編碼IL-7的溶瘤皰疹病毒通過激活CD8+T細胞增強對肝癌的殺傷活性

黎東明 李鵬 陸路 王學(xué)國 王太成 趙紅巖

（海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院肝膽胰腺外科，海口 570100）

肝癌是惡性腫瘤之一，病死率在所有癌癥中排名第二，具有高轉(zhuǎn)移和高復(fù)發(fā)的特點［1-3］。雖然肝癌可以通過手術(shù)、藥物或化療進行干預(yù)，但患者的預(yù)后并不好，有數(shù)據(jù)表明，美國的肝癌五年生存率僅為18%，而中國的原發(fā)性肝癌患者五年生存率僅為12.1%［4-5］。因此，研發(fā)新的肝癌治療手段十分必要。

溶瘤病毒是一種天然的或通過基因工程改造的病毒，可以選擇性地感染腫瘤細胞并在其中大量復(fù)制，導(dǎo)致腫瘤細胞裂解，對正常細胞無明顯毒性，是一種有前景的癌癥治療手段［6-7］。美國批準(zhǔn)的第一款溶瘤病毒產(chǎn)品為Talimogene laherparepvec（TVEC），是一種工程化的單純皰疹病毒（herpes sim-plex virus，HSV），編碼粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）［8］。IL-7是維持T細胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵分子，可以使初始T細胞狀態(tài)得以維持，并且可以促進中央記憶T細胞亞群的生成，而分化程度低的T細胞以及中央記憶T細胞的形成有利于T細胞發(fā)揮抗腫瘤免疫反應(yīng)。此外，IL-7還通過增加腫瘤反應(yīng)性T細胞的數(shù)量和拮抗轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路，促進腫瘤內(nèi)抗腫瘤免疫狀態(tài)的重建［9］。

本研究為了最大化IL-7的局部有效劑量并獲得協(xié)同治療效果，試圖構(gòu)建一種新型的工程化溶瘤病毒，其以HSV為主體結(jié)構(gòu)，同時編碼IL-7，從而檢測這種工程化溶瘤病毒是否可以發(fā)揮對肝癌的協(xié)同抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠及細胞系 15只5周齡BALB/c小鼠購自海南藥物研究所有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于海南醫(yī)學(xué)院實驗動物中心的SPF動物房，所有小鼠自由進食飲水。本實驗經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會審批（20210625169）。小鼠黑色素瘤細胞系B16-F10、結(jié)直腸癌細胞系CT-26以及肝癌細胞系H22購自中科院上海細胞庫，所有細胞在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)于添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。

1.1.2 主要試劑 膠原酶Ⅰ、RIPA試劑、PMSF、結(jié)晶紫溶液、BCA蛋白定量試劑盒以及ECL發(fā)光液購自上海碧云天生物科技有限公司；4%多聚甲醛、蘇木精以及DAB試劑購自上海翌圣生物科技有限公司；小鼠抗IL-7及小鼠抗CD8抗體購自美國Abcam公司；小鼠IL-7 ELISA試劑盒、小鼠抗GAPDH以及山羊抗鼠二抗購自杭州聯(lián)合生物科技有限公司；PE標(biāo)記的鼠抗CD8抗體及APC標(biāo)記的鼠抗Granzyme B抗體購自美國Biolegend公司；Fix/Perm溶液及Perm/Wash 溶液購自美國BD Biosciences。

1.2 方法

1.2.1 溶瘤病毒HSV-IL-7的構(gòu)建 HSV基因源于HG52毒株，通過特異性消除HG52基因組中ICP34.5以及ICP47得到HSV的基因組序列。HSVIL-7由HSV衍生而來。將包含CMV啟動子的IL-7基因序列插入ICP34.5的基因座位點，獲得HSV-IL-7的基因組序列。將HSV或HSV-IL-7病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細胞，在顯微鏡下檢測6輪空斑篩選純化，得到HSV或HSV-IL-7病毒顆粒。再將獲得的病毒顆粒繼續(xù)感染Vero細胞，在其中擴增，滴定，分成等份后在-80 ℃冰箱中保存?zhèn)涫褂谩?/p>

