骨肉瘤中銅死亡相關(guān)亞型鑒定、預(yù)后模型構(gòu)建以及免疫細(xì)胞浸潤分析

邵子晨 李華南 章曉云，3 孫偉康 袁啟鵬 （.江西中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，南昌 330004； .江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南昌 330004； 3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院骨科，南寧 5300）

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是一種原發(fā)性骨惡性腫瘤，易發(fā)生局部侵襲和早期轉(zhuǎn)移，常發(fā)生于肺部，具有雙峰年齡分布特征，兒童和青少年發(fā)病率最高，其次為60歲以上人群［1-3］。目前臨床常見的OS治療策略包括手術(shù)切除和聯(lián)合放化療，極大改善了OS患者預(yù)后，但轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性O(shè)S預(yù)后未取得突破性進(jìn)展［4-5］。調(diào)查顯示，局限性O(shè)S患者五年生存率約為60%，但轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)患者五年生存率僅為20%［5-6］。盡管既往研究強調(diào)了鐵死亡、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬和細(xì)胞焦亡在OS中的重要作用，但銅死亡在OS中的作用仍不清楚。因此，銅死亡相關(guān)基因探索可為OS治療、預(yù)后及靶向藥物研發(fā)提供有效參考，指導(dǎo)OS患者臨床決策。

哈佛大學(xué)研究團(tuán)隊在人類細(xì)胞中證實了一種新型細(xì)胞死亡方式——銅死亡，同時揭示了銅死亡通過銅離子與線粒體呼吸的三羧酸循環(huán)中的脂酰化成分直接結(jié)合而發(fā)生，導(dǎo)致脂酰化蛋白聚集和隨后的鐵硫蛋白下調(diào)，從而導(dǎo)致蛋白毒性應(yīng)激并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［7-8］。這些發(fā)現(xiàn)有助于探索銅失調(diào)疾病（威爾遜病）及研發(fā)新型腫瘤治療策略。銅可通過介導(dǎo)ROS積累、線粒體功能障礙、蛋白酶體抑制和抗血管生成等多種機制抑制腫瘤細(xì)胞生長及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡［9］。隨著銅在癌癥治療中的地位提高，銅配合物因其較強的治療診斷能力和較弱的副作用逐漸成為一種新的抗癌策略，但其長期穩(wěn)定性和生物安全性有待進(jìn)一步驗證［10-11］。銅在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的死亡機制已成為新的研究熱點。

本研究聯(lián)合TARGET與GEO數(shù)據(jù)庫綜合探討OS中銅死亡基因相關(guān)亞型鑒定、預(yù)后和免疫浸潤影響，強調(diào)了銅死亡相關(guān)基因（cuprotosis related genes，CRGs）在OS預(yù)后中的重要性，為銅配合物在OS中的治療應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)包含88個OS樣本，數(shù)據(jù)來自TARGET（https：//ocg.cancer.gov/programs/target）數(shù)據(jù)庫［12］。GSE16091芯片包含34個OS樣本，數(shù)據(jù)來自GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫［13］。本研究收集了19個CRGs，包括NFE2L2、NLRP3、ATP7B、ATP7A、SLC31A1、FDX1、LIAS、LIPT1、LIPT2、DLD、DLAT、PDHA1、PDHB、MTF1、GLS、CDKN2A、DBT、GCSH和DLST。

1.2 OS相關(guān)CRG的生存分析及預(yù)后 運用R軟件將TARGET數(shù)據(jù)與GEO數(shù)據(jù)進(jìn)行合并及批次矯正，提取CRG表達(dá)。結(jié)合TARGET與GEO臨床數(shù)據(jù)對CRG表達(dá)進(jìn)行COX分析與KM分析，選擇最優(yōu)的KM分析對P＜0.05的基因（即OS預(yù)后相關(guān)基因）進(jìn)行生存曲線繪制，對OS相關(guān)CRG進(jìn)行預(yù)后相關(guān)性分析，保存P＜0.000 1的結(jié)果，繪制預(yù)后網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 銅死亡分型 結(jié)合臨床數(shù)據(jù)對OS樣本進(jìn)行銅死亡分型。對銅死亡分型進(jìn)行生存分析、相關(guān)性熱圖分析和GSVA分析，同時運用SSGSEA對銅死亡分型進(jìn)行免疫細(xì)胞差異分析。

