HPV L1保守序列多肽抗血清降解HPV6感染能力的測試

鄧金芳 李志英 薛冰 肖長義 （.三峽大學附屬仁和醫院婦產科，三峽大學婦科腫瘤研究所，宜昌 443000； .三峽大學基礎醫學院組織學與胚胎學教研室，宜昌 443000）

基于生物信息學技術在人乳頭瘤病毒L1 C-末端篩選出一段高度保守穩定的30個氨基酸殘基長度的序列，以此序列合成的多肽可誘導出針對不同型別HPV L1的抗體。經多種方法測試，證明該序列多肽誘導的抗體對組織標本內的HPV L1具有良好的檢測性［1-3］。為明確該抗體對HPV L1是否具有降解作用，以及該段多肽作為免疫原是否具有開發為廣譜HPV疫苗的潛在價值，而進行了本項研究。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床樣本 收集來自三峽大學附屬仁和醫院婦產科門診和皮膚性病科門診的活檢標本，所有標本均經病理診斷確診。所取標本均先做病理診斷，剩余標本用于研究。用于研究的標本盡快進行分型鑒定，鑒定為HPV6型陽性的標本進一步做病毒提取。若不能立即處理，則置于-80 ℃冰箱保存。本研究經三峽大學附屬仁和醫院醫學倫理委員會批準（2021k110）。

1.1.2 細胞來源 人永生化角質形成細胞購自中國典型培養物保藏中心（武漢大學），為HPV陰性的永生化角質形成細胞。

1.1.3 主要試劑 2×Taq Master Mix（Promega公司）；DNA marker（上海捷瑞生物有限公司）；引物由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒提取 參考文獻［4-5］，簡述如下：采用無菌PBS溶液洗凈1～1.5 g尖銳濕疣組織的血污，無菌眼用手術剪修剪標本，盡可能剔除皮下及真皮組織，并充分剪碎組織。將提取緩沖液（0.02 mol/L Tris，1 mol/L NaCl， pH=7.4）加入切碎的組織，并轉入玻璃勻漿器內，勻漿器置于冰浴中充分勻漿。將上層液體轉入1.5 ml EP管中，28 000 r/min、4 ℃離心12 min，收集上清置于冰上，將提取緩沖液中加入沉淀中，重復操作4次。收集4次操作上清并混合，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。留100 μl濾液行PCR分型，剩余懸液于0.5 ml EP管分裝后置于-80 ℃冰箱封存以待下次使用。

1.2.2 病毒型別鑒定 引物及擴增參考文獻［5-7］，通過primer 5.0引物設計以及DNAMAN基因分析兩款軟件，參照已有的HPV6序列，篩選出評分高、片段小的引物。正向引物（4671-4690）TAGTGGGCCTATGGCTCGTC；反向引物（4950-4931）TCCATTAGCCTCCACGGGTG，目的條帶：280 bp。PCR反應體系：2×Taq Master Mix 12.5 μl、HPV6和11型引物（10 μmol/L） 0.5 μl、提取的病毒懸液 1.5 μl，去離子水加至25 μl。PCR反應要求：94 ℃預變性5 min；40個循環：94 ℃變性 90 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s；最后72 ℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳擴增產物，并于凝膠成像系統中拍照記錄。

1.2.3 HPV6病毒對人永生化角質形成細胞感染效果的檢測 從HPV6病毒感染的人永生化角質形成細胞中提取DNA，發現病毒感染后的細胞在280 bp處顯示出明顯條帶，而在280 bp處沒有顯示出條帶的則確定為未被病毒感染的細胞。

1.2.4 多抗血清降解病毒感染能力測試 參考文獻［8-9］，簡述如下：人永生化角質形成細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養，當瓶底剩余空間為10%～20%，即細胞基本鋪滿瓶底時，將提取的HPV6病毒及經多抗血清中和后的病毒加入培養瓶中。病毒需與多抗血清做如下梯度稀釋中和處理后加入，將病毒懸液與1∶10、1∶30、1∶90、1∶270、1∶810稀釋的等量多抗血清混合，37 ℃下中和1 h。培養細胞在加入病毒后，繼續37 ℃孵育，于1 h內，每隔15 min搖板1次，然后培養過夜。嚴格于感染培養后的24 h時，使用PBS充分洗滌3次，收集細胞。部分細胞提取DNA，做HPV6 DNA測定，測定方法同前；部分細胞提取蛋白，做HPV6 L1蛋白的ELISA檢測。

1.2.5 細胞吸收病毒后L1蛋白的ELISA檢測 待檢樣品用pH=9.6碳酸鹽緩沖液稀釋至蛋白含量為10 μg/ml，96孔板每孔添加100 μl，4 ℃培養12 h；將孔內溶液丟棄至廢液缸，磷酸鹽緩沖液洗板3次，每次3 min；加入封閉液，室溫封閉1 h，緩沖液洗；加1∶500的L1多肽抗血清，37 ℃孵育1 h，緩沖液洗；加入1∶1 000稀釋的過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，37 ℃培養1 h，緩沖液洗；DAB顯色，調整酶標儀讀取各孔490 nm處的光密度（OD）值。重復實驗3次取平均值。以沒有接觸病毒的人永生化角質形成細胞做陰性對照。所得OD值用SPSS10.0軟件處理。

