TREM2單克隆抗體的制備及應(yīng)用檢測(cè)

馬賓 孟麟 戎卓娜 趙傳科 壽成超

（北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院，北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所，生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室，惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100142）

髓系細(xì)胞觸發(fā)受體2（triggering receptors expressed on myeloid cells 2，TREM2）是免疫抑制受體，屬于免疫球蛋白超家族。TREM2基因位于人類染色體6p21.1上，由5個(gè)外顯子組成，編碼TREM2蛋白，包含230個(gè)氨基酸［1］。研究表明，TREM2在部分髓系細(xì)胞膜上表達(dá)，主要包括樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、破骨細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等。其結(jié)構(gòu)由以下4個(gè)區(qū)域組成：信號(hào)肽序列、細(xì)胞外Ⅴ型免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域及一個(gè)短柄序列、單次跨膜結(jié)構(gòu)域、胞內(nèi)的短尾區(qū)［2］。除了膜結(jié)合形式外，TREM2還能以可溶性形式釋放［3-4］。

TREM2在多種生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，包括細(xì)胞成熟、細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活、吞噬和炎癥調(diào)節(jié)等［5］。這一系列不同的功能主要由TREM2和多種潛在的配體相互作用調(diào)節(jié)，這些配體包括大量的陰離子分子，如革蘭陽性和革蘭陰性細(xì)菌（淋球菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）、DNA、脂蛋白和磷脂等［6］。TREM2通過其跨膜結(jié)構(gòu)域中相反的電荷殘基與其適配器DAP12、DAP10結(jié)合。當(dāng)配體與膜上的TREM2結(jié)合后，這些共受體被磷酸化并招募下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，從而發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)［7］。

TREM2對(duì)于維持小膠質(zhì)細(xì)胞的代謝適應(yīng)性至關(guān)重要，因此以往對(duì)TREM2的研究主要集中在神經(jīng)退行性疾病中。如在阿爾茨海默病中，TREM2發(fā)生突變產(chǎn)生變異體，導(dǎo)致TREM2功能喪失，因而小膠質(zhì)細(xì)胞不能聚集在Aβ斑塊周圍。斑塊周圍的小膠質(zhì)細(xì)胞是形成物理屏障的必要條件，可以限制斑塊的擴(kuò)散，保護(hù)周圍的神經(jīng)元免受斑塊神經(jīng)毒性的影響［8］。近些年越來越多的研究開始關(guān)注TREM2在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和髓系源性抑制細(xì)胞中的作用。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，TREM2在肺癌患者和荷瘤小鼠的外周血單核細(xì)胞以及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞上表達(dá)顯著升高。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的TREM2水平與腫瘤進(jìn)展呈正相關(guān)［9］。MOLGORA等［10］2020年發(fā)表在Cell上的一篇文章證明，與野生型小鼠相比，TREM2基因缺陷型小鼠更能抵抗各種腫瘤的生長(zhǎng)，并且抗PD-1免疫療法對(duì)前者療效更好。此外，與單獨(dú)使用PD-1抗體治療相比，TREM2抗體與PD-1抗體聯(lián)合應(yīng)用可以更有效地抑制小鼠移植瘤生長(zhǎng)。因此TREM2抗體藥物有望與其他檢查點(diǎn)阻斷藥物聯(lián)合應(yīng)用，提高抗腫瘤免疫療法的療效。