1.4 銅死亡分型差異分析和GO、KEGG富集分析 設(shè)置log2FC=0.585和adj.Pvalue=0.05，對銅死亡分型進(jìn)行差異分析，得出銅死亡分型的差異基因。設(shè)置Pvalue=0.05和qvalue=0.05，對銅死亡分型的差異基因進(jìn)行GO及KEGG富集分析。

1.5 基因分型 結(jié)合臨床數(shù)據(jù)對OS樣本進(jìn)行基因分型。同時對樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素COX分析，得出單因素顯著基因表達(dá)及預(yù)后情況，并對基因分型進(jìn)行生存分析和相關(guān)性熱圖分析，分析基因分型在CRG中的差異表達(dá)。

1.6 預(yù)后模型構(gòu)建及風(fēng)險評估分析 將樣品組數(shù)據(jù)分為訓(xùn)練組和測試組，進(jìn)行Lasso回歸分析及交叉驗證。依據(jù)得到的特征基因構(gòu)建預(yù)后模型，得到樣品組、訓(xùn)練組和測試組風(fēng)險評分及屬性，以桑基圖進(jìn)行可視化展示。對樣品組、訓(xùn)練組和測試組風(fēng)險評分進(jìn)行生存分析及風(fēng)險曲線繪制。運用ROC曲線評估模型預(yù)測的準(zhǔn)確性。

1.7 列線圖構(gòu)建及風(fēng)險差異分析 結(jié)合臨床性狀繪制列線圖預(yù)測患者生存期。對銅死亡分型與基因分型進(jìn)行風(fēng)險評分差異分析，同時分析CRG在高、低風(fēng)險組的差異表達(dá)。

1.8 免疫細(xì)胞浸潤與腫瘤微環(huán)境分析 對OS樣本進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤分析；對參與模型構(gòu)建的基因進(jìn)行免疫細(xì)胞相關(guān)性分析。對OS樣本進(jìn)行腫瘤微環(huán)境分析，得出各OS樣本基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腫瘤純度評分（其中基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞綜合評分即為ESTIMATE評分）。分析各腫瘤微環(huán)境評分類型在高、低風(fēng)險組的差異表達(dá)。

1.9 藥物敏感性分析 運用R軟件“pRRophetic”包對OS樣本進(jìn)行藥物敏感性分析。設(shè)置P=0.001作為過濾條件，對P＜0.001的結(jié)果進(jìn)行可視化展示。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 采用線性回歸分析探索風(fēng)險評分與免疫細(xì)胞間的相關(guān)性。K-W檢驗比較組間差異，所有參數(shù)分析均基于雙尾檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，所有統(tǒng)計分析均使用R4.1.2版本。

2 結(jié)果

2.1 OS相關(guān)CRG生存分析及預(yù)后結(jié)果 設(shè)置P＜0.05作為過濾條件，KM分析篩選出10個OS預(yù)后相關(guān)基因，LIPT1與FDX1最為顯著（圖1）。DLST、LIPT1、NLRP3、SLC31A1、NFE2L2和LIAS基因高表達(dá)組預(yù)后優(yōu)于低表達(dá)組預(yù)后；ATP7B、FDX1、DLAT和CDKN2A基因低表達(dá)組預(yù)后優(yōu)于高表達(dá)組預(yù)后。對17個OS相關(guān)CRG進(jìn)行預(yù)后相關(guān)性分析，設(shè)置P＜0.000 1為過濾條件，篩選出13個OS相關(guān)CRGs繪制預(yù)后網(wǎng)絡(luò)圖（圖2），表明FDX1（為主）、GLS、DLAT和PDHB為預(yù)后的高風(fēng)險基因，具有致癌特征。SLC31A1、ATP7A、NFE2L2、PDHA1、DBT、DLST、MTF1、DLD和LIAS為預(yù)后的低風(fēng)險基因，具有抑癌特征。

