多態性BoLA Ⅰα1α2與恒定鏈結合及在真核細胞共定位

陳芳芳 于鳳梅 劉翠艷 桂亞萍 李錦春 （安徽農業大學動物科技學院，合肥 230036）

牛主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）又稱牛白細胞分化抗原（bovine leukocyte antigen，BoLA），分為BoLA Ⅰ和Ⅱ類分子，它們在獲得性免疫中分別遞呈內源性和外源性抗原肽。這兩類分子分別由α與β鏈經共價鍵組成異二聚體，即MHCⅠαβ和MHCⅡαβ，其中MHCⅠβ鏈又名β2m。研究表明，MHCⅠα鏈和MHCⅡβ鏈呈高度多態性，而MHCⅠβ鏈和MHCⅡα鏈則呈高度保守性［1-2］。MHCⅠα鏈由結構域α1、α2、α3、跨膜區和胞漿區組成，多態性主要集中在α1和α2，是結合內源性抗原肽的功能區。除了遞呈抗原肽，牛BoLAⅠ類分子還具有激活CD8+T細胞，并與抗病毒感染能力有關［3-6］。

恒定鏈（invariant chain，Ii）是MHC Ⅱ類分子的伴侶分子，同一物種間高度保守而不同物種的Ii存在結構差異［7］。Ii不僅協助MHC Ⅱ類分子裝配和成熟，形成三聚體（αβIi），還協助MHC Ⅰ類分子遞呈外源性抗原肽。在內吞體，Ii從MHC Ⅱ類分子解離而被抗原肽取代，形成MHC Ⅱ/抗原肽復合物，并被轉運到免疫細胞表面，啟動體液免疫［8-9］。近年來研究發現，Ii參與了MHC Ⅰ類分子對抗原的交叉遞呈和細胞毒T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）應答，Ii的活性片段還可增強T細胞免疫應答［10-11］。進一步研究表明，Ii能結合MHC Ⅰ類分子，但在物種之間表現出一些不同，比如人和雞的Ii在結合不同表型MHC Ⅰ類分子方面存在差異，而草魚Ii與Ⅰ類分子結合則沒有明顯差異［12-14］。

總之，迄今關于Ii與MHC Ⅱ類分子的結合、遷移以及互相作用的研究較多，而Ii與MHC Ⅰ類分子的研究，諸如兩者在結合特性方面，特別是在哺乳動物Ii結合MHC Ⅰ類分子功能片段方面還缺乏研究。為深入認識兩類MHC分子的演化過程特點與互相作用機制，本研究在克隆牛BoLA Ⅰα鏈基因特點的基礎上，探明Ii與MHC Ⅰα鏈之間結合和胞內定位特征，為進一步揭示Ii和MHC Ⅰ類分子的關系以及在免疫應答中的作用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 DNA marker和限制性內切酶等購自大連寶生物工程有限公司；T4DNA連接酶和ExTaq酶購自日本ToYoTa公司；轉染試劑Xfect等購自北京Clontech生物工程有限公司；大腸桿菌（E.coli）DH5α感受態細胞購自北京天根生物有限公司；小鼠抗GST、His、GFP、RFP一抗和辣根酶標記山羊抗小鼠IgG二抗均購自中北京杉金橋生物技術有限公司；質粒提取試劑盒（OMEGA公司，美國）；DNA凝膠回收試劑盒（諾唯贊生物科技股份有限公司，中國南京）；Gluttathione Sepharose 4B柱和電化學發光（electrogenerated chemiluminescence，ECL）試劑盒、谷胱甘肽瓊脂糖樹脂（glutathione agarose resin，GST）純化柱和His蛋白純化鎳柱購自瑞典GE公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和DMEM培養基均購自Hyclone生物有限公司；293T細胞、pET-32a、PGEX-4T-1、pmCherry-C1、pEGFP-C1和pEGFP-N1均由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物與質粒 自行設計的引物序列、內切酶和構建的重組質粒名稱如表1所示。參照NCBI蛋白質結構分析網站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html）對BoLA Ⅰα結構進行比對分析，以表1中設計的引物擴增，獲得目的基因中相應的結構域片段，構建的重組質粒如表1所示。

表1 本研究中使用的引物序列和重組質粒Tab.1 Primer sequences and recombinant plasmids were used in this study

1.2.2 基因的擴增和比對分析 參照GenBank登記的BoLAⅠα基因序列（ID：L02835），自行設計一對引物，并從3頭淮北黃牛采集血樣，分別提取mRNA，然后以反轉錄獲得的cDNA作為模板進行目的基因擴增。經過初步鑒定的陽性質粒進一步做DNA測序（南京擎科）。對所獲基因序列應用生物學軟件DNAstar和MEGA4.0進行比對分析，應用Wu-Kabat方法進行多態性分析［15-16］。

