低溫低碳氮比條件下菌株Acinetobacter albensis X1氨氮去除性能研究

＊劉聰 張玉

（大連理工大學環(huán)境學院 遼寧 116024）

水中氮素污染長期以來一直是重要的環(huán)境問題。目前生物脫氮是廢水中去除氮素污染的最有效的方法之一。傳統(tǒng)的廢水氨氮生物去除技術存在占地面積大、停留時間長等問題。近年來異養(yǎng)硝化-好氧反硝化（HN-AD）技術受到廣泛關注，其可在同一體系同時進行硝化和反硝化過程，將氮轉化為N2和N2O[1]。目前已有報道某些HN-AD菌的氨同化作用占比較大[2]。同化作用可以通過微生物將廢水中氨氮、硝態(tài)氮轉化為自身細胞物質。污水的常規(guī)的硝化和反硝化生物脫氮過程需要消耗能量將氨氮轉化為N2，而通過Haber-Bosch工藝將N2轉化為氨氮需要更多的能量[3]。因此，去除水中氨氮污染的同時實現氮資源回收[4]的異養(yǎng)氨同化過程具有重要的節(jié)能減污降碳意義。

研究表明，低溫會抑制酶的活性，抑制脫氮微生物的生長代謝[5]，因此耐低溫脫氮微生物的篩選是解決低溫污水脫氮難題的重要方法之一。在低溫條件下異養(yǎng)微生物相比自養(yǎng)微生物具有更好的性能[6]。本課題組曾報道低溫條件下菌株Acinetobacter sp.Z1在較高碳氮比時的氮去除性能和途徑[7]，但是目前低碳氮比污水大量存在，同時低溫同化過程研究較少，因此本研究重點考察具有同化性能的耐低溫菌株在低碳氮比條件下的氨氮去除性能。考查了低碳氮比條件下耐低溫菌株X1在不同種類無機氮源條件下的碳、氮去除特性，研究了碳源對菌株X1去除NH4+-N的影響，同時對菌株X1的氨氮轉化途徑進行研究。

1.材料與方法

（1）菌種來源。使用已篩選出的耐低溫氨氮去除菌Acinetobacter albensis X1，該菌株分離自某市政再生污水處理廠、工業(yè)園區(qū)污水處理廠和石化廢水處理廠二沉池污泥的初篩菌樣品。

（2）培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基：蛋白胨10（g·L-1）、酵母浸粉5（g·L-1）、NaCl 10（g·L-1），pH 7.0。

銨介質培養(yǎng)基（AM）：CH3COONa 0.3684（g·L-1）、(NH4)2SO40.2643（g·L-1）、K2HPO4·3H2O 0.0824（g·L-1）、MgSO4·7H2O 0.0500（g·L-1）、MnSO4·H2O 0.0112、NaCl 0.1200（g·L-1）、FeSO4·7H2O 0.0183（g·L-1），pH=7.2。

以上培養(yǎng)基均121℃高溫高壓滅菌20min后，取100mL裝入250mL錐形瓶中備用。

（3）菌株X1的生長及氨氮去除特性探究。取LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數生長期的菌株X1，8000r·min-1離心5min后倒掉上清液，加入生理鹽水重懸，以同樣條件離心，重復操作三次完成洗菌過程，加入一定量生理鹽水重懸制成菌懸液。取一定量的菌懸液接種于裝有100mL AM培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中（以56mg·L-1為氮源，乙酸鈉為碳源，m(COD)/m(N)=5），設置三組平行實驗，在12℃、150r·min-1搖床培養(yǎng)，定期取樣測定OD660、、、、COD濃度。

（4）氮平衡分析。在100mL西林瓶中加入100mL AM培養(yǎng)基，用99%純氧曝氣至頂空充滿O2，滅菌后接入一定量菌株Xl的菌懸液。于12℃、150r·min-1搖床密閉培養(yǎng)24h，采集反應前后體系的頂空氣體，利用氣相色譜儀定性檢測O2、N2、N2O，同時取樣測定體系中、、、Bio-N濃度。