圖1 10個OS預(yù)后相關(guān)基因的生存曲線Fig.1 Survival curve of 10 OS prognosis related genes

圖2 13個OS相關(guān)CRGs的預(yù)后網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Prognostic network of 13 OS related CRGs

2.2 銅死亡分型 結(jié)合臨床數(shù)據(jù)對OS樣本進(jìn)行銅死亡分型（圖3），可將OS分為：CRGclusterA與CRG-clusterB。對銅死亡分型進(jìn)行生存分析（圖4A），CRGclusterA與CRGclusterB間OS患者生存差異顯著（P＜0.001），且CRGclusterB生存率高于CRGclusterA，表明CRGclusterB預(yù)后優(yōu)于CRGclusterA預(yù)后。對銅死亡分型進(jìn)行相關(guān)性熱圖分析（圖4B），大部分CRG在CRGclusterA中呈高表達(dá)。對銅死亡分型進(jìn)行GSVA分析（圖4C），造血細(xì)胞系、細(xì)胞因子受體相互作用和神經(jīng)活性配體受體相互作用等在CRG-clusterB中呈高表達(dá)。p53信號通路、Mismatch_Repair信號通路、DNA復(fù)制、核苷酸切除修復(fù)、同源重組、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、細(xì)胞周期、剪接體、基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子、堿基切除修復(fù)、嘧啶代謝、丙酮酸代謝、半胱氨酸及蛋氨酸代謝、蛋白質(zhì)輸出、硒氨基酸代謝和一個碳池等在CRGclusterA中呈高表達(dá)。運用ssGSEA對銅死亡分型進(jìn)行免疫細(xì)胞差異分析（圖4D），CRGclusterB中活化B細(xì)胞、NK細(xì)胞、骨髓來源抑制性細(xì)胞（MDSCs）、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和Th1細(xì)胞表達(dá)高于CRGclusterA，而Th2細(xì)胞在CRG-clusterA中的表達(dá)高于CRGclusterB。

圖3 k=2～9的CRG共識矩陣Fig.3 Consensus matrix of CRG with k=2～9

圖4 銅死亡分型的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of copper death typing

2.3 銅死亡分型差異分析和GO及KEGG富集分析 設(shè)置log2FC=0.585和adj.Pvalue=0.05，對銅死亡分型進(jìn)行差異分析，得到銅死亡分型差異基因246個。設(shè)置P=0.05和qvalue=0.05，對246個差異基因進(jìn)行GO及KEGG富集分析。對BP、CC、MF排名前10的結(jié)果進(jìn)行可視化（圖5A）。GO富集顯示主要涉及骨化、腎臟發(fā)育、腎系統(tǒng)發(fā)育、泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育、成骨細(xì)胞分化、細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、外部封裝結(jié)構(gòu)組織和腎上皮發(fā)育等322條生物過程。KEGG富集顯示主要參與人乳頭瘤病毒感染、PI3K-Akt信號通路、Hippo信號通路、Wnt信號通路、TGF-β信號通路、p53信號通路、MAPK信號通路、庫欣綜合征、焦點粘連、乳癌、細(xì)胞黏附分子、癌癥中的蛋白多糖、ECM-受體相互作用、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號通路、基底細(xì)胞癌、黑素生成、細(xì)胞周期、胃癌等（圖5B）。

圖5 DEG富集分析Fig.5 Enrichment analysis of DEG

2.4 基因分型 結(jié)合臨床數(shù)據(jù)對OS樣本進(jìn)行基因分型（圖6），可將OS分為兩型：geneClusterA與gene-ClusterB。同時對樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素COX分析，得出單因素顯著基因表達(dá)及預(yù)后情況，并對基因分型進(jìn)行生存分析（圖7A），geneClusterA與geneClusterB間OS患者生存具有顯著差異（P＜0.001），且geneClusterB生存率高于geneClusterA，表明gene-ClusterB預(yù)后優(yōu)于geneClusterA預(yù)后，與銅死亡分型情況一致。對基因分型進(jìn)行相關(guān)性熱圖分析（圖7B），大部分基因在geneClusterA中呈高表達(dá)，與銅死亡分型情況一致。分析基因分型在CRG中的差異表達(dá)（圖7C），結(jié)果顯示，F(xiàn)DX1、DLAT、PDHB在gene-ClusterA中的表達(dá)高于geneClusterB，而PDHA1在geneClusterB中的表達(dá)高于geneClusterA。

