長鏈非編碼RNA ZIM2-AS1在肝細胞癌中的表達及其臨床意義

孫晉 李英楠 石夢姣 田紅衛 慕艷華 李君 李宗芳

（西安交通大學第二附屬醫院生物診斷治療國家地方聯合工程研究中心，西安 710004）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）作為肝臟最常見的原發性惡性腫瘤，是世界范圍內第六大癌癥，也是癌癥相關死亡的第三大原因，其發病率在全球范圍內持續升高［1］。對于早期HCC患者，手術切除、肝移植和射頻消融術是最有效的臨床治療方法，但由于HCC起病隱匿、進展迅速、早期診斷困難，大多數HCC患者首次確診即已進入中晚期，治療手段有限，預后差且極易復發［2］。目前，盡管以分子靶向藥物（如索拉非尼、侖伐替尼）和免疫檢查點抑制劑（如阿替利珠單抗、信迪利單抗）為主的系統性治療在中晚期HCC的治療中取得了一定效果，但因HCC異質性強、易耐藥、腫瘤免疫微環境特殊，導致總體治療效果并不理想［3］。因此，急需開發有效的HCC早期診斷、預后判斷生物標志物以及分子和免疫治療靶點。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lnc-RNA）是一類長度超過200個核苷酸，缺乏蛋白質編碼能力的RNA分子。大多數lncRNA由RNA聚合酶Ⅱ轉錄，其結構與mRNA相似，具有5'-帽子和3'-多聚腺苷酸（polyA）尾巴［4］。LncRNA可通過順式（cis）和反式作用（trans）方式在表觀遺傳、轉錄和轉錄后水平調控基因表達，進而參與各種生物學過程，與生物個體發育和疾病的發生發展密切相關［5］。大量研究已證實lncRNA是腫瘤發生和發展的關鍵調控分子。目前已有一大批lncRNAs被鑒定出在HCC中異常表達，其可通過影響細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲、血管生成、耐藥及腫瘤微環境免疫細胞功能進而參與腫瘤發生發展，且具有作為HCC早期診斷和預后判斷生物標志物的潛力［6-7］。

ZIM2-AS1（ZIM2 antisense RNA 1）是一條轉錄于人類染色體19q13.43區域的lncRNA，長度為2 092 bp。到目前為止，ZIM2-AS1在腫瘤中的相關研究仍比較匱乏。最近的一項研究發現ZIM2-AS1作為自噬相關lncRNA與食管鱗狀細胞癌患者的總生存期呈正相關，是影響預后的保護因素，提示ZIM2-AS1可能參與腫瘤發生發展［8］。而ZIM2-AS1在HCC中的表達是否異常以及與HCC進展具有怎樣的關系尚不清楚。因此，本研究擬基于TCGA數據通過生物信息學手段探討ZIM2-AS1在HCC組織中的表達情況及其臨床意義，以期為ZIM2-AS1用于HCC早期診斷、預后判斷等基礎及臨床轉化研究提供依據。

1 資料與方法

1.1 數據的獲取及處理 自TCGA數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載374例HCC組織樣本和50例癌旁組織樣本的RNA-seq數據和臨床資料數據。RNA-seq數據通過edge R軟件包進行過濾和標準化處理獲得TPM（Transcripts per Million mapped reads）數據，經log2轉換后用于后續分析。

1.2 ZIM2-AS1在HCC組織中的表達及其與臨床特征的相關性分析 采用EdgeR軟件包分別分析374例HCC組織和50例癌旁組織，以及50例配對HCC和癌旁組織中ZIM2-AS1的表達情況；按照表達量的中位數分為高表達組和低表達組，采用Logistic回歸模型分析ZIM2-AS1表達與性別、年齡、T/N/M分期、病理分期、腫瘤狀態、血清AFP水平、Child-Pugh分級、血管浸潤、肝纖維化Ishak評分等臨床特征的相關性。