1.2.2 Western blot檢測溶瘤病毒感染后IL-7表達 分別取3×105個B16-F10、CT-26以及H22細胞置于6孔板中，待密度達到70%時以MOI=5加入HSV或HSV-IL-7，18 h后使用RIPA裂解細胞，12 000 g離心20 min后收集上清，按照試劑盒說明進行BCA蛋白定量，之后使用12%SDS-PAGE進行電泳，轉(zhuǎn)膜，使用5%脫脂奶粉，室溫2 h的封閉，使用小鼠抗IL-7（1∶1 000）及小鼠抗GAPDH抗體（1∶1 000）對PVDF膜進行4 ℃過夜孵育，次日使用山羊抗鼠的二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，使用ECL發(fā)光液后在成像儀中對蛋白條帶進行顯影。

1.2.3 結(jié)晶紫染色法檢測溶瘤病毒對腫瘤細胞的裂解作用 分別取1×104個B16-F10、CT-26以及H22細胞置于96孔板中，待密度達到70%時以對應(yīng)的MOI加入HSV或HSV-IL-7，72 h后除去培養(yǎng)基，每孔中加入50 μl結(jié)晶紫溶液，孵育5 min。孵育結(jié)束后使用雙蒸水對孔板清洗5次，使用掃描儀對孔板進行成像。

1.2.4 小鼠移植瘤模型驗證HSV-IL-7的腫瘤抑制活性 15只5周齡BALB/c小鼠背部皮下注射3×105個H22腫瘤細胞，待腫瘤長至100 mm3時，將小鼠隨機分為3組，分別在瘤內(nèi)注射PBS，3×106PFUs HSV以及3×106PFUs HSV-IL-7進行治療。3 d后重復(fù)給藥1次。治療之后每2 d測量1次腫瘤體積和體重，腫瘤體積計算公式：體積=長×寬2/2。此外，密切監(jiān)測小鼠存活情況，并繪制生存曲線。

1.2.5 ELISA檢測血清及腫瘤組織中IL-7、IFN-γ及TNF-α含量 在小鼠治療后的第7天，通過眼眶采血獲得100 μl抗凝血，靜置離心后獲得血清，按照制造商的方案使用小鼠IL-7 ELISA檢測試劑盒檢測血清中IL-7含量。此外，在小鼠死亡后，取腫瘤組織50 mg，加入200 μl PBS進行勻漿，離心后取上清，按照制造商的方案使用小鼠IL-7、IFN-γ及TNF-α ELISA檢測試劑盒檢測腫瘤組織中IL-7、IFN-γ及TNF-α含量。

1.2.6 免疫組化法檢測腫瘤組織中CD8+T細胞的浸潤情況 在小鼠死亡后，取腫瘤組織100 mg，使用4%多聚甲醛進行固定，之后經(jīng)過脫水、包埋、切片，制成組織切片。組織切片經(jīng)過抗原修復(fù)后，用5%山羊血清室溫封閉2 h，之后滴加50 μl抗CD8抗體（1∶100），4 ℃孵育過夜，次日使用山羊抗鼠二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，滴加DAB溶液顯色，蘇木精溶液復(fù)染后進行封片，顯微鏡下觀察并拍照。陽性細胞數(shù)目使用Image Pro Plus 6.0進行計數(shù)。

1.2.7 流式細胞術(shù)檢測腫瘤浸潤CD8+T細胞Granzyme B的分泌水平 在小鼠死亡后，取腫瘤組織50 mg，切成直徑為1～2 mm的碎片后，使用膠原酶在37 ℃下消化1 h，使用100 μm細胞篩進行過濾后，離心收集細胞，加入5 μl PE標(biāo)記的鼠抗CD8抗體室溫避光孵育20 min，使用PBS清洗3次后加入Fix/Perm溶液以及5 μl APC標(biāo)記的鼠抗Granzyme B抗體，室溫避光孵育20 min后，使用perm/wash buffer清洗3次后，在流式細胞儀上進行檢測，數(shù)據(jù)使用Flowjo V10進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量數(shù)據(jù)采用表示，組間樣本比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSV-IL-7感染腫瘤細胞后表達IL-7 HSV以及HSV-IL-7結(jié)構(gòu)如圖1A。將HSV、HSV-IL-7分別感染不同的腫瘤細胞后，Western blot檢測結(jié)果顯示，HSV感染的腫瘤細胞中無IL-7表達，相反，HSVIL-7感染的腫瘤細胞顯著高表達IL-7（圖1B）。