圖6 k=2～9的246個差異基因共識矩陣Fig.6 Consensus matrix of 246 differential genes with k=2～9

圖7 基因分型的相關(guān)性分析Fig.7 Correlation analysis of genotyping

2.5 預(yù)后模型構(gòu)建及風(fēng)險評估分析 將樣品組數(shù)據(jù)分為訓(xùn)練組和測試組，進(jìn)行Lasso回歸分析（圖8A），通過交叉驗證（圖8B）得到6個特征基因MYO6、IRX5、PRKX、CLDN11、MAGEA11、BAIAP2L2。依據(jù)6個特征基因構(gòu)建預(yù)后模型，得到樣品組、訓(xùn)練組和測試組風(fēng)險評分及屬性，以桑基圖（圖8C）進(jìn)行可視化展示。對樣品組（圖9A）、訓(xùn)練組（圖9B）和測試組（圖9C）風(fēng)險評分進(jìn)行生存分析，結(jié)果表明高、低風(fēng)險組間患者生存具有顯著差異（P＜0.05），說明構(gòu)建的模型可區(qū)分高低風(fēng)險組患者，且低風(fēng)險組患者預(yù)后優(yōu)于高風(fēng)險組患者。繪制樣品組（圖9A）、訓(xùn)練組（圖9B）和測試組（圖9C）風(fēng)險曲線以及繪制1年、3年、5年ROC曲線評估模型預(yù)測準(zhǔn)確性，結(jié)果顯示樣品組、訓(xùn)練組和測試組3年或5年AUC更大，構(gòu)建的模型預(yù)測OS患者生存期準(zhǔn)確性更高。因此構(gòu)建的銅死亡相關(guān)風(fēng)險特征與OS生存率顯著相關(guān)。

圖8 預(yù)后模型構(gòu)建Fig.8 Construction of prognosis model

圖9 風(fēng)險評估分析Fig.9 Risk assessment analysis

2.6 列線圖構(gòu)建及風(fēng)險差異分析 結(jié)合臨床性狀繪制列線圖預(yù)測患者生存期（圖10A）。其中1年、3年、5年校準(zhǔn)曲線（圖10B）離灰色線條很近，說明通過列線圖預(yù)測1年、3年、5年生存期準(zhǔn)確性較高。對銅死亡分型與基因分型分別進(jìn)行風(fēng)險評分差異分析（圖10C、10D），結(jié)果顯示CRGclusterA與CRG-clusterB風(fēng)險評分具有顯著差異（P＜0.001），且CRGclusterA評分高于CRGclusterB評分。geneClusterA與geneClusterB風(fēng)險評分具有顯著差異（P＜0.001），且geneClusterA評分高于geneClusterB評分。同時分析CRG在高低風(fēng)險組差異表達(dá)（圖10E），結(jié)果顯示FDX1、LIPT1和DLAT在高風(fēng)險組表達(dá)上調(diào)。

圖10 列線圖的構(gòu)建及風(fēng)險差異分析Fig.10 Construction of nomogram and risk difference analysis

