金銀花外觀性狀與主要有效成分含量的相關性研究

唐志強 程雪梅 劉謙 李佳 劉振華 張永清 劉紅燕 蒲高斌

關鍵詞：金銀花；外觀性狀：有效成分：相關性分析

金銀花為忍冬科植物忍冬（Lonicerae japonzcaThunb.）的干燥花蕾及初開的花，是我國傳統(tǒng)大宗中藥材之一，具有清熱解毒、疏散風熱等功效，被廣泛應用于中藥臨床及中成藥復方制劑。金銀花主產于山東、河南、河北等地，主要有效成分為黃酮類、有機酸類及萜類等，其中木犀草苷和綠原酸類化合物是2020版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的金銀花指標性成分。

中藥材質量一直是制約中醫(yī)臨床合理用藥的瓶頸問題之一．傳統(tǒng)的依靠經(jīng)驗通過藥材外觀進行品質鑒別，即所謂的“辨狀論質”，目前仍是中藥材真?zhèn)蝺?yōu)劣鑒別的主要方法。如細辛以色白者為善；知母以根黃白、脂潤者為好；黃芪以大而肥潤箭直者良。然而，“辨狀論質”主要依靠專家經(jīng)驗，受人為主觀因素及判別標準等的影響，很難形成統(tǒng)一、客觀的標準。如何解析“辨狀論質”背后的科學道理成為中藥現(xiàn)代化發(fā)展亟需解決的問題。為此，有學者從外觀性狀與有效成分間相關性的角度對中藥材“辨狀論質”的科學性進行探討，已在多個物種中得到驗證，但尚未見金銀花的相關研究。因此，本試驗選用顏色、花蕾直徑和長度等金銀花外觀指標，分析其與金銀花主要有效成分（木犀草苷和綠原酸類物質）含量之間的相關性，以期為金銀花“優(yōu)形”“優(yōu)質”研究提供新思路，進而為金銀花藥材質量標準制定提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料與試劑

供試的50批金銀花于2022年3月分別收集于山東、河南和河北三省份，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學蒲高斌教授鑒定，為忍冬科多年生木質藤本植物忍冬（Lonicerae japonica Thunb.）的花蕾。

木犀草苷（批號Y13JIOH93050）、綠原酸（批號20130415）、異綠原酸A（批號20130816）、異綠原酸C（批號20130924）對照品均由上海源葉生物科技有限公司提供，質量分數(shù)均大于98%。乙腈、甲酸為色譜純，其他試劑為分析純。

1.2調查項目及方法

1.2.1金銀花顏色值測定每批金銀花隨機抽取10個完整花蕾，用CM-600D型色差儀（杭州柯盛行儀器有限公司）進行掃描，使用光源為D65，照明口徑為50mm，波長掃描范圍為380～780nm，標準觀察角度為10°，掃描速度為600nm/min。所測數(shù)據(jù)用色空間法表示，其中，L*為亮度值，值越大表示亮度越高；a表征紅一綠色軸，正值為紅，負值為綠；b表征黃-藍色軸，正值為黃，負值為藍。以標準白板作為標準樣品，測得L*=17.53，a=13.76，b=45.64。將所測得的金銀花樣品色度值與標準樣品的測定值做差，即為樣品的色度值；其中，Aa值越大樣品顏色越紅，反之越綠，而Ab值越大樣品顏色越黃，反之越藍。每個花蕾掃描10次，取平均值。

1.2.2花蕾外觀性狀測量每批金銀花隨機抽取10個完整花蕾，用游標卡尺分別測量其長度及上、中、下部直徑，取平均值。

1.2.3金銀花有效成分含量的測定使用Agi-lent 1260高效液相色譜儀進行測定。

混合對照品溶液的制備：精密稱取綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A和異綠原酸C對照品適量，用50%的甲醇制成單個對照品儲備液，分別精密量取各儲備液適量，配制成系列濃度的混合對照品溶液。

供試品溶液的制備：精密稱取金銀花樣品粉末（過3號篩）1.0g，置100mL具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50mL，密塞，稱重，超聲處理（100W，100kHz） 30min，放冷，用50%甲醇補足失重，搖勻，4000r/min離心10min，取上清，過0.22um微孔濾膜，即得供試品溶液。

