高郵市小腸結腸炎耶爾森菌監測結果分析

劉文俊,周信,徐勤,崔侖標, 高金彬, 孫翔, 王艷,徐婭雯,吳倩

1.揚州市疾病預防控制中心,江蘇 揚州 225001; 2.江蘇省疾病預防控制中心;3.高郵市疾病預防控制中心;4.江蘇省蘇北人民醫院

小腸結腸炎耶爾森菌(Yersinia Enterocolitica,Y.enterocolitica)屬革蘭氏陰性桿菌,是一種全球流行的人畜共患腸道病原菌[1],是少數幾種能在冷藏條件下生長繁殖的致病菌之一[2]。小腸結腸炎耶爾森菌曾在歐洲暴發流行[3],我國近年來感染以散發為主,兒童多見[4]。該菌致病臨床表現缺乏特異性,與志賀菌等致瀉病原菌相似,易造成誤診而導致持續感染[5]。很多國家已將小腸結腸炎耶爾森菌納入進出口食品常規檢測,我國則尚未納入,存在安全隱患。本研究為2021年在高郵市開展的小腸結腸炎耶爾森菌專項監測,旨在分析該菌在高郵地區的流行水平、宿主分布及病原學特征,為指導當地畜禽養殖和疾病防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 2021年,高郵市8個鄉鎮監測點采集各類樣本1 010份,包括腹瀉患者糞便樣本57份,豬、牛、羊、狗、雞、鴨、鵝等糞便樣本713份,蒼蠅活體樣本60份(15只為1份),屠宰場組織樣本240份(剛宰殺生豬的舌組織、咽喉組織及糞便樣本),樣本采集后無菌保存并冷鏈運送至揚州市疾控中心實驗室。

1.2 試劑與儀器 改良磷酸鹽緩沖液、改良克氏雙糖鐵瓊脂和動力吲哚尿素培養基(北京陸橋公司),分析純級氫氧化鉀(美國Sigma公司),Y.enterocolitica顯色培養基(法國科瑪嘉公司),API-32E板條、全自動微生物鑒定分析儀(法國梅里埃公司),O:1,O: 2、O:3、O:5、O:8、O:9血清分型試劑(日本生研株式會社),DNA提取試劑盒、核酸提取儀(上海伯杰公司),Y.enterocolitica毒力基因熒光PCR檢測試劑(北京卓誠惠生公司),熒光定量PCR儀(美國ABI公司),生化培養箱(上海精宏公司)。

1.3 方法

1.3.1 細菌培養 將樣本置于4℃條件下增菌培養,于第7、14、21 d分別吸取0.5 mL增菌液與0.5%堿處理液3.5 mL,混合15 s后,接種于顯色培養基,26℃培養36～48 h,每板挑取2～3個疑似菌落開展純培養。

1.3.2 生化鑒定 將疑似菌落轉接種至改良克氏雙糖鐵瓊脂、動力吲哚尿素和半固體培養基,26℃培養18～24 h,選擇雙糖+/+、不產氣或少產氣、H2S-、尿素酶+、26℃動力+/37℃動力-且為革蘭氏陰性桿菌的菌株,轉接種于API-32E生化板條進行系統生化鑒定。

1.3.3 血清分型和生物分型 挑選系統生化鑒定陽性菌株,分別與O:1、O:2、O:3、O:5、O:8、O:9血清試劑開展玻片凝集試驗,設滅菌生理鹽水為陰性對照,“++”及以上為陽性,無凝集反應為血清未定型。參照文獻[6]方法對系統生化鑒定陽性菌株進行生物分型。

1.3.4 毒力基因檢測 從菌液中提取基因組DNA,對小腸結腸炎耶爾森菌的黏附侵襲位點(ail)、耐熱性腸毒素(ystA、 ystB)、黏附因子(yadA)和毒力因子(virF)等5個毒力基因開展熒光定量PCR檢測。

1.4 統計分析 數據錄入SPSS 22.0軟件進行統計分析,計數資料以[n(%)]表示,用χ2檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基本情況 1 010份樣本中,共檢出26株小腸結腸炎耶爾森菌,總檢出率為2.57%。其中,豬糞中檢出率最高10.39%(24/231),其次分別為腹瀉患者糞便1.75%(1/57)、蒼蠅樣本1.67%(1/60),其他均未檢出,檢出率差異有統計學意義(χ2=7.50,P<0.05)。