2.7 免疫細(xì)胞浸潤與腫瘤微環(huán)境分析 對OS樣本進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤分析；對參與模型構(gòu)建的基因（PRKX、MAGEA11和BAIAP2L2）進(jìn)行免疫細(xì)胞相關(guān)性分析（圖11A），結(jié)果顯示γδ T細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞和靜息樹突狀細(xì)胞與風(fēng)險評分呈正相關(guān)，而CD8 T細(xì)胞與風(fēng)險評分呈負(fù)相關(guān)。說明在OS高風(fēng)險中，γδ T細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞和靜息樹突狀細(xì)胞可能存在高表達(dá)；在OS低風(fēng)險中，CD8 T細(xì)胞可能存在高表達(dá)。對OS樣本進(jìn)行腫瘤微環(huán)境分析，得出各OS樣本基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腫瘤純度評分（其中基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的綜合評分即為ESTIMATE評分）。分析各腫瘤微環(huán)境評分類型在高低風(fēng)險組差異表達(dá)（圖11B），表明基質(zhì)細(xì)胞評分和ESTIMATE評分在高低風(fēng)險組具有顯著差異（P＜0.05）；ESTIMATE綜合評分在高風(fēng)險組中下調(diào)，說明高風(fēng)險組腫瘤純度更高。

圖11 免疫細(xì)胞浸潤與腫瘤微環(huán)境分析Fig.11 Analysis of immune cell infiltration and tumor microenvironment

2.8 藥物敏感性分析 運用R軟件“pRRophetic”包對OS樣本進(jìn)行藥物敏感性分析，設(shè)置P=0.001作為過濾條件，對P＜0.001的結(jié)果進(jìn)行可視化展示（圖12），結(jié)果顯示Elesclomol與GW.441756藥物在高風(fēng)險組IC50更低，說明高風(fēng)險組患者對這兩種藥物敏感性更高。

圖12 藥物敏感性分析（Elesclomol與GW.441756）Fig.12 Sensitivity analysis of drugs （Elesclomol and GW.441756）

3 討論

本研究在銅死亡基因基礎(chǔ)上建立了一個OS預(yù)后模型，且基于銅死亡基因識別出CRGclusterA與CRGclusterB兩種亞型，其中CRGclusterA與Th2細(xì)胞相關(guān)，CRGclusterB與Th1細(xì)胞相關(guān)。銅死亡是一種不同于任何已知細(xì)胞死亡機制的新型細(xì)胞死亡方式，依賴于線粒體呼吸［14］。這種不尋常的機制可能為OS治療帶來新的解決方案。

鐵氧還蛋白是銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是蛋白脂酰化的上游調(diào)節(jié)器，可編碼一種將Cu2+還原成Cu+的還原酶，是Elesclomol的直接靶點［15］。二氫硫辛酸轉(zhuǎn)乙酰基酶是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的重要組成，其脂酰化依賴性寡聚由銅與脂酰化TCA循環(huán)蛋白結(jié)合導(dǎo)致［15-16］。谷氨酰胺酶（glutaminase，GLS）是一種調(diào)控谷氨酰胺代謝關(guān)鍵酶，在上調(diào)腫瘤生長的細(xì)胞代謝方面起重要作用。GLS與腫瘤生長率和惡性度相關(guān)，并受癌蛋白c-Myc調(diào)節(jié)，具有致癌特征［17-18］。丙酮酸脫氫酶B（pyruvate delydrogense B，PDHB）是一種位于線粒體內(nèi)在氧化磷酸化中起重要作用的酶。PDHB作為糖酵解循環(huán)到檸檬酸循環(huán)的切入點用于能量生產(chǎn)，在多種人類惡性腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用［19-21］。這些基因可能在不同癌癥中分別發(fā)揮抑癌和促癌作用。本研究中，雖然FDX1、GLS、DLAT和PDHB作為OS預(yù)后高風(fēng)險基因可能表現(xiàn)出致癌特征，但仍需要相關(guān)體外及動物模型實驗明確其在OS中的作用特征。