色譜條件：色譜柱ZORBAXSB-C18（250mmx4.6mm．5um）；流速1.0mL/min；柱溫30℃；進樣量20uL；檢測波長327、350nm。流動相A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈。洗脫梯度：0～10min，8%～10%B;10～20min，10%～15%B;20～30min，15%B;30～40min， 15%～25%B;40～60min，25%～100%B。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 22.0軟件對金銀花外觀性狀指標及有效成分含量進行Pearson雙側相關性統(tǒng)計分析，并進行逐步回歸分析。

2結果與分析

2.1不同批次金銀花顏色差異分析

為減小誤差，每批金銀花隨機選10個花蕾進行顏色值測定，然后取平均值，結果如表1所示，相對標準偏差（RSD）均<3%。50批次金銀花的AL*均為正值，說明花蕾亮度比較大；其中，山東13個批次金銀花除山東007的AL*值僅為4.86外，其他的AL*值均在10.15～18.65范圍內；河南21批次金銀花的AL*值大多在10.00左右，僅河南01 1較低，為2.80;河北16批次的金銀花除河北003（4.94）、河北006（2.88）、河北010（5.59）外，AL*值均大于10.00。50批次的金銀花中絕大多數(shù)的Aa*、△b為負值，說明花蕾顏色偏綠、偏藍；僅河北010的Aa*、△b值為正，山東007的Ab*值為正，說明這兩批次金銀花均偏黃，河北010金銀花偏紅。

2.2不同批次金銀花花蕾形態(tài)指標的差異分析

由表2可見，50批次金銀花的花蕾上、中、下部直徑分別分布在2.12～3.70、0.96～1.62、0.66～1.03mm，均表現(xiàn)為上部直徑>中部直徑>下部直徑，其中山東010金銀花的花蕾上部直徑最大，河北001金銀花的花蕾中、下部直徑最大。50批次金銀花的花蕾長度均在17.65～31.40mm范圍內，大多25mm左右，其中，河南009批次的金銀花最長，河南001批次的金銀花最短。

2.3不同批次金銀花的有效成分含量測定及差異分析

2.3.1線性關系考察在1.2.3中的方法條件下，各成分分離度良好（圖1）。分別吸取不同體積的混合對照品溶液，用50%的甲醇稀釋至10mL，制成10個質量濃度梯度的系列溶液進行高效液相色譜（HPLC）測定，以對照品的質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸分析，結果（表3）顯示，四種有效成分均存在線性區(qū)間，R2值達到0.9997～0.9999，線性關系良好。

2.3.2方法學考察（1）精密度試驗：精密吸取混合對照品溶液，按照上述色譜條件分別進行日內精密度考察（1天內連續(xù)分析5次）和日間精密度考察（每3天分析一次）。結果顯示，兩種考察方法下，4種有效成分峰面積的RSD均<1.5%，表明儀器精密度良好。

（2）重復性試驗：取同一供試品各1.0g，平行制備6份供試品溶液，進行HPLC分析，結果顯示各成分峰面積RSD在0.38%～0.96%，表明方法重復性良好。

（3）穩(wěn)定性試驗：取金銀花供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進行HPLC分析，4種成分峰面積的RSD在0.86%～1.78%，表明供試品溶液在24h內穩(wěn)定性良好。

（4）加樣回收率試驗：精密稱取已知成分含量的金銀花供試品6份，分別加入一定量的對照品，進行HPLC分析，結果顯示，各成分平均加樣回收率為98.78%～103.66%，符合要求。

2.3.3有效成分含量測定由表4可見，河北001金銀花的綠原酸含量最高，為4.31%；有3批金銀花的綠原酸含量低于1.50%，其中河北010金銀花的最低，為0.58%。河北003金銀花的異綠原酸A和異綠原酸C含量最高，分別為2.12%和0.42%：河北010金銀花的異綠原酸A和異綠原酸C含量最低，分別為0.30%和0.05%。3種綠原酸類物質總量最高的是河北003金銀花，為6.49%：有18批次金銀花的3種綠原酸類物質總量低于3.80%，其中河北010的最低，為0.93%。