1 材料與方法

1.1 材料 PUC-SP-TREM1、PUC-SP-TREM2質(zhì)粒由上海生工生物技術(shù)有限公司全基因合成。BL21大腸桿菌感受態(tài)以及原核表達(dá)載體pGEX-4T-1由生化室保存，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ、T4 DNA連接酶購于NEB公司。6～8周齡BALB/c小鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，小鼠SP2/0骨髓瘤細(xì)胞系由生化室保存，培養(yǎng)條件為RPMI1640+15%FBS。水溶性佐劑購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；TREM1真核表達(dá)蛋白（Cat#.HPLC-10511-H08H）購于義翹神州公司；TREM2真核表達(dá)蛋白（Cat#.TR2-H52H5）購于ACRO公司；TREM1抗體（Cat#.AF1278-SP）購于RD公司；TREM2抗體（Cat#.91068）購于CST公司；His tag抗體（Cat#.ab1187）購于Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 pGEX-4T1-TREM2重組質(zhì)粒構(gòu)建 選取人TREM2胞外段作為免疫原片段（編碼TREM2的第1～174位氨基酸序列）。該基因片段長(zhǎng)度為522 bp，通過PCR擴(kuò)增獲得。設(shè)計(jì)正向引物序列為：5'-CGGGATCCATGGAGCCTCTCCGGCTGCTC-3'，反向引物序列為：5'-CGGAATTCTCAGGAAGTGGGTGGGAAGGGGATTTCT-3'。引物由上海擎科生物科技有限公司合成。以PUC-SP-TREM2質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物及pGEX-4T-1質(zhì)粒分別經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，電泳、膠回收目的片段及載體片段，二者經(jīng)T4 DNA連接酶在4 ℃靜置連接過夜。次日將連接產(chǎn)物常規(guī)轉(zhuǎn)染大腸桿菌，37 ℃培養(yǎng)過夜，少量提取質(zhì)粒后進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.2 GST-TREM2融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化將測(cè)序結(jié)果正確的重組菌稀釋到200 ml LB培養(yǎng)基中，37 ℃、225 r/min培養(yǎng)至OD600nm為0.7左右，加入0.25 mmol/L IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。6 000 r/min離心10 min后棄上清，加入10 ml細(xì)菌裂解液，充分懸浮細(xì)菌沉淀。室溫靜置10 min后加入終濃度為1%TritonX-100，冰浴20 min后進(jìn)行超聲裂解；裂解液4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取沉淀。在細(xì)菌沉淀中加入10 ml 2%去氧膽酸鈉，冰上超聲50 s，室溫振搖30 min，10 000 g離心10 min，棄上清。沉淀中加入500 μl變性液，室溫變性3 h，液體變清亮后離心棄沉淀。上清液加入9倍體積的復(fù)性液，室溫復(fù)性1 h，4 ℃復(fù)性4 h。離心后取上清用25 mmol/L Tris-HCl透析過夜，期間換液3次，次日用蔗糖包埋濃縮；10%SDS-PAGE檢測(cè)其含量和純度。

1.2.3 動(dòng)物免疫 將純化的GST-TREM2融合蛋白與等體積的水溶性佐劑充分混合，小鼠雙側(cè)下肢注射融合蛋白，40 μg/只。初次免疫3周后用同樣的方法進(jìn)行第2次免疫，第2次免疫后14 d采尾靜脈血，ELISA測(cè)血清抗體效價(jià)。融合前4 d選擇抗體滴度高的小鼠進(jìn)行融合前加強(qiáng)免疫。

1.2.4 293T-TREM1、293T-TREM2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建 將委托公司合成的PUC-SP-TREM1、PUC-SPTREM2質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切位點(diǎn)為EcoRⅠ和BamHⅠ。將酶切回收的目的片段構(gòu)建到真核表達(dá)載體pLVx上，獲得pLVx-TREM1和pLVx-TREM2重組質(zhì)粒。分別用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后更換為含1 μg/ml嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，至上清中無死細(xì)胞后，收集細(xì)胞總蛋白進(jìn)行目的蛋白檢測(cè)。

1.2.5 細(xì)胞融合與篩選 取加強(qiáng)免疫小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤SP2/0細(xì)胞融合，融合后第8天左右，將293T、293T-TREM1及293T-TREM2細(xì)胞以2×104個(gè)/孔鋪96孔板，克隆孔培養(yǎng)上清作為一抗，進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞ELISA檢測(cè)，篩選出與293T-TREM2細(xì)胞反應(yīng)、與293T及293T-TREM1均不反應(yīng)的克隆孔，進(jìn)行3～5次亞克隆及篩選，直至獲得能穩(wěn)定分泌抗TREM2抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株。

1.2.6 單克隆抗體的制備與純化 BALB/c小鼠腹腔注射弗氏不完全佐劑，0.5 ml/只，次日腹腔注射雜交瘤細(xì)胞2×106個(gè)/只。約10 d后收取腹水，10 000 r/min離心5 min，取上清。用PBS等體積稀釋腹水上清，0.45 μm濾器過濾，Protein G凝膠柱進(jìn)行純化；純化抗體經(jīng)PBS充分透析后，用SDS-PAGE電泳鑒定抗體純度和含量。