大量研究表明腫瘤微環(huán)境在OS發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor associated macrophages，TAMs）廣泛參與OS生長、血管生成、轉(zhuǎn)移和干細(xì)胞樣表型［22-23］。巨噬細(xì)胞被誘導(dǎo)分化為M1和M2兩種類型，M1型參與Th1型免疫應(yīng)答并發(fā)揮促炎作用，M2型參與Th2型免疫應(yīng)答并發(fā)揮抑炎作用［24］。腫瘤發(fā)展過程中，TAM傾向于極化為M2型TAM［25］。激活Th2型免疫應(yīng)答，可導(dǎo)致免疫逃逸發(fā)生［24］。目前，在包括肝癌、肺癌、胃癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)高度浸潤的M2型TAM［26-27］。REN等［24］研究發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞通過與OS S180細(xì)胞共培養(yǎng)被證明極化為M2型TAM。本研究中，大部分OS銅死亡基因在CRGclusterA中呈高表達(dá)。CRGclusterA與Th2細(xì)胞相關(guān)且M2型巨噬細(xì)胞參與Th2型免疫應(yīng)答，表明在OS中，巨噬細(xì)胞可能更傾向于極化為M2型，進(jìn)而可能增加Th2型免疫應(yīng)答，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長和免疫逃逸，與REN等［24］研究結(jié)果相符。今后可能提供一種干擾巨噬細(xì)胞極化抑制腫瘤的方法，其中抑制M2巨噬細(xì)胞表型或阻斷M1巨噬細(xì)胞向M2極化的治療在多項研究中具有積極結(jié)果［23］。

目前γδ T細(xì)胞的抗腫瘤作用已在體內(nèi)外許多研究中得到證明，主要基于其高細(xì)胞毒性和γ干擾素形成，在主要組織化合物中具有無限溶解度活性，與各種腫瘤具有高度相容性［28-29］。最近研究顯示，小鼠和人類產(chǎn)生IL-17的γδ T細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)具有意外的腫瘤促進(jìn)作用［30］。可見γδ T細(xì)胞對腫瘤生長具有雙重作用。已知CD8 T細(xì)胞可直接殺死癌細(xì)胞［31］。肥大細(xì)胞的高浸潤與許多癌癥預(yù)后不良、生存率低和轉(zhuǎn)移增加有關(guān)。肥大細(xì)胞可通過生成血管生成因子和產(chǎn)生蛋白酶促進(jìn)腫瘤生長［32-33］。研究表明，暴露于腫瘤抗原的樹突狀細(xì)胞通過誘導(dǎo)腫瘤特異性T細(xì)胞反應(yīng)在抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用［34］。以樹突狀細(xì)胞為基礎(chǔ)研制治療黑色素瘤和腎細(xì)胞癌的疫苗已在免疫和臨床反應(yīng)中得到了證實［35］。本研究發(fā)現(xiàn)高水平的CD8 T細(xì)胞與OS良好預(yù)后相關(guān)，而高水平的γδ T細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞和靜息樹突狀細(xì)胞與OS不良預(yù)后相關(guān)，與上述結(jié)論相矛盾［34］，即高水平的樹突狀細(xì)胞與OS不良預(yù)后相關(guān)。需要更多實驗證明上述免疫細(xì)胞在骨腫瘤中具有特定的抗腫瘤或促腫瘤作用。基于免疫細(xì)胞的免疫治療可能促進(jìn)OS患者臨床預(yù)后改善，尤其是針對OS復(fù)發(fā)者和轉(zhuǎn)移者，其安全性和有效性有待進(jìn)一步臨床試驗。

Elesclomol是一種強效銅離子載體，可促進(jìn)特定腫瘤細(xì)胞凋亡，且作為潛在抗癌藥物進(jìn)入了臨床試驗，但具體分子作用機制尚不清楚［8，36］。編碼Elesclomol靶蛋白的FDX1基因是促進(jìn)銅死亡的基因［8］。本研究藥物敏感性分析顯示，OS細(xì)胞對Elesclomol與GW.441756更敏感。鐵氧還蛋白與OS預(yù)后顯著相關(guān)。因此，Elesclomol可治療OS患者，可能與OS細(xì)胞更易受銅死亡影響有關(guān)。

綜上，本研究系統(tǒng)分析了OS中CRG相關(guān)亞型鑒定、預(yù)后和免疫浸潤的影響，識別出CRGclusterA與CRGclusterB兩種亞型，鑒定出4個預(yù)后高風(fēng)險基因FDX1、GLS、DLAT和PDHB，為OS預(yù)后評估和免疫治療候選靶點提供了新見解。