著研究深入，銅死亡相關(guān)LncRNA與腫瘤進(jìn)展的關(guān)系愈加緊密，其在腫瘤預(yù)后預(yù)測(cè)中的潛在價(jià)值逐漸顯現(xiàn)，但目前對(duì)于其在胃癌預(yù)后中價(jià)值的相關(guān)研究較少。

本研究系統(tǒng)地證明了銅死亡相關(guān)LncRNA在胃癌預(yù)后和腫瘤微環(huán)境中的作用。首先，基于TCGA數(shù)據(jù)集確定了新的與銅死亡相關(guān)的LncRNA預(yù)后特征，共鑒定出24種與銅死亡相關(guān)的預(yù)后LncRNA，通過LASSO回歸篩除假陽性LncRNA，其中12個(gè)LncRNA被選入預(yù)測(cè)模型。然后，采用Kaplan-Meier生存分析、ROC曲線和一致性指數(shù)驗(yàn)證風(fēng)險(xiǎn)模型的預(yù)后價(jià)值。生存曲線證明高危組患者預(yù)后更差，ROC曲線中1、3、5年的 AUC分別為0.736、0.763、0.740，這表明模型在預(yù)測(cè)長期結(jié)果方面具有較高的準(zhǔn)確性。此外，單因素、多因素Cox回歸分析和一致性指數(shù)分析明確了模型的獨(dú)立且優(yōu)于臨床特征的預(yù)測(cè)預(yù)后價(jià)值。

盡管免疫療法對(duì)胃癌有效，但由于對(duì)腫瘤微環(huán)境及個(gè)體差異的不完全了解，其療效并不一致。目前，一些臨床數(shù)據(jù)表明，基因變化與免疫治療反應(yīng)之間存在相關(guān)性［23］。因此，有必要確定哪些患者最有可能對(duì)免疫治療產(chǎn)生反應(yīng)。CTLA-4是除PD-1/PD-L1之外的T細(xì)胞的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子，它限制了抗腫瘤免疫反應(yīng)［24］，免疫檢查點(diǎn)分析結(jié)果顯示，其與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。ssGSEA結(jié)果表明，銅死亡相關(guān)LncRNA預(yù)后模型與GC組織中免疫細(xì)胞的富集有關(guān)。高腫瘤突變負(fù)荷也已成為預(yù)測(cè)許多癌癥對(duì)免疫療法反應(yīng)的敏感生物標(biāo)志物，包括肺癌、膀胱癌和頭頸癌［25-26］。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分連同突變數(shù)據(jù)揭示了不同組間轉(zhuǎn)錄組水平基因變異頻率的顯著差異。在高危組和低危組中，分別有151名（90.42%）和173名（89.18%）患者被鑒定出體細(xì)胞突變。本研究對(duì)這些患者中最常見的15種突變進(jìn)行了排序。TTN、TP53和MUC16基因的突變頻率最高，與其他一些研究相似［27］。腫瘤中的非同義突變負(fù)荷較高可導(dǎo)致形成更多的新抗原，從而增加免疫原性并增強(qiáng)免疫治療反應(yīng)［28］。本研究中低危組表現(xiàn)出較高的腫瘤突變負(fù)荷以及較低的TIDE評(píng)分。這些結(jié)果提示，低危組較好的預(yù)后可能與其對(duì)免疫治療產(chǎn)生反應(yīng)有關(guān)，并且可從抗CTLA-4抗體治療中受益更多。高危組更可能表現(xiàn)出免疫逃逸和免疫治療耐藥。另外，許多獨(dú)立研究調(diào)查了化療耐藥現(xiàn)象中的個(gè)別LncRNA［29］，但關(guān)于銅死亡相關(guān)LncRNA在預(yù)測(cè)化療耐藥性中的作用和功能的研究仍然缺乏。本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫對(duì)胃癌樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)多種抗腫瘤藥物在兩組間具有明顯差異，可用于預(yù)測(cè)胃癌患者的耐藥傾向。

LncRNA常形成高度穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在多種腫瘤生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。截至目前，在預(yù)測(cè)預(yù)后的12個(gè)銅死亡相關(guān)LncRNA中，只有HAGLR和AC007277.1被報(bào)道與癌癥相關(guān)［30-31］。根據(jù)最近的一項(xiàng)研究，HAGLR（也稱為HOXD-AS1和Mdgt）在胃癌細(xì)胞中明顯過表達(dá)，敲除HAGLR可使JAK2/STAT3通路失活，從而抑制胃癌進(jìn)展［30］。本研究納入69例胃癌患者，比較了胃癌患者胃癌及癌旁組織中LncRNA HAGLR的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果證實(shí)，胃癌患者腫瘤組織中LncRNA HAGLR的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，并且HAGLR過表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、分化程度、臨床分期有關(guān)。這表明，LncRNA HAGLR作為促癌基因有望成為提示胃癌預(yù)后的重要生物學(xué)指標(biāo)，并為模型在臨床應(yīng)用提供了病理組織學(xué)證據(jù)。目前銅死亡相關(guān)LncRNA在胃癌中具體的生物學(xué)功能尚不十分明確，HAGLR極有可能是胃癌患者的一種潛在的治療靶標(biāo)，具有重要的研究?jī)r(jià)值。未來還需要通過細(xì)胞和動(dòng)物試驗(yàn)等進(jìn)一步探索LncRNA HAGLR、AC007277.1等參與胃癌進(jìn)展的上下游分子機(jī)制。其余10種LncRNA尚未報(bào)道參與調(diào)控癌癥的發(fā)生發(fā)展。本研究率先強(qiáng)調(diào)了他們作為胃癌患者臨床診治的潛在標(biāo)志物和預(yù)后評(píng)估指標(biāo)的潛力，對(duì)深入挖掘胃癌增殖、侵襲的多種調(diào)控途徑有一定的提示和指導(dǎo)意義。這些發(fā)現(xiàn)都為未來控制胃癌提供強(qiáng)了有力的理論支持和新方向。

綜上所述，本研究分別從生物信息學(xué)和臨床組織學(xué)角度突出了銅死亡相關(guān)LncRNA在胃癌中的預(yù)測(cè)生存結(jié)局和臨床應(yīng)用價(jià)值，利用模型的評(píng)分系統(tǒng)賦予臨床胃癌患者風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，可評(píng)估患者1、3、5年的生存率、免疫細(xì)胞浸潤、體細(xì)胞突變負(fù)荷、免疫治療療效和指導(dǎo)用藥選擇，為胃癌患者個(gè)體化治療提供了新的途徑和思路。

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