2.2 血清分型、生物分型情況 26株陽性菌株中,不同類型樣本之間血清型、生物型分布差異較大。血清分型:O:3型6株(豬糞源),O:5型12株(豬糞源11株,腹瀉患者糞便1株),O:8型4株(豬糞源3株,蒼蠅1株),未定型4株(豬糞源),未檢出O:1、O:2、O:9型;生物分型:1A型2株(豬糞源),2型4株(豬糞源3株,腹瀉患者糞便1株),3型20株(豬糞源19株,蒼蠅1株)。

2.3 毒力基因分布情況 根據小腸結腸炎耶爾森菌毒力基因攜帶情況,可分為4個基因型:非致病性基因I型(ail-、ystA-、ystB-、yadA-、virF-)、基因II型(ail-、ystA-、ystB+、yadA-、virF-)、致病性基因III型(ail+、ystA+、ystB-、yadA+、virF+)、基因IV型(ail+、ystA+、ystB-、yadA-、virF-)。26株陽性菌株中,6株為生物3型/血清O:3型;檢出致病性基因III型5株(豬糞源)、基因IV型1株(豬糞源),檢出非致病性基因II型20株(豬糞源18株、腹瀉患者糞便1株、蒼蠅1株)。

3 討論

研究顯示,2021年從高郵市1 010份各類樣本中共檢出小腸結腸炎耶爾森菌26株,總檢出率2.57%,高于東臺市[7],低于六安市[8],與高密市[9]相近,也略低于本地區2018—2020年水平[10],提示該菌流行水平存在地域差異[11],不同監測年份陽性率存在一定波動。各類樣本中檢出率由高到低分別是豬糞、腹瀉患者糞便和蒼蠅,其他類型樣本均無陽性檢出,提示小腸結腸炎耶爾森菌在宿主易感性方面差異較大,豬是其主要宿主,與李旭等[12]的結果一致。蒼蠅樣本中有陽性檢出,存在將該菌從養殖場區、屠宰區傳播至居民區的風險。本研究從1例腹瀉患者(某生豬養殖場工作人員)糞便樣本中檢出陽性菌株,與該養殖場豬糞樣本中檢出型別一致,提示該工作人員可能接觸了帶菌的豬糞或其污染物進而導致了感染。

目前,小腸結腸炎耶爾森菌血清型有70多種,其中O:3、O:5、O:8、O:9等血清型與人類耶爾森菌病緊密相關[13],我國報道的致病性菌株主要為O:3和O:9型[14-15];按照生化反應結果的不同,又可分為1A、1B、2、3、4、5生物型,我國報道的致病性菌株以生物2、3型較為常見,1A型一般無致病性[16]。本研究分離到26株陽性菌株,6株為生物3型/血清O:3型,為本地區主要致病性菌株型別,均分離自豬糞,提示豬是攜帶并傳播致病性小腸結腸炎耶爾森菌的重要宿主,與有關報道結果一致[17]。

小腸結腸炎耶爾森菌有5個毒力相關基因,其中yadA和virF基因位于質粒上,ail、ystA和ystB 基因位于染色體上,可通過相關毒力基因的檢測結果來判定其致病性情況。致病性菌株通常攜帶ail、yadA、ystA及virF基因,非致病性菌株一般僅攜帶ystB基因[18]。有研究報道,質粒在細菌傳代過程中可能會發生丟失,依賴染色體上的毒力基因結果進行致病性判斷更加可靠[19]。對26株分離菌株進行毒力基因檢測發現,共有6株攜帶毒力基因,其中基因Ⅲ型(ail+、ystA+、ystB-、yadA+、virF+)5株,基因IV型(ail+、ystA+、ystB-、yadA-、virF-)1株,為致病性菌株,與血清分型結果一致。

綜上,本研究基本掌握了高郵市小腸結腸炎耶爾森菌的宿主分布情況及病原學特征。豬是最主要帶菌宿主和潛在傳染源,在生豬、養殖職業人群及蒼蠅媒介等方面均存在不同程度的污染,生物3型/血清O:3型是本地區主要致病型別。提示應繼續做好流行病學及病原學監測,重點加強對生豬養殖及屠宰加工環節的監管,要求養殖場、屠宰場做好環境衛生消毒和糞便無害化處理,關鍵場所配備滅蠅設備,相關場所從業人員養成良好衛生習慣,進而有效降低人畜感染的風險。