圖1 HSV和HSV-IL-7的特征Fig.1 Characteristic of HSV and HSV-IL-7

2.2 HSV及HSV-IL-7對腫瘤細胞的體外裂解情況 在不同的腫瘤細胞感染HSV及HSV-IL-7后，結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，HSV及HSV-IL-7均能對不同的腫瘤細胞產(chǎn)生裂解效應(yīng)，且裂解能力隨著MOI的增大而逐漸增強。MOI＞5時，HSV及HSV-IL-7幾乎可以裂解絕大多數(shù)的腫瘤細胞（圖2）。

圖2 結(jié)晶紫染色檢測HSV和HSV-IL-7在不同腫瘤細胞中的溶瘤情況Fig.2 Oncolysis of HSV and HSV-IL-7 in different tumor cells were detected by crystal violet staining

2.3 HSV-IL-7抑制肝癌細胞H22的體內(nèi)生長 在小鼠的皮下移植瘤模型中檢測HSV-IL-7對腫瘤的抑制情況，腫瘤體積結(jié)果顯示，盡管HSV治療組有腫瘤抑制的趨勢，但與PBS組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而HSV-IL-7治療組的腫瘤生長被顯著抑制（P＜0.01，圖3A）。小鼠的生存期結(jié)果顯示，HSV治療組與PBS組相比小鼠的存活時間被延長，而HSV-IL-7治療組與HSV治療組相比生存期進一步延長（P＜0.01，圖3B）。此外，三組小鼠的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖3C）。

圖3 HSV和HSV-IL-7的體內(nèi)抗腫瘤活性Fig.3 Anti-tumor activity of HSV and HSV-IL-7 in vivo

2.4 HSV-IL-7增強體內(nèi)IL-7的分泌水平以及CD8+T細胞的浸潤能力 血清ELISA結(jié)果顯示，HSV與HSV-IL-7治療組的小鼠血清IL-7含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），HSV-IL-7治療組與PBS組比較，血清IL-7含量有一定升高（P＜0.05，圖4A）。同時，瘤內(nèi)ELISA結(jié)果表明，HSV-IL-7治療組瘤內(nèi)IL-7含量顯著高于PBS組和HSV治療組（P＜0.000 1，圖4B）。免疫組化結(jié)果表明，HSV-IL-7治療組的腫瘤浸潤CD8+T細胞的數(shù)目顯著高于PBS組（P＜0.001）和HSV治療組（P＜0.05，圖4C）。

圖4 IL-7含量及CD8+T細胞檢測Fig.4 IL-7 content and CD8+T cells detection

2.5 HSV-IL-7增強腫瘤浸潤CD8+T細胞Granzyme B表達以及效應(yīng)細胞因子含量 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，HSV治療后分泌Granzyme B的CD8+T細胞數(shù)目升高，與此同時，HSV-IL-7治療組分泌Granzyme B的CD8+T細胞數(shù)目較HSV治療組進一步增加（P＜0.01，圖5A、B）。此外，腫瘤組織中效應(yīng)細胞因子IFN-γ及TNF-α表達在HSV和HSV-IL-7治療后均升高，而HSV-IL-7治療組的IFN-γ及TNF-α表達較HSV治療組更高（P＜0.000 1，圖5C、D）。

圖5 Granzyme B在腫瘤浸潤CD8+T細胞中表達及腫瘤組織中細胞因子的含量Fig.5 Granzyme B expression in tumor infiltration CD8+T cells and cytokines in tumor tissues