用表1的引物從cDNA分別克隆基因片段BoLAⅠα1α2α3、BoLA Ⅰα1α2、BoLA Ⅰα3和Ii（如表1）。基因的擴增、重組質粒的構建和鑒定參照本課題組已經建立的方法［17］。

1.2.3 重組菌的構建、表達和鑒定 經鑒定正確的重組質粒pET-32a-BoLA Ⅰα1α2α3、pET-32a-BoLAⅠα1α2、pET-32a-BoLA Ⅰα3和pGEX-4T-1-Ii分別轉染感受態細菌Rosetta（DE3），構建4個分別含上述質粒的重組菌。重組菌再次經PCR和測序鑒定后，用0.4 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）于16 ℃進行誘導表達20 h。收集的菌體用180周，5 s，間隔10 s超聲波破碎菌體，經12 000 g離心15 min收集菌體沉淀，SDSPAGE電泳進行鑒定蛋白表達。包涵體蛋白復性處理參考張浩等的方法［18］。

1.2.4 親和層析純化目的蛋白 重組菌分別表達目的蛋白His/BoLAⅠα1α2α3、His/BoLAⅠα1α2、His/BoLAⅠα3和GST/Ii。其中，含His標簽的蛋白用鎳柱純化，含GST標簽的蛋白用GST親和層析柱（Glutathione sepharose 4B）純化。純化產物用SDSPAGE進行檢測。

1.2.5 拉下法、免疫印跡檢測和驗證目的蛋白間的相互作用 將GST/Ii加入GST親和層析柱內作為錨定蛋白，4 ℃冰箱內平衡30 min，然后將His/BoLAⅠα1α2α3、His/BoLAⅠα1α2、His/BoLAⅠα3以及His（對照）分別加入柱內，孵育1 h后用5倍柱體積的PBS洗脫，再經10 mmol/L谷胱甘肽解離液洗脫，收集洗脫液，分別進行SDS-PAGE凝膠電泳觀察電泳條帶，并應用轉移電泳和免疫印跡法檢測與Ii結合的關聯蛋白，具體操作同牛夏憶等［19］的方法。

1.2.6 細胞培養、真核轉染和共聚焦觀察關聯蛋白的共定位 293T細胞的培養、重組質粒的轉染參考本課題組前期建立的方法［17］。將pEGFP-N1-Bo-LA Ⅰα1α2α3、pEGFP-N1-BoLA Ⅰα1α2、pEG-FPN1-BoLA Ⅰα3分別與pmCherry-C1-Ii共轉染293T細胞，培養24 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察兩種分子在細胞的共定位。

2 結果

2.1 目的基因的克隆、鑒定與結構分析 首先，從3頭淮北黃牛獲得75條BoLA Ⅰa基因序列，經比對分析分為5個基因型，序列上傳GenBank，獲登錄序號分別為KF831068、KF831069、KF831070、KF831071和KF831072。分析其結構如圖1，分別由α1、α2、α3、T（跨膜區）和C（胞漿區）組成。進一步對獲得的序列進行多態性分析，結果發現牛至少存在5種以上BoLAⅠα基因型，不同結構域都表現出多態性，尤其是BoLAⅠα鏈的抗原肽結合區域（α1α2）和胞漿區（圖2）。其次，用自行設計的引物（表1）分別克隆所需基因片段BoLAⅠα1α2α3、BoLAⅠα1α2、BoLAⅠα3和Ii，在瓊脂糖電泳中獲得與預期大小一致的條帶，分別為864 bp、579 bp、306 bp和612 bp（圖3，泳道1c，2c，3c和4c）。

圖1 構建的BoLA Ⅰα片段結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of structured BoLA Ⅰα fragments

圖2 BoLA Ⅰα鏈5個結構域的氨基酸變異性Fig.2 Amino acid variability of five domains of BoLA Ⅰα chain

圖3 基因擴增和重組質粒雙酶切鑒定Fig.3 Amplification of genes and identification of recombinant plasmids by restriction endonuclease digestion