1.2.7 ELISA 293T、293T-TREM1、293T-TREM2細(xì)胞鋪于96孔板（2×104個(gè)/孔），培養(yǎng)過夜，細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)，加入0.25%的戊二醛，室溫固定30 min，PBST洗4遍；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，PBST洗4遍。將稀釋的小鼠血清或單抗作為一抗，室溫反應(yīng)2 h，PBST洗4遍。HPR標(biāo)記的羊抗小鼠IgG作為二抗，室溫反應(yīng)1 h，PBST洗4遍。加入OPD，室溫避光顯色15 min。12.5%H2SO4終止反應(yīng)，檢測(cè)OD490nm讀數(shù)。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù) 消化細(xì)胞，PBS清洗2遍。每個(gè)體系取2×105個(gè)細(xì)胞，加2 μg/ml自制TREM2單抗室溫反應(yīng)45 min，PBS洗2遍，Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，室溫染色30 min，PBS洗2遍，100 μl PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.9 蛋白免疫印跡 用RIPA裂解液分別裂解293T、293T-TREM1、293T-TREM2細(xì)胞收集蛋白。每泳道上樣20 μg。SDS-PAGE后，300 mA轉(zhuǎn)膜50 min。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，分別用自制TREM2單抗（2 μg/ml） 4 ℃孵育過夜。次日洗滌后，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶2 000），室溫孵育50 min，ECL化學(xué)發(fā)光顯色。

1.2.10 免疫沉淀 各取2 μg自制TREM2單抗與20 μl Protein G加到1 ml PBST中，同時(shí)以2 μg小鼠IgG作為陰性對(duì)照，在搖床上室溫孵育1 h，PBST洗3遍，之后分別加入30 ng TREM1、TREM2真核蛋白和900 μl PBST，4 ℃結(jié)合過夜。次日PBST洗3次，棄上清，珠子中加入等體積的2×SDS裂解液，電泳90 min、300 mA轉(zhuǎn)膜50 min，牛奶封閉后用HRP標(biāo)記的His抗體進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.11 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 預(yù)先乙醇浸泡直徑1 cm的圓形細(xì)胞爬片，晾干后在24孔板里每孔放1個(gè)爬片。293T、293T-TREM1、293T-TREM2細(xì)胞消化重懸，以相同細(xì)胞數(shù)鋪在24孔板中。細(xì)胞貼壁24 h后，預(yù)冷PBS洗2遍，2 μg/ml自制TREM2單抗室溫反應(yīng)1 h，PBS洗3遍；Alexa Fluor 594標(biāo)記的羊抗鼠IgG室溫避光染色30 min，PBS洗3遍，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，90%甘油封片后用共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果

2.1 TREM2胞外段融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，超聲裂解后行SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)。結(jié)果可見重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后有目的蛋白表達(dá)，主要以包涵體的形式存在于細(xì)菌沉淀中（圖1A）。包涵體經(jīng)蛋白變復(fù)性純化后，進(jìn)行電泳鑒定，在約42 kD處可見目的蛋白條帶，但在35 kD上下位置也有較明顯的蛋白條帶，可能系目的蛋白降解所致（圖1B）。

圖1 融合蛋白表達(dá)、純化及TREM過表達(dá)細(xì)胞系鑒定Fig.1 Expression， purification of fusion proteins and identification of cell lines overexpressing TREM

2.2 TREM過表達(dá)細(xì)胞系鑒定 將PUC57-TREM1及PUC57-TREM2質(zhì)粒進(jìn)行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切獲得目的片段，然后將其插入真核表達(dá)載體pLVx中。酶切后電泳結(jié)果表明，質(zhì)粒釋放出的載體片段和目的蛋白表達(dá)片段大小與預(yù)期相符（圖1C、D）。質(zhì)粒進(jìn)行Sanger測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目的片段序列比對(duì)結(jié)果一致（測(cè)序結(jié)果未展示）。對(duì)經(jīng)pLVx-TREM1或pLVx-TREM2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并建株的293T-TREM1和293T-TREM2總蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)表明，TREM1和TREM2分別在293T-TREM1和293TTREM2細(xì)胞中成功表達(dá)（圖1E）。

2.3 小鼠免疫與TREM2單抗雜交瘤株的篩選 采用293T和293T-TREM2細(xì)胞，對(duì)上述融合蛋白GSTTREM2二次免疫后小鼠的抗血清效價(jià)進(jìn)行ELISA檢測(cè)。結(jié)果表明，在免疫的4只小鼠中，3只小鼠的抗血清與293T-TREM2細(xì)胞呈較強(qiáng)特異反應(yīng)。選取抗血清效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫及融合篩選。融合后細(xì)胞共接種16塊96孔培養(yǎng)板，融合率為100%。采用293T、293T-TREM1和293T-TREM2細(xì)胞對(duì)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，選取雜交瘤上清與293T-TREM2細(xì)胞反應(yīng)值是與293T、293T-TREM1細(xì)胞反應(yīng)讀值3倍以上的克隆作為初篩陽性克?。粚?duì)100個(gè)陽性克隆進(jìn)行亞克隆，3～5次亞克隆及篩選后，最終構(gòu)建了58個(gè)陽性克隆。用陽性克隆作為一抗進(jìn)行ELISA反應(yīng)，結(jié)果見圖2。