2.4金銀花外觀性狀與主要有效成分的相關性分析

如表5所示，AL*與綠原酸含量極顯著負相關，與木犀草苷含量極顯著正相關，與3種綠原酸物質總量顯著負相關；△a、Ab、花蕾上部直徑與異綠原酸A和C含量及3種綠原酸物質總量均呈極顯著負相關；花蕾中、下部直徑與木犀草苷含量呈極顯著正相關，與3種綠原酸物質總量顯著正相關：花蕾長度與木犀草苷含量和3種綠原酸物質總量極顯著負相關，與異綠原酸A顯著相關。

在相關性分析基礎上建立各有效成分含量與金銀花外觀性狀的線性回歸模型，并進行統(tǒng)計分析，結果見表6。以AL為自變量X，以綠原酸含量為因變量Y，建立回歸方程Y=10.481-0.536X，驗證其顯著性的F值和P值分別為6.820和0.009，達極顯著水平；以Aa*、△b、花蕾上部直徑、長度為自變量，以異綠原酸A含量為因變量，建立回歸方程Y=0.722-0.093Aa-0.007Ab-0.097X上部直徑+0.012X長度，其F值和P值分別為50.043和0.000，達極顯著水平；以Aa、Ab、花蕾上部直徑為自變量，以異綠原酸C含量為因變量，建立回歸方程Y=0.158-0.005Aa*-0．001△b-0.008X上部直徑，其F值和P值分別為17.286和0.000，達極顯著水平；以AL*、Aa*、Ab*及花蕾上、中、下部直徑為自變量，以3種綠原酸物質總量為因變量，建立回歸方程Y= 2.553-0.027AL-0.316Aa-0.024Ab-0.144X上部直徑+0.179X+0.40IX下部直徑，其F值和P值分別為54.445和0.000，達極顯著水平；以AL*、Aa*、中部直徑、下部直徑、花蕾長度為自變量，以木犀草苷含量為因變量，建立回歸方程Y=0.041+其F值和P值分別為36.189和0.000，達極顯著水平。

3討論與結論

目前對中藥材質量的評價方法多以主觀描述為主，因此外觀性狀是判斷藥材質量等級和預測活性成分含量的重要依據(jù)。如巴戟天、紅花和甘草等可以通過色澤、大小、直徑等外在指標判斷藥材品質和有效成分含量。本研究對50批次金銀花藥材“形”與“質”的關系進行了初步探索，結果發(fā)現(xiàn)，金銀花中綠原酸含量與AL*值具有顯著負相關性，亮度越大，綠原酸含量越低：異綠原酸A和C的含量及3種綠原酸物質總量均與Aa*、Ab*、花蕾上部直徑極顯著負相關，3種綠原酸物質總量還與AL*和花蕾長度顯著負相關，而與花蕾中、下部直徑顯著正相關，說明花蕾顏色偏綠、偏藍、上部直徑偏小的金銀花藥材含有較多異綠原酸A、異綠原酸C，3種綠原酸物質總量較高，這與王玲娜等的研究結果一致；木犀草苷含量與AL*和花蕾中、下部直徑呈極顯著正相關，而與Aa*和花蕾長度呈極顯著負相關，說明花蕾偏綠、偏亮、中下部直徑偏粗的金銀花藥材木犀草苷含量較高。上述結論使得借助信息化技術搭建金銀花人工智能鑒別平臺成為可能，從而實現(xiàn)短時間、低成本、高精度鑒定，為建立金銀花品質快速鑒別和評價體系奠定基礎，從而有效解決傳統(tǒng)中藥材鑒別人才流失和不足的問題。

在金銀花藥材形成過程中，色素積累是導致其色澤發(fā)生改變的主要原因。植物體內色素的積累和代謝受基因型、代謝途徑、氣候條件等多種因素的影響。今后可圍繞金銀花色素合成基因的克隆、表達模式、功能鑒定、調控網(wǎng)絡等方面展開研究，以從分子層面揭示金銀花外觀性狀與有效成分的相關性，為制定金銀花藥材質量標準奠定基礎。