2.2 重組質粒構建及其表達鑒定 構建4個原核表達重組質粒pET-32a-BoLA Ⅰα1α2α3、pET-32a-BoLA Ⅰα1α2、pET-32a-BoLA Ⅰα3和pGEX-4T-1-Ii（圖3，泳道a），應用雙酶切進行鑒定，獲得預期大小的片段（圖3，泳道b），經測序表明符合預期DNA序列。進一步將原核表達重組質粒分別轉染工程菌Rosetta（DE3），經誘導表達、純化和復性的目的蛋白，如圖4所示，在SDS-PAGE中呈現預期大小的蛋白條帶，His/BoLA Ⅰα1α2α3、His/BoLA Ⅰα1α2、His/BoLA Ⅰα3和GST/Ii分別為51.7 kD、41.2 kD、31.2 kD和48.4 kD（其中His大小約為22 kD，GST大小約為26 kD）（圖4）。這表明，目的蛋白能夠在原核細胞中被表達。

圖4 目的蛋白表達和純化的鑒定Fig.4 Identification of products expression and purification

2.3 原核表達的BoLA Iα與Ii分子的結合域 為明確原核表達的BoLA Ⅰα的結構域α1α2α3、α1α2、α3與Ii的互相作用特征，采用拉下法進行檢測。在GST親和層析柱中，原核表達和純化的GST/Ii以及對照GST分別作為錨定蛋白被滯留，隨后分別加入His/BoLA Ⅰα1α2α3、His/BoLA Ⅰα1α2或His/BoLAⅠα3與之作用，如它們與Ii分子結合，則形成復合物而不被PBS洗脫，隨后加入谷胱甘肽解離液洗脫時這些復合物被一起從柱上解離，可在SDS-PAGE電泳中出現相應兩個條帶；如它們不與Ii結合，則被PBS洗脫，在SDS-PAGE中只出現GST/Ii或者GST一條帶。圖5A、B的結果顯示，在泳道2呈現兩條蛋白條帶，其大小分別與GST/Ii和His/BoLA Ⅰα1α2α3（圖5A，泳道1和泳道3）、His/BoLA Ⅰα1α2（圖5B，泳道3）相同，表明它們結合并形成的聚合物在SDS作用下被解離；但是，由于His/BoLA Ⅰα3不能被GST/Ii結合，在層析柱中被PBS洗脫，故在圖5C的泳道2內只出現GST/Ii一條帶。上述結果表明，Bo-LA Ⅰα的α1α2是結合Ii的結構域。

圖5 拉下法鑒定His/BoLA Ⅰα片段結合GST/IiFig.5 Identification of binding of His/BoLA Ⅰα fragment to GST/Ii by pull down

2.4 免疫印跡驗證Ii與BoLA Ⅰα1α2的結合產物 為進一步確定在拉下法中結合的Ii和His/Bo-LA Ⅰα1α2，采用免疫印跡法對其檢測驗證。將SDS-PAGE產物經電泳轉移至纖維膜上，應用特異性抗體檢測。結果如圖6所示，含有His標簽的分子均能被特異性抗體識別。在拉下法中與GST/Ii結合的聚合物GST/Ii+His/BoLA Ⅰα1α2α3或GST/Ii+His/BoLA Ⅰα1α2經SDS解離成GST/Ii和His/BoLA Ⅰα 1α2α3或His/BoLA Ⅰα1α2（圖6，泳道1，2），但由于GST/Ii不能結合His/BoLA Ⅰα3，所以在拉下法中未被滯留而在解離前被洗脫，在圖6泳道3中就沒有相應條帶。對照組［未經拉下法處理的His/BoLA Ⅰα1α2α3、His/BoLA Ⅰα1α2或His/BoLA Ⅰα3（圖6泳道4，5，6）］也能被特異性抗體所識別。上述結果表明在拉下法中Ii結合的是His/BoLA Ⅰα1α2。

圖6 免疫印跡鑒定被Ii結合的BoLA Ⅰα片段Fig.6 Identification of BoLA Ⅰα fragments bound to Ii by Western blot

2.5 BoLA Iα結構域在細胞內與Ii的共定位 Bo-LA Ⅰ類分子結合Ii以及遞呈抗原肽是在特定細胞器內進行的，α1α2能否與Ii一起進入相同的細胞器是確定這兩種分子具有互相作用的關鍵。為此，本研究進一步檢測了它們在真核細胞內的共定位。將構建的含綠色熒光蛋白GFP/BoLA Ⅰα1α2α3、GFP/BoLA Ⅰα1α2和GFP/BoLA Ⅰα3的重組真核質粒分別與紅色熒光蛋白RFP/Ii重組真核質粒共轉染293T細胞，培養后采用激光共聚焦顯微鏡觀察兩類關聯蛋白分子在細胞內的定位。由于GFP和RFP分別為綠色和紅色熒光，當兩種蛋白在細胞器中共定位時，兩種顏色的熒光蛋白疊加后則呈現橙黃色。如圖7A、B所示，在共轉染的細胞中，GFP/Bo-LA Ⅰα1α2α3和GFP/BoLA Ⅰα1α2呈綠色，而GFP/Ii呈紅色，在疊加圖中，部分呈橙黃色（如箭頭所示），表明α1α2與α1α2α3相同，能與Ii在細胞內共定位。在對照組中，GFP/BoLA Ⅰα3與單一GFP在細胞內定位相似呈綠色，但在重疊圖中，并不呈黃色。這表明α3不與Ii在細胞內共定位。上述結果表明，BoLA Ⅰα1α2能夠與Ii共定位，而BoLA Ⅰα3則不能。