圖2 TREM2單抗雜交瘤細(xì)胞株篩選Fig.2 Screening of hybridoma cell lines of TREM2 monoclonal antibody

2.4 TREM2單抗的制備、純化 根據(jù)雜交瘤上清與293T-TREM2的結(jié)合特異性，挑選了29株雜交瘤細(xì)胞（TM1、TM2……TM29），制備小鼠腹水并用Protein G對(duì)腹水進(jìn)行純化，SDS-PAGE電泳檢測(cè)抗體純度。如圖3所示，所獲得的抗體在SDS-PAGE凝膠電泳中只分別在55 kD和25 kD左右可見重、輕鏈兩條條帶，無其他雜帶，抗體純度＞95%。

圖3 TREM2單克隆抗體的純化Fig.3 Purification of TREM2 monoclonal antibodies

2.5 ELISA檢測(cè)單克隆抗體特異性及親和力 在獲得純化抗體后，通過細(xì)胞ELISA對(duì)抗體的結(jié)合特異性進(jìn)行了進(jìn)一步檢測(cè)，結(jié)果表明，在29株純化抗體中，除5株抗體（TM6、TM8、TM10、TM22、TM26）與293T-TREM1和293T親本細(xì)胞有一定交叉反應(yīng)外，其余24株單抗均只與293T-TREM2細(xì)胞呈特異性結(jié)合反應(yīng)，與293T-TREM1和293T親本細(xì)胞不反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，用細(xì)胞ELISA檢測(cè)了抗體的親和力，結(jié)果可見（圖4）29株抗體與293T-TREM2細(xì)胞均具有較高的結(jié)合活性，且呈現(xiàn)劑量依賴性。除TM6、TM8、TM10和TM20外，其余抗體均呈現(xiàn)較明顯的S型結(jié)合曲線。所有抗體的EC50均為nmol，表明獲得的TREM2單抗親和力均較高（表1）。

表1 TREM2單克隆抗體的親和力Tab.1 Affinity of TREM2 monoclonal antibodies

圖4 ELISA檢測(cè)TREM2單克隆抗體的親和力Fig.4 Affinity of monoclonal antibodies reacted with TREM2 protein by ELISA

2.6 TREM2單克隆抗體在Western blot中的應(yīng)用檢測(cè) 為了解獲得的抗體是否可用于TREM2的Western blot檢測(cè)及其抗體特異性，分別用293T、293T-TREM1和293T-TREM2細(xì)胞總蛋白進(jìn)行電泳（上樣量均為20 μg）、轉(zhuǎn)膜后，用上述29株抗TREM2單克隆抗體作為一抗進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果顯示，29株抗體均在293T-TREM2細(xì)胞總蛋白中檢測(cè)到特異性的TREM2條帶，而與293T、293T-TREM1細(xì)胞總蛋白無結(jié)合條帶（圖5），說明獲得的TREM2單抗具有較好的TREM2結(jié)合特異性，且均能用于Western blot檢測(cè)。

圖5 TREM2單克隆抗體Western blot應(yīng)用Fig.5 Western blot application of TREM2 monoclonal antibodies

2.7 TREM2單克隆抗體在免疫沉淀中的應(yīng)用檢測(cè) 為了明確自制單抗能否用于IP及抗體特異性檢測(cè)，用29株TREM2單抗分別與真核表達(dá)蛋白His-TREM1和His-TREM2進(jìn)行免疫沉淀，用抗His抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)。如圖6所示，所有單抗均與TREM2呈特異性反應(yīng)，與TREM1蛋白不反應(yīng)；單抗TM4、TM5、TM7、TM14、TM15、TM16、TM17、TM19的陽性信號(hào)較弱，表明其與TREM2結(jié)合能力較弱，其余單克隆抗體表現(xiàn)出較強(qiáng)的結(jié)合能力。

圖6 TREM2單克隆抗體免疫沉淀應(yīng)用Fig.6 Immunoprecipitation application of TREM2 monoclonal antibodies

2.8 TREM2單克隆抗體在流式細(xì)胞術(shù)中的應(yīng)用檢測(cè) 采用純化抗體對(duì)293T、293T-TREM1和293TTREM2細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)表明，29株抗體均與TREM2呈特異性反應(yīng)，而與293T和293T-TREM1細(xì)胞基本不反應(yīng)。根據(jù)MFI的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可見，除TM1、TM11和TM13的MFI值相對(duì)較低外，其余抗體的MFI值較高，說明TREM2單抗與TREM2有較強(qiáng)結(jié)合（圖7）。