3 討論

癌癥免疫療法已在腫瘤治療中占據(jù)越來越重要的地位［10］。“熱”腫瘤對免疫療法更敏感［11］。然而，大多數(shù)實體瘤被鑒定為“冷”腫瘤［12］。因此，提高腫瘤微環(huán)境中T細胞浸潤是提高癌癥免疫治療療效的關(guān)鍵舉措。溶瘤病毒可以像傳統(tǒng)的癌癥治療方法一樣直接殺死腫瘤細胞［13］。其作用機制為病毒特異性感染腫瘤細胞，經(jīng)過大量復(fù)制后裂解腫瘤細胞［14］。本研究選擇經(jīng)過改造的HSV作為溶瘤病毒，在體外證明了這種溶瘤病毒可以對多種腫瘤細胞產(chǎn)生劑量依賴的裂解作用［15］。

溶瘤病毒對腫瘤細胞殺傷后進一步提供了腫瘤相關(guān)抗原并刺激炎癥因子釋放，以觸發(fā)先天和適應(yīng)性抗腫瘤免疫［16］。這種抗腫瘤免疫反應(yīng)導(dǎo)致包括T淋巴細胞在內(nèi)的多種免疫細胞向腫瘤微環(huán)境浸潤［17］。除了溶瘤病毒本身的抗腫瘤活性外，當(dāng)這些病毒攜帶了細胞因子、趨化因子和共刺激分子等基因以增強抗腫瘤免疫時，可以發(fā)揮超出其溶瘤性質(zhì)的抗腫瘤反應(yīng)［18-19］。

IL-7在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。IL-7通過IL-7R信號通路在T細胞存活、活化、增殖以及記憶T細胞形成中發(fā)揮重要作用［20-21］。此外還有研究表明，IL-7可以顯著增加腫瘤浸潤的CD8+T細胞，增強CD8+T細胞的抗腫瘤作用，逆轉(zhuǎn)腫瘤組織中的免疫抑制作用［22］。在本研究中，經(jīng)過HSV-IL-7治療的小鼠腫瘤中浸潤的CD8+T細胞數(shù)量顯著增多，同時CD8+T細胞分泌Granzyme B的能力也顯著增強，表明其效應(yīng)功能較強，與先前研究中IL-7對T細胞的影響基本吻合。

在本研究中，盡管HSV以及HSV-IL-7在體外均具有良好的溶瘤活性，但在小鼠移植瘤模型中，雖然HSV治療組較PBS組小鼠在生存期方面有顯著延長，但HSV對腫瘤的抑制能力不明顯。究其原因，可能是由于HSV的腫瘤靶向性較弱，導(dǎo)致富集在腫瘤區(qū)域的病毒量較少，造成輕微的炎癥反應(yīng)。相反，表達IL-7的溶瘤病毒除了本身具備的溶瘤效應(yīng)之外，其分泌的IL-7具有全局效應(yīng)，激活了機體自身的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而顯著抑制腫瘤生長，并進一步延長小鼠的生存期。

在任何基于細胞因子的免疫治療中，與細胞因子釋放綜合征相關(guān)的毒性都應(yīng)嚴(yán)格控制［23-25］。本研究中使用的HSV-IL-7溶瘤病毒的細胞因子分泌水平受多重因素的影響，如病毒在細胞中的復(fù)制效率，感染的靶細胞種類等。本研究通過監(jiān)測小鼠的體質(zhì)量變化，發(fā)現(xiàn)HSV-IL-7與其他治療組無顯著差異，一定程度說明這種療法未產(chǎn)生嚴(yán)重的細胞因子釋放毒性。后續(xù)的研究有必要進一步對IL-7的分泌水平進行深入探究。除此以外，HSV-IL-7在理論上可以將IL-7的釋放限制在腫瘤部位，研究也表明，HSV-IL-7治療組的腫瘤組織中IL-7含量顯著高于其他組別，而外周血中IL-7水平則輕微升高。這也避免了系統(tǒng)性的細胞因子分泌造成的全身毒性［26］。

綜上所述，HSV-IL-7在體內(nèi)外均具有良好的腫瘤抑制活性，同時其可以通過分泌IL-7激活體內(nèi)CD8+T細胞的抗腫瘤性，從而進一步抑制腫瘤生長并延長荷瘤小鼠的生存期。本研究為進一步開展HSV-IL-7治療肝癌的臨床研究奠定了堅實基礎(chǔ)。