1.3 ZIM2-AS1與HCC患者預后相關性分析 基于TCGA下載的HCC RNA-seq數據和臨床隨訪數據，利用R語言survminer程序包確定最佳cut-off值并據此將患者分為高表達組和低表達組，進一步采用Kaplan-Meier法對總生存期（overall survival，OS）和疾病相關生存期（disease specific survival，DSS）進行分析；運用Cox比例風險回歸模型分析影響預后的危險因素，其中單因素分析結果P值＜0.1的臨床指標進一步納入多因素分析；并根據影響預后的危險因素采用R語言rms程序包進一步構建Nomogram預測模型用于預測HCC患者1年、3年和5年總體生存概率。

1.4 ZIM2-AS1與HCC免疫細胞浸潤相關性分析利用R語言GSVA程序包基于ssGSEA算法分析基因表達水平與免疫細胞浸潤程度的相關性，并進行Spearman相關性檢驗。

1.5 ZIM2-AS1對HCC的診斷價值分析 利用R語言pROC程序包制作受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，通過曲線下面積（area under the curve，AUC）評價指標診斷效能。

1.6 通過qRT-PCR檢測ZIM2-AS1在人正常肝細胞和HCC細胞系中的表達情況 人正常肝細胞系L-O2以及5種HCC細胞系（Bel-7402、Bel-7404、HepG2、Hep3B和Huh7）均采用DMEM培養液（含10%胎牛血清）于恒溫培養箱（37 ℃和5%CO2）中培養。采用Trizol法提取細胞總RNA并使用Vazyme公司的HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 進行反轉錄；利用TaKaRa公司的TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ試劑對ZIM2-AS1的表達水平進行檢測，并通過β-actin作為內參基因進行相對定量分析。ZIM2-AS1引物為F：5'-ACCATGCAGCCATAAAAAGG-3'，R：5'-CCACCATGTGTCCATGTGTT-3'；β-actin引物為F：5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，R：5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。

1.7 統計學處理 采用SPSS20軟件進行統計分析，結果以表示。采用獨立樣本t檢驗評估ZIM2-AS1在非配對HCC組織和細胞系中的表達差異；采用配對樣本t檢驗評估ZIM2-AS1在配對HCC組織中的表達差異；采用log-Rank檢驗評估生存差異；通過Cox比例風險回歸模型分析評估預后的危險因素。P＜0.05被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 ZIM2-AS1在HCC組織和癌旁組織中的表達情況 通過比較374例HCC組織和50例癌旁組織中ZIM2-AS1的表達水平，發現ZIM2-AS1在HCC組織中的表達水平顯著高于癌旁組織（P＜0.01，圖1A）；進一步比較50例配對HCC組織的表達水平，結果顯示ZIM2-AS1在腫瘤組織中的表達水平同樣高于癌旁組織（P＜0.01，圖1B）。以上結果提示，lncRNA ZIM2-AS1在HCC組織中表達上調。

圖1 基于TCGA數據分析ZIM2-AS1在HCC組織中的表達情況Fig.1 Expression status of ZIM2-AS1 in HCC tissues based on TCGA data

2.2 ZIM2-AS1表達與HCC患者臨床特征相關性分析 通過構建單因素Logistics回歸模型分析HCC患者ZIM2-AS1表達水平與臨床病理參數的相關性，結果如表1所示，高表達ZIM2-AS1與年齡（OR=0.351，P=0.004）、性別（OR=0.543，P=0.037）、N分期（OR=4.552，P=0.008）、組織學分級（OR=2.027，P=0.019）和血清AFP水平（OR=21.569，P＜0.001）顯著相關，而與病理分期、荷瘤狀態、T分期、M分期、Child-Pugh分級、血管浸潤、殘瘤、肝旁組織炎癥和Ishak纖維化評分無顯著相關性。

表1 ZIM2-AS1表達水平與HCC患者臨床病理指標的關系（Logistic回歸）Tab.1 Logistic analysis of association between ZIM2-AS1 expression and clinical characteristics

2.3 ZIM2-AS1表達與HCC患者預后相關性分析 為明確ZIM2-AS1表達與HCC患者預后的相關性，根據ZIM2-AS1的表達量，按最佳cut-off值將患者分為高表達組和低表達組，采用Kaplan-Meier法對OS和DSS進行分析，結果顯示ZIM2-AS1高表達患者的OS和DSS均顯著低于低表達患者（P均＜0.05，圖2），提示ZIM2-AS1高表達在HCC中是一項不良預后因素。