圖7 流式檢測(cè)鑒定TREM2單抗特異性的MFI統(tǒng)計(jì)圖Fig.7 Flow cytometry was used to identify specific MFI of TREM2 monoclonal antibody

2.9 TREM2單克隆抗體在細(xì)胞免疫熒光中的應(yīng)用檢測(cè) 根據(jù)以上檢測(cè)結(jié)果，選擇TM5、TM7、TM12、TM14、TM20、TM25共6株抗體進(jìn)行免疫熒光應(yīng)用檢測(cè)。結(jié)果如圖8所示，受測(cè)的六株抗體均能與293TTREM2細(xì)胞特異性結(jié)合且呈膜定位，而與293T和293T-TREM1細(xì)胞均不反應(yīng)，說明該6株抗體均可用于TREM2的特異性免疫熒光檢測(cè)。

圖8 TREM2單克隆抗體的免疫熒光應(yīng)用Fig.8 Immunofluorescence application of TREM2 monoclonal antibodies

3 討論

單克隆抗體制備技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的重要手段之一，隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，單克隆抗體制備技術(shù)也不斷發(fā)展完善，傳統(tǒng)的小鼠雜交瘤抗體制備技術(shù)因其技術(shù)成熟、操作相對(duì)簡(jiǎn)單及條件要求較低等優(yōu)勢(shì)，仍然是目前獲得單克隆抗體的常用方法［11-12］。隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，鼠源抗體的人源化改造技術(shù)也已經(jīng)非常成熟。先制備鼠源抗體，再通過基因重組獲得人源化抗體，依然是目前抗體藥物研發(fā)的常用技術(shù)途徑［13］。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage，TAM）是腫瘤微環(huán)境中的主要免疫細(xì)胞。近年研究表明，表達(dá)于TAM的TREM2作為免疫抑制性受體，在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮了重要作用，是腫瘤免疫治療的又一潛在重要靶點(diǎn)［10，14-15］。為制備獲得TREM2特異性單克隆抗體，為后續(xù)抗體藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)，本課題組設(shè)計(jì)了蛋白和質(zhì)粒DNA，作為免疫小鼠的不同策略。但在用質(zhì)粒作為抗原免疫的小鼠中，通過對(duì)血清效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)，未檢測(cè)到小鼠產(chǎn)生的抗TREM2抗體，其原因可能是經(jīng)尾靜脈注射的DNA未能在小鼠體內(nèi)有效表達(dá)導(dǎo)致不能激發(fā)小鼠對(duì)TREM2的免疫反應(yīng)。在制備抗原蛋白GST-TREM2時(shí)，因其表達(dá)在大腸桿菌的包涵體中，通過蛋白變復(fù)性純化，雖然獲得的GST-TREM2蛋白純度不高（其中包括融合蛋白的降解產(chǎn)物），但用293T-TREM2細(xì)胞對(duì)抗血清效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)表明，小鼠對(duì)TREM2產(chǎn)生了有效的免疫反應(yīng)。在融合后的首輪篩選中，先用293T和293T-TREM2細(xì)胞進(jìn)行初篩，選取只與293T-TREM2細(xì)胞反應(yīng)的進(jìn)行克隆，用293T-TREM1和293T-TREM2細(xì)胞進(jìn)行復(fù)篩，對(duì)仍與293T-TREM2細(xì)胞呈特異反應(yīng)的克隆，通過后續(xù)的多輪亞克隆篩選，最終建立了58個(gè)陽性克隆株。選取其中29株進(jìn)行抗體制備及細(xì)胞ELISA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中的24株可與TREM2特異性結(jié)合；通過ELISA對(duì)抗體親和力的初步檢測(cè)表明，所獲抗體的親和力都在nmol以上，表明抗體與抗原有較強(qiáng)結(jié)合力。為了解所獲抗體在不同免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用及對(duì)抗體特異性進(jìn)一步驗(yàn)證，對(duì)抗體進(jìn)行了Western blot、免疫沉淀、流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光等檢測(cè)，結(jié)果表明不論TREM2蛋白是否變性，它們均能與TREM2特異反應(yīng)，可用于不同免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)表明抗體結(jié)合的表位為TREM2的一級(jí)肽鏈序列，而非蛋白的空間結(jié)構(gòu)。

綜上，本研究獲得了多株TREM2特異性單克隆抗體，它們有較強(qiáng)的結(jié)合活性，并可用于不同免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。在后續(xù)研究中，本課題組將評(píng)估所獲抗體對(duì)髓系細(xì)胞尤其是巨噬細(xì)胞極化和免疫功能的激活作用，并進(jìn)一步探索其發(fā)揮作用的分子機(jī)制，為TREM2抗體藥物的研發(fā)提供依據(jù)。