增強拉曼光譜法快速篩查尿液中的芬太尼類物質的研究

＊陳海云 林曉 凌偉航 蘇院司 滕麗瓊

（南寧壯博生物科技有限公司 廣西 530007）

芬太尼是一種強效合成阿片類物質，具有陣痛等麻醉藥理作用，與嗎啡類似，但藥效約是嗎啡的75～100倍[1]。過量使用芬太尼可導致嘴唇發青、呼吸困難、口吐泡沫、身體僵硬，芬太尼的劑量低至2mg就可能致命。芬太尼的相似物極多，其母體包含兩個苯環與一個哌啶環，極易被取代，因此也被稱為“設計家藥物”，且芬太尼本身熒光干擾強，對現場檢測干擾較大[2]。

芬太尼類物質的結構相似度較高，可以通過檢測芬太尼類物質共有的官能團進行識別，再根據取代基的不同進行細分[3]。目前，芬太尼類物質的檢驗方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法、液相色譜串聯質譜法、酶聯免疫吸附測定法、拉曼光譜法、紅外光譜法等[4]。拉曼增強技術作為一項新興的分子光譜技術，可以準確檢測待測物的分子結構[5]。相較常規拉曼，增強技術（SERS）克服其它光譜技術（常規拉曼、紅外、紫外-可見光等）難以檢測微痕量物質的缺點，將目標物信號增大百萬倍以上，并且不受水和環境氣體信號影響，同時保留其它光譜技術快速、簡便的優點[6]。

本文主要記錄了用拉曼技術在人體尿液中檢測芬太尼類新精神活性物質和標準品檢測的實驗過程，并對其實驗結果進行了分析。

1.實驗部分

(1)實驗儀器及條件

實驗儀器：壯博JD-1000手持式拉曼光譜儀（南寧壯博生物科技有限公司研究團隊研制），激光光源785nm，激光功率250mW，積分時間600ms。壯博JD-1000手持式拉曼光譜儀與市售拉曼光譜儀對比，壯博JD-1000手持式拉曼光譜儀建設有更為全面的尿液中毒品數據庫，并有擁有自身的光譜識別算法和云平臺比對數據，市售的大多數拉曼儀器建立的是標準品比對數據庫，并不符合本試驗要求。

(2)實驗材料

實驗以芐基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼（南京藥科大學）；表面增強拉曼檢測試劑盒（管制非藥用類麻醉、精神類藥品）（南寧壯博生物科技有限公司）；人體尿樣（南寧壯博生物科技公司）；氯金酸、檸檬酸三鈉（國藥集團化學試劑有限公司)。

(3)實驗方法

①金納米Au@TRM材料制備。將100mL 0.01% HAuCl3溶液加熱至沸騰，加入1mL 1%的檸檬酸鈉溶液作為還原劑，磁力攪拌30min，冷卻后即得納米金溶膠，在納米金溶膠中再加入一定濃度的秋蘭姆溶液，混勻后常溫孵化一定時間，離心濃縮至10mL，再加入90mL復溶液復溶。將制備好的溶膠冷卻至室溫，于4℃下避光儲存。

②樣品制備。分別將4種芬太尼加入到人工尿樣中，制備成芐基芬太尼濃度為0.5mg/kg、丙烯酰芬太尼濃度為0.5mg/kg、硫代芬太尼濃度為0.5mg/kg、乙酰芬太尼濃度為1mg/kg的模擬尿樣。標準品芐基芬太尼用水稀釋到濃度為0.5mg/kg、丙烯酰芬太尼用水稀釋到濃度為0.02mg/kg、硫代芬太尼用水稀釋到濃度為0.05mg/kg、乙酰芬太尼用水稀釋到濃度為1mg/kg進行檢測。

③標準品檢測。進行檢測時，將激光頭的激光出射口對準檢測瓶，檢測瓶中加入待檢驗品，按下手機界面的“檢測”按扭，采數秒信號后；如果鑒別結果是危險品，則給出匹配物質名稱并震動報警。使用表面增強拉曼檢測試劑盒對樣品進行檢測。

空白檢驗：取100μL去離子水，加入100μL增強試劑，立即用拉曼光譜儀器在目標物檢測模式下標準品M1庫中檢測，平行操作4份。取100μL水溶液，加入100μL增強試劑，用拉曼光譜儀器在目標物檢驗模式下檢測，重復檢測4次。

樣品檢驗：取100μL芐基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼水溶液，加入100μL增強試劑，用拉曼光譜儀器在目標物檢驗模式下檢測，重復檢測4次。

④尿液中摻標準品檢測。空白尿液檢測：取4份400 μL空白尿液樣品，按試劑盒產品說明書中方法進行處理，供配套拉曼光譜儀器目標物檢驗模式下進行目標物識別檢測。重復檢測4次。

尿液中摻標物檢測：取4份400 μL芐基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼尿液添加樣品，按產品試劑盒說明書中方法進行前處理再加入100μL增強試劑，供配套拉曼光譜儀器目標物檢驗模式下進行目標物識別檢測，重復檢測4次。