圖2 ZIM2-AS1表達與HCC患者預后的關系Fig.2 Relationship between ZIM2-AS1 expression and prognosis of HCC patients

單因素Cox回歸分析結果提示，ZIM2-AS1表達水平（HR=1.446，P=0.037）、T分期（HR=2.598，P＜0.001）、M分期（HR=4.077，P=0.017）、病理分期（HR=2.504，P＜0.001）及荷瘤狀態（HR=2.317，P＜0.001）與HCC患者OS具有顯著相關性；進一步多因素Cox回歸分析顯示，ZIM2-AS1高表達水平（HR=1.866，P=0.007）和荷瘤狀態（HR=2.076，P=0.002）是影響HCC患者OS的獨立危險因素（表2）。

表2 影響HCC患者OS的單因素和多因素Cox分析Tab.2 Univariate and multivariate Cox analysis of OS in HCC patients

此外，綜合ZIM2-AS1表達水平、T分期、M分期、病理分期以及荷瘤狀態等影響預后的危險因素進一步構建了Nomogram預測模型，用于預測HCC患者1年、3年和5年總生存率（圖3），從圖中可以看出，ZIM2-AS1表達水平對預測HCC患者總生存概率貢獻較大。

圖3 預測HCC患者1年、3年和5年總生存率的Nomogram模型Fig.3 Nomogram for predicting probability of 1-，3- and 5-year OS for HCC patients

2.4 ZIM2-AS1表達與HCC免疫細胞浸潤的關系通過對HCC組織ZIM2-AS1表達與19種免疫細胞浸潤的相關性分析發現，ZIM2-AS1表達與HCC腫瘤微環境中5種免疫細胞的浸潤水平存在顯著相關性（|Spearman'sr|＞0.1，P＜0.05），其中與Th2細胞、濾泡輔助性T細胞（Tfh）和CD56brightNK細胞浸潤呈正相關，而與中性粒細胞和漿細胞樣樹突狀細胞（pDC）浸潤呈負相關（圖4）。

2.5 ZIM2-AS1對HCC的診斷價值分析 ROC曲線結果如圖5A～C所示，ZIM2-AS1表達水平對于評估HCC（AUC=0.659）、N0期（AUC=0.662）、組織學分級G1&G2期（AUC=0.644）均具有一定的診斷價值（AUC均＞0.50）。此外，如圖4D、E顯示，ZIM2-AS1表達水平對于評估1年、3年及5年OS（AUC分別為0.607、0.570和0.600）和DSS（AUC分別為0.621、0.560和0.564）同樣具有診斷價值（AUC均＞0.50）。

2.6 ZIM2-AS1在人正常肝細胞和HCC細胞系中的表達情況 利用qRT-PCR檢測ZIM2-AS1在人正常肝細胞L-O2和5種HCC細胞系中的表達情況，結果如圖6所示，ZIM2-AS1在被檢測的5種HCC細胞系（Bel-7402、Bel-7404、HepG2、Hep3B和Huh7）中的表達水平均顯著高于人正常肝細胞系L-O2（P均＜0.05）。

圖6 ZIM2-AS1在人正常肝細胞系和HCC細胞系中的表達情況Fig.6 Expression of ZIM2-AS1 in human normal liver cells and HCC cell lines

3 討論

HCC作為常見的惡性腫瘤之一，其致病因素較多且發病機制復雜，涉及多階段、多步驟的生物學過程及錯綜復雜的分子調控網絡［9］。越來越多的研究表明，lncRNA作為重要調控分子可與DNA、各類RNA（如mRNA和miRNA）以及蛋白發生互作，通過構成復雜的調控網絡參與腫瘤發生發展，已成為腫瘤生物標志物和治療靶點研發的重要分子類型［10］。近年來，HCC相關lncRNA研究進展迅猛，一批參與HCC發生發展的lncRNAs得到鑒定，展現出了作為HCC生物標志物和治療靶點的潛力［11］。因lncRNA數量龐大，迫切需要發現和鑒定更多的HCC相關lncRNA，為HCC的早期診斷、預后判斷和靶向治療提供全新分子。