（5）碳源對菌株X1氨氮去除性能的影響。將一定量的菌懸液接入裝有100mL AM培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，保持m(COD)/m(N)為5，分別加入乙酸鈉、葡萄糖、蔗糖、丁二酸鈉、檸檬酸鈉調節(jié)碳源種類；以乙酸鈉為碳源，使m(COD)/m(N)分別為2.5、5、7.5、10。設置三組平行實驗，在12℃、150r·min-1搖床培養(yǎng)，分析碳源種類及加入量對菌株X1的去除性能的影響，定期取樣測定OD660、濃度。

（6）分析方法。OD660的測定采用分光光度法；濃度的測定采用水楊酸分光光度法；濃度采用濃硫酸-水楊酸法；濃度的測定采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法；Bio-N濃度利用離心后的菌餅在0.5mol·L-1的NaOH中煮沸5min裂解，利用總有機碳/總氮分析儀測定TN濃度，計算為胞內氮濃度；COD濃度的測定采用重鉻酸鉀消解法；N2、N2O、O2采用氣相色譜儀測定。

采用SPSS27.0進行單因素方差分析，P＜0.05表示結果具有顯著性差異。

2.結果與分析

(1)菌株X1的生長及氨氮去除特性

為評價菌株X1在低溫、低m(COD)/m(N)的氨氮去除性能，如圖1所示，在以為唯一氮源的培養(yǎng)體系中，在m(COD)/m(N)為5時，菌株X1生長良好，在12℃可以利用。其生長曲線無滯后期，在前8h直接進入對數生長期，8h菌體OD660達到穩(wěn)定值，最大OD660為0.455，說明菌株X1在低溫、低m(COD)/m(N)下生長良好。接種后濃度下降，培養(yǎng)8h后濃度從47.97mg·L-1降至33.85mg·L-1，達到最大去除率29.43%，平均去除速率為1.76mg·(L·h)-1。菌株X1在低溫、低COD下對的去除效率好于一些菌株，如Acinetobacter sp.SYF26（0.0037mg·(L·h)-1）[8]。與Acinetobacter sp.Y16[9]等菌株類似。菌株X1的去除過程與菌株X1的生長密切相關，菌株在快速生長期去除速率最快。在Acinetobacter albensis X1的去除過程中未檢測到、的積累，與Acinetobacter sp.JR1等[2]許多研究一致。菌株X1對氨的去除伴隨著有機物的消耗，12h后COD去除率為92.86%。

圖1 菌株X1的生長和碳氮去除情況

(2)低溫低m(COD)/m(N)下菌株X1氨氮去除的氮平衡分析

通過分析反應前后各價態(tài)氮的濃度變化，完成菌株X1在低溫、低m(COD)/m(N)下去除過程的氮平衡計算，用初始樣品中總氮濃度與最終樣品中總氮濃度之差作為氮損失，用氮損失的量表示氣態(tài)氮產生量[10-11]。如表1所示，以為唯一氮源，菌株X1可以去除24.64mg·L-1的，其中初始21.18mg·L-1同化為胞內氮，占比85.96%，密閉體系中有極少量的N2O產生，占氣體總量的0.53%，同時檢測到O2的減少和N2的增加。

表1 菌株X1氨氮去除的氮平衡實驗（單位：mg·L-1）

綜上所述，菌株X1主要氨氮轉化途徑是同化作用，同時通過異養(yǎng)硝化好氧反硝化作用將轉化為氣態(tài)氮。

(3)碳源對低溫低m(COD)/m(N)下菌株X1氨氮去除性能的影響

①碳源種類。碳源作為細胞大分子生物合成的碳骨架，還作為異養(yǎng)微生物的電子供體，為微生物生長代謝過程提供電子和能量。由于不同碳源的氧化還原電位不同，因此的外加碳源類型不同使微生物具有不同的氨氮去除速率，且不同的菌株對有機碳源類型的偏好不同。