1.3 統計學分析 采用SPSS10.0軟件進行分析，多組間數據比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 標本收集及分型鑒定 共收集到符合要求的經臨床及病理確診的生殖器尖銳濕疣標本26例。分型鑒定結果表明，凡于280 bp處出現陽性條帶的即鑒定為HPV6陽性，共鑒定出HPV6型20例，其他型別6例（圖1）。

圖1 臨床標本HPV型別鑒定PCR電泳圖Fig.1 PCR electrophoresis map for identification of HPV type in clinical specimens

2.2 HPV6病毒對人永生化角質形成細胞感染效果的檢測 從HPV6病毒感染的人永生化角質形成細胞中提取DNA，結果發現病毒感染后的細胞在280 bp處顯示出明顯條帶，而未被病毒感染的細胞在280 bp處未顯示出條帶，說明提取的HPV6病毒具有感染人永生化角質形成細胞的能力（圖2）。

圖2 HPV6感染人永生化角質形成細胞的病毒DNA檢測PCR擴增圖Fig.2 PCR amplification plot of viral DNA detection in HPV6-infected human immortalized keratinocytes

2.3 多抗血清降解病毒感染能力的測試 HPV病毒感染后，其PCR產物經電泳，在280 bp處有明顯陽性條帶（圖3），隨著抗體濃度增加陽性條帶逐漸變暗。對PCR電泳圖進行光密度值檢測和統計學分析，與陰性對照組相比，結果均有統計學意義（P＜0.05）。光密度值與抗體濃度之間呈顯著負相關（r=-0.935 5，圖4）。

圖3 中和后PCR電泳圖Fig.3 Neutralized PCR electrophoresis

圖4 倍比稀釋抗血清分別與陽性對照光密度值比較Fig.4 Fold ratio diluted antiserum compared with positive control photodensity values

2.4 細胞吸收病毒后L1蛋白的ELISA檢測 隨著抗體稀釋滴度增加，L1蛋白檢出量呈上升趨勢，病毒吸附于培養細胞的量顯著增加。說明隨著抗體稀釋度增加，其對病毒的中和能力隨之下降，抗血清濃度與L1蛋白含量之間呈負相關（r=-0.880 5）。見圖5。

圖5 被抗體中和后病毒感染的細胞內HPV6 L1蛋白的ELISA檢測結果Fig.5 Results of ELISA detection of intracellular HPV6 L1 protein infected by postviruses neutralized by antibodies

3 討論

已知HPV形成的體液免疫具有很強的型間限制，不同型別的HPV誘導形成的抗體很少具有型別間的交叉反應能力，這也是目前HPV感染預防采用多價疫苗的原因［10-12］。本項目組前期研究發現，以HPV主要外殼蛋白（L1）C-末端的一段保守序列合成的多肽，其誘發動物形成的抗體具有多價反應能力。但該多價抗體是否具有降解作用尚不知曉。因此，本實驗測試多肽抗血清能否阻止HPV6病毒顆粒對人永生化角質形成細胞的吸附，明確此多價抗血清能否降解HPV6病毒。有研究表明人乳頭瘤病毒能夠體外感染單層培養的人永生化角質形成細胞［4，8］，因此本研究選擇此細胞輔助完成實驗。

檢驗受染細胞中人乳頭瘤病毒DNA的存在是判斷人乳頭瘤病毒感染成功最便捷的方法［4，7-8］。本研究以提取的HPV6病毒感染人永生化角質形成細胞，若PCR方法可以測試到細胞內含有HPV6 DNA，說明HPV6病毒能在體外培養情況下感染人永生化角質形成細胞，證明實驗具有可行性。將抗血清按不同梯度濃度稀釋，中和病毒，使用處理后的病毒再次接觸人永生化角質形成細胞，再用PCR檢測受染細胞內病毒DNA含量，可反映抗血清是否能夠阻止HPV6吸附人永生化角質形成細胞。結果顯示，隨著免疫血清濃度的逐漸升高，HPV6 DNA條帶的光密度值度逐漸降低，即受染細胞吸附病毒DNA的量逐漸減少。與陰性血清對照相比，差異有統計學意義。與此同時，采用ELISA法檢測上述受中和病毒吸附于人永生化角質形成細胞的病毒L1蛋白量，亦證明抗血清濃度與L1蛋白含量間存在相反趨勢，該相反趨勢也有明顯統計學意義。兩種檢測實驗均顯示此種序列抗血清能一定程度上阻止HPV6病毒顆粒結合在人永生化角質形成細胞上，從而在一定程度上降解HPV6病毒的感染能力。

雖然本研究利用體外培養細胞的吸附抑制模型［7］，從兩個層面證明多肽抗血清對HPV6的感染能力具有一定的降解作用，但該降解作用似乎并不完整，尚未達到完全降解的效果。此外，本實驗因無法精準顯示病毒感染細胞及向胞內移動的情況，這些不足仍需采取更準確有效的實驗方法去研究處理。