LncRNA ZIM2-AS1轉錄于人類染色體的19q13.43區域，在腫瘤發生發展中的生物學作用目前并不清楚。DU等［12］通過全基因組關聯分析（GWAS）對烏干達男性前列腺癌相關風險位點進行鑒定，發現位于ZIM2-AS1內含子區域的rs7258285位點為非洲和非洲后裔男性前列腺癌的易感位點。而最近一項關于食管鱗狀細胞癌的生物信息學研究發現ZIM2-AS1與自噬相關基因呈現共表達模式且與食管鱗狀細胞癌患者的OS密切相關，是影響預后的保護因素，提示ZIM2-AS1可能參與腫瘤發生發展［8］。目前，ZIM2-AS1在HCC中的表達情況以及其與HCC進展的關系尚未見報道。

本研究利用TCGA數據庫中HCC RNA-seq數據及其臨床資料進行生物信息學分析，對ZIM2-AS1在HCC中的表達情況及臨床意義進行探究，發現ZIM2-AS1在配對和非配對HCC組織中的表達水平均呈現上升趨勢，其高表達與年齡、性別、腫瘤N分期、組織學分級及血清AFP水平呈顯著正相關，而與患者的OS和DSS均呈負相關，是影響HCC患者OS的獨立危險因素，且從構建的Nomogram預測模型可以看出，ZIM2-AS1表達水平對預測HCC患者總生存概率貢獻較大。進一步通過ROC曲線分析發現ZIM2-AS表達水平對于評估HCC、N0分期、組織學G1和G2期、OS和DSS均具有良好的預測效果，以上結果表明ZIM2-AS1具有可作為HCC早期診斷和預后判斷新型分子標志物的潛力。此外本研究發現，ZIM2-AS1的高表達與HCC組織中多種免疫細胞的浸潤密切相關。例如，具有腫瘤免疫抑制功能的Th2細胞和CD56brightNK細胞的浸潤與ZIM2-AS1表達水平呈正相關，而具有抗腫瘤活性的中性粒細胞和pDC在HCC組織中的浸潤豐度則與ZIM2-AS1表達水平呈負相關。研究表明腫瘤浸潤的Th2細胞可通過分泌IL-4和IL-10介導免疫抑制進而促進腫瘤生長或轉移［13-14］。而最新研究發現浸潤于腫瘤組織的CD56brightNK細胞，分泌干擾素-γ和腫瘤壞死因子-α的能力顯著減弱，提示其抗腫瘤功能受到抑制［15］。在腫瘤微環境中，中性粒細胞分為具有抗腫瘤效應的N1型和促腫瘤效應的N2型兩個亞群，其中N1型中性粒細胞可通過分泌Ⅰ型干擾素和活性氧物質以及激活多種先天性和適應性免疫細胞（如T、B、NK和DC等）抑制腫瘤生長和轉移［16］。pDC作為一類樹突狀細胞亞群，具有分泌Ⅰ型干擾素的功能，近年來研究發現pDCs可通過表達腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體和分泌顆粒酶B直接殺傷腫瘤并可有效增強NK和T細胞的抗腫瘤活性［17］。因此，ZIM2-AS1高表達可能與HCC免疫抑制型腫瘤微環境的形成密切相關，在HCC腫瘤微環境的調控中發揮重要作用，同時提示ZIM2-AS1可作為潛在的HCC免疫治療靶點。最后，通過qRT-PCR驗證了ZIM2-AS1在HCC細胞中的高表達趨勢，其結果與TCGA數據一致。

綜上所述，本研究主要基于TCGA數據通過生物信息學手段揭示了lncRNA ZIM2-AS1在HCC中異常高表達及其具有作為HCC診斷、預后判斷生物標志物及免疫治療靶點的潛在應用價值，同時為進一步針對ZIM2-AS1開展相關基礎與臨床轉化研究提供理論依據。本研究僅在細胞系中對ZIM2-AS1的表達進行了驗證，后續擬通過收集腫瘤組織、血清和血漿等臨床樣本開展進一步驗證工作。