圖7 BoLA Ⅰα1α2與Ii在真核細胞的共定位Fig.7 Co-localization of BoLA Ⅰα1α2 with Ii in eukaryotic cells

3 討論

BoLA Ⅰα鏈的結構域α1α2既是抗原肽結合區，也是與Ii結合的功能區。脊椎動物的MHC Ⅰα鏈的α1α2位于抗原肽結合區，呈高度多態性，在遞呈內源性抗原中起關鍵作用，而α3是免疫球蛋白樣區，具有保守性。雞MHC Ⅰα鏈通過結構域α1α2結合Ii［20］。為了解牛BoLA Ⅰα1α2結構域是否結合Ii，以及α3在其中的作用，本研究分別構建了α1α2和α3片段，觀察兩者結合Ii的特性。結果表明，Bo-LA Ⅰα鏈與其他脊椎動物相似，其α1α2也是結合Ii的功能結構域，而單一的α3結構域具有結合Ii的功能；同時在α1α2α3中，α3并不影響α1α2與Ii的結合。本研究結果也證實，原核表達的α1α2與Ii復性后保持了自然結構，不僅能穩定地互相結合，還能在免疫印跡中被特異性抗體識別。特別是這兩個真核表達的蛋白分子還能在胞內共定位，表明α1α2不僅維持了必要的結構，還具有進入細胞器并結合Ii的重要功能，而α3不能與Ii結合，也不能進入相應細胞器與Ii共定位，這提示α3結合Ii與BoLA Ⅰα鏈在細胞器內定位無關，但是其是否具有其他作用，尚需進一步研究。

BoLA Ⅰα鏈的α1α2多態性及結合Ii特征進一步驗證了MHC Ⅰ與Ⅱ類分子的同源性。基于MHCⅠ類和Ⅱ類分子所處染色體位置、分子結構和功能特征，被認為它們具有同源關系［21］。近年來關于這兩類MHC分子與Ii關系有一些重要發現，如Ii與MHC Ⅰ類和Ⅱ類分子基因的多態性特點及其在免疫器官中的表達呈高度相關性，而本研究結果則進一步豐富了這一理論［13，22］。首先，BoLA Ⅰα的α1α2結構域具有多態性特征，α1α2位于BoLA Ⅰ類分子的肽結合區且其多態性最高，這與其他哺乳動物相似。其次，Ii是MHC Ⅱ類分子的伴侶蛋白，在協助遞呈抗原肽中，Ii內質網漿區的CLIP（class-Ⅱ-associated invariant chain peptide）占據MHC Ⅱ類分子的抗原肽結合區，與之形成三聚體。MHC Ⅱ類分子β鏈的β1是肽結合區，也是與Ii結合的功能區［23-24］。盡管多種動物的Ii也能穩定結合MHC Ⅰ類分子，如雞MHC Ⅰ類分子α鏈的肽結合區α1α2結合，但尚無哺乳動物的數據［12-14，24］。本研究明確了牛Ii所結合的也是BoLA Ⅰ類分子的肽結合區α1α2。這就證明脊椎動物Ii所結合的兩類MHC分子均是其肽結合區（MHC Ⅰ類分子的α1α2和MHC Ⅱ類分子的β1），它們在結構方面高度相似。再次，研究表明Ⅰ類分子遞呈內源性抗原肽啟動CD8+T細胞免疫，而近年來發現Ii通過交叉遞呈也參與了細胞免疫［10］。Ii通過結合MHC Ⅱ類分子的肽結合區參與遞呈外源性抗原肽，而本研究發現Ii既能結合BoLA Ⅰ類分子肽結合區，也能與之在真核細胞內共定位，提示兩者在遞呈抗原肽方面具有相似的途徑和功能。

本研究采用原核表達系統，不僅能大量表達目的蛋白，而且經過復性，目的蛋白分子α1α2和Ii均恢復了其穩定的天然結構，具有互相結合的功能和被特異性抗體識別的特性［21-26］。這為今后的研究提供了可靠的技術支撐。