2.結果與討論

(1)標準品檢測結果

通過表面增強拉曼試劑，可以將照射到芬太尼類物質表面的信號大大增強，從而辨別出不同芬太尼的峰值特征，拉曼測定的是分子受激發后的反射光，因此對于有些物資如無定型的物質玻璃等會在測定中產生強烈的熒光干擾，將拉曼信號掩蓋[7]。所以需要增強試劑增強目標物的反射光，放置被熒光干擾或者掩蓋，就結論而言，增強試劑很好的幫助目標物增強了反射光，提供了良好的信號。通過多峰判斷對比出具體物質。芐基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼標準品，實驗結果如圖1所示。徐琳，何洪源等人[8]研究了28種芬太尼的拉曼光譜，發現在拉曼光譜中，芬太尼類物質均在1000cm-1處有強的拉曼峰，該峰是由苯環上C-H鍵的面內彎曲振動引起的[8]。對應我們檢測出的4種芬太尼都出現的位移在996cm-1處的峰。此處的峰為基峰，其他峰的強度均低于基峰強度的30%。僅憑996cm-1這條峰無法確證為芬太尼類物質。故需要對各類芬太尼類物質進行具體分析其特征峰歸屬，其對應的拉曼峰見表1。從這些特征峰數值和位移情況可以看出，拉曼光譜對于芬太尼類物質具有高的區分度，但對于部分結構上相差一個甲基的結構類似物或甲基取代基不同的同分異構體的區分度較弱。

表1 芐基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼的拉曼特征峰數值表

圖1 芐基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼的光譜對比圖

(2)尿液中摻標檢測結果

芬太尼樣品在尿液中含有的有機物過多有較強的的干擾，利用試劑盒進行前處理并添加了增強試劑后能夠有效的避免干擾，讀取有效明顯的特征峰。通過比對，能夠很明顯的發現，拉曼激光明顯會受到環境或者其他因素干擾（圖2）。

圖2 芐基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼在尿液中檢出的光譜對比圖

①標準品與尿液中摻標光譜比對

芬太尼樣品在尿液中和標準品檢測讀取有效明顯的特征峰。通過比對，能夠發現，有部分拉曼位移輕微有些變化，其特征峰數值變動范圍在1～5之間。對于芐基芬太尼拉曼光譜圖，其695cm-1、739cm-1、824cm-1、911cm-1、996cm-1、1022cm-1、1166cm-1、1209cm-1特征峰作為特征識別依據在尿液中和標準品特征峰一致，其特征峰數值偏移為0，完全一致；對于乙酰芬太尼，其中996cm-1特征峰作為特征識別依據在尿液中和標準品一致，其743cm-1、826cm-1、918cm-1、1024cm-1、1069cm-1、1202cm-1為尿液中乙酰芬太尼的特征峰，對比標準品特征峰741cm-1、824cm-1、915cm-1、1022cm-1、1170cm-1、1198cm-1數值變動范圍為2～4，拉曼位移偏移數值在5以內為正常偏移，所以根據尿液中乙酰芬太尼與標準品乙酰芬太尼特征峰判別，無雜峰、圖譜一致，識別為同一物質；尿液中丙烯酰芬太尼1019cm-1、1251cm-1特征峰對比標準品特征峰1021cm-1、1249cm-1，其特征峰數值變動范圍為3，為正常偏移，所以根據尿液中丙烯酰芬太尼與標準品丙烯酰芬太尼特征峰判別，無雜峰、圖譜一致，可識別為同一物質；對于硫代芬太尼，551cm-1、996cm-1、1068cm-1特征峰為兩種狀態共同特征識別依據，尿液中硫代芬太尼739cm-1、800cm-1、909cm-1、1023cm-1、1162cm-1、1414cm-1特征峰對比硫代芬太尼標準品特征峰742cm-1、802cm-1、911cm-1、1021cm-1、1164cm-1、1412cm-1，其特征峰數值變動范圍為2～3，也為正常偏移，所以根據尿液中硫代芬太尼與標準品硫代芬太尼特征峰判別，無雜峰、圖譜一致，可識別為同一物質。

3.結論

本文基于拉曼增強技術對水溶液和尿液中的芐基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼進行研究。通過實驗值對比，分析了4種芬太尼的拉曼光譜特征。在實戰時，對樣品進行前處理后，排除雜質和熒光干擾條件下，證明利用增強拉曼技術可有效檢測出低痕量芬太尼類物質，絕大多數的芬太尼類結構類似物都明顯具有區分度。由于芬太尼類物質種類多且人體吸食后代謝研究難度大，所以芬太尼類物質在生物體內經過代謝后尿液中的藥物濃度的確切含量還在不斷研究中，尚不能定論是怎樣的數值。本次試驗的檢出限對比液相色譜儀能檢出的檢出限來看偏高，還需進行更多的試驗去驗證該方法在警方實戰過程中的有效性。且本文利用拉曼技術檢測人體尿液中芬太尼的試驗由于沒有大量吸食芬太尼的人員尿液，所以本試驗是在正常人體尿液中摻入的芬太尼類物質的低濃度標準品，實際應用時可能出現假陰性或者假陽性的結果，驗證實際應用情況，需要在警方的支持下才能更好的完成試驗[9-10]。

總的來說，該方法具有快速、準確、無損、操作簡便等優點，為水溶液中和尿液中芐基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼的快速檢測打下了良好的基礎。