如圖2所示，碳源類型對菌株X1的生長及氨氮去除有顯著影響。在m(COD)/m(N)=5時，不同的碳源種類下菌株X1生長及去除速率依此為丁二酸鈉＞乙酸鈉＞檸檬酸鈉＞葡萄糖＞蔗糖。與菌株X1類似，Achromobacter xylosoxidans CF-S36[17]的最適碳源為丁二酸鈉（又名琥珀酸鈉）。以丁二酸鈉為碳源時，菌株4h達到穩(wěn)定期，最大OD660為0.426，最大去除速率為3.26mg·(L·h)-1(0～4h)，去除率為36.01%，COD去除率為90.17%。丁二酸鈉可直接參與三羧酸（TCA）循環(huán)，丁二酸鹽通過TCA循環(huán)產生能量比乙酸鹽更容易和直接[18]。以乙酸鈉為碳源時，其最大去除速率分別為2.75mg·(L·h)-1(0～8h)，去除率分別為40.25%，COD去除率為90.68%。以檸檬酸鈉為碳源時，菌株生長、代謝速率較慢，最終去除率較低，為17.70%。如圖2（d）所示，以有機酸鹽為碳源時，pH隨菌株生長代謝逐漸升高至8.32～8.35，與Pseudomonas mendocina X49[19]、Acinetobacter sp.ND7[20]的結論一致。反硝化過程堿度增加，以有機酸鹽為碳源時可能發(fā)生了好氧反硝化作用[19]。菌株X1對有機酸的利用比糖類更有效，與菌株Acinetobacter sp.strainC-13[14]對有機酸的利用率高于糖類的結果一致。菌株X1不能利用葡萄糖和蔗糖進行生長和代謝，與Acinetobacter sp.Z1[7]、Acinetobacter sp.Y1[21]的結論類似。可能是缺乏糖酵解（Embden-Meyerhof-Parnas，EMP）途徑的關鍵酶，導致菌株X1難以利用糖類[18]。

圖2 碳源對菌株X1（a）生長和（b）氨氮去除性能（c）COD去除性能、（d）pH變化的影響

②m(COD)/m(N)。對于異養(yǎng)型細菌，不同m(COD)/m(N)會影響菌株的生長和污染物去除能力[22]，因此為獲得高效的生長及氨氮去除效果，同時減少碳源的浪費，探究m(COD)/m(N)對菌株X1處理效果的影響。如圖3所示，提高m(COD)/m(N)可以顯著提高菌株X1的去除率（P＜0.05）。當m(COD)/m(N)＜10時，隨著m(COD)/m(N)從2.5提升到10，菌株的生物量增大，氨氮去除效果提升，菌株的最大OD660從0.314提高到0.651，去除率從29.08%提高到59.13%。第24～48h的濃度上升，可能是菌體死亡導致釋放[20]。適當提高m(COD)/m(N)能夠促進菌株的生長和氨氮降解，與之前的研究結果一致[23]，但是在m(COD)/m(N)為10時仍有剩余，研究表明在污水處理過程中異養(yǎng)生物消耗約20gCOD/gN[15]，因此菌株X1在此條件下無法完全去除可能是由于有限的碳源無法為微生物生長提供足夠的能量和為氨氮去除提供足夠的電子供體[24]。結果表明，菌株X1在m(COD)/m(N)=2.5時仍可生長并去除，菌株X1具有在低溫、低m(COD)/m(N)下應用的潛力，外碳源的加入將有助于提高的處理效果。

圖3 m(COD)/m(N)對菌株X1的（a）生長和（b）氨氮去除性能的影響

3.結論

菌株X1在溫度12℃，m(COD)/m(N)為5的條件下有較好的氨氮去除性能，去除速率為1.76 mg·(L·h)-1。低溫條件下菌株X1可以利用乙酸鈉、丁二酸鈉、檸檬酸鈉為碳源，在m(COD)/m(N)≥2.5時具有較好的NH4+-N去除性能。菌株X1的氮代謝途徑以同化作用為主，占比85.96%，同時發(fā)生異養(yǎng)硝化-好氧反硝化作用，將NH4+-N轉化為主要氣態(tài)產物N2，無NO3--N、NO2--N積累。菌株X1對于低溫條件下污水處理的污染物去除及低碳運行重要意義，菌株X1可提高污水處理的氮回收率，菌株X1富集的生物氮可進行資源化利用。菌株X1代謝過程中僅有極少量N2O產生，有助于減少污水處理系統(tǒng)的溫室氣體排放量，推動污水處理減污降碳協(xié)同，助力雙碳目標。