產活性氧假交替單胞菌GCY全基因組序列分析

岳 昊, 吳 碩, 王 競*, 李 澤 龍, 顧 晨

(1.大連理工大學 環境學院, 遼寧 大連 116024;2.中國電建集團華東勘測設計研究院有限公司, 浙江 杭州 311122 )

0 引 言

由Gauthier等[11]在1995年從交替單胞菌中分離得到的假交替單胞菌(Pseudoalteromonas),是在全球海洋生態系統中普遍存在的革蘭氏陰性菌．在本課題組之前的研究中,Gu等[12]證明了Pseudoalteromonassp.GCY可通過產生的胞外ROS完成四溴雙酚A的好氧共代謝降解;Li等[7]揭示了Pseudoalteromonassp.GCY降解布洛芬首先由胞外ROS啟動,然后中間產物被細胞內的酶進一步降解．然而Pseudoalteromonassp.GCY的參考基因組還不清晰,且影響假交替單胞菌胞外ROS產生的因素也未知．

從大連近海表層沉積物中分離得到一株能產胞外ROS的Pseudoalteromonassp.GCY．采用Illumina測序技術對Pseudoalteromonassp.GCY基因組進行測序,并對其產ROS特性進行研究,以提供Pseudoalteromonassp.GCY(以下簡稱菌株GCY)的基因組信息,明晰影響產ROS的因素．研究結果將在分子水平上加深對生物源ROS產生以及影響機制的理解．

1 材料與方法

1.1 菌株的分離與鑒定

近海表層沉積物采集自中國遼寧省大連市黑石礁(38°52′34″N,121°33′58″E)．連續培養120 d后,沉積物中的菌群被富集．將富集得到的菌群在人工海水制備的固體BP培養基中25 ℃下培養2 d,然后在培養基上進行重復劃線,以純化菌株GCY[12]．固體BP培養基成分如下：牛肉膏1 mg/L,蛋白胨2 mg/L,四溴雙酚A 50 mg/L,瓊脂20 mg/L．利用場發射掃描電子顯微鏡(FEI Nova NanoSEM 450)觀察菌株GCY的形態．

挑取固體BP培養基中的單個菌落,溶于10 μL無菌水中,80 ℃水浴變性15 min．以離心上清液為模板進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增．TaKaRa 16S rDNA細菌鑒別PCR試劑盒用于擴增菌株GCY的16S rRNA基因,測序的正向引物和反向引物分別為RV-M和M13-47．擴增反應條件：94 ℃變性5 min,隨后以94 ℃、60 s,55 ℃、60 s,72 ℃、1.5 min為一輪,反應30輪,最終在72 ℃下延伸5 min．切割凝膠測序,回收PCR產物,即獲得菌株GCY的16S rRNA基因序列．DNA測序部分由寶日醫生物技術(北京)有限公司大連分公司完成．Blastn程序用于分析菌株GCY序列與已知的16S rRNA基因序列的同源性．除特別說明外,本文提及的所有軟件均使用默認參數．OrthoANI用于計算兩個16S rRNA基因序列之間的平均核苷酸同源性．Clustal X用于比較相關序列．使用MEGA11,基于16S rRNA基因,利用鄰近算法推斷菌株GCY的系統發育樹．

1.2 全基因組測序和注釋

利用Illumina NovaSeq PE150短讀平臺和PacBio RSII長讀平臺對菌株GCY的全基因組進行測序．PacBio RSII長讀取用于基因組組裝,Illumina NovaSeq PE150短讀取用于scaffold組裝．對低質量的reads進行過濾(<500 bp),獲得干凈數據．對照Gene Ontology(GO)數據庫、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)數據庫、Clusters of Orthologous Groups(COG)數據庫和Swiss-Prot數據庫對基因功能進行注釋．對照綜合抗生素耐藥性數據庫(Comprehensive Antibiotic Resistance Database,CARD)注釋抗性基因．采用SignalP工具預測該蛋白序列是否為分泌蛋白．

1.3 ROS產生特性

1.4 比較基因組

為進一步了解環境中生物源ROS的分布,首先在假交替單胞菌屬內進行比較基因組分析,最終以與菌株GCY基因組高度相似的Pseudoalteromonasflavipulchrastrain JG1和Pseudoalteromonaspiscicidastrain JCM 20779為代表．利用Orthovenn對3個菌株的蛋白質序列比較聚類,構建基因家族．使用Mauve計算和繪制3個菌株基因組之間保守和高度同源基因組區域的共線性．對照整合微生物基因組(Integrated Microbial Genomes,IMG)數據庫檢索上述3個菌株的ROS產生和消除相關基因．此外,利用AnnoTree(http：//annotree.uwaterloo.ca/)檢測胞外ROS產生相關酶在環境微生物中的分布．

2 結果與討論

2.1 菌株GCY鑒定與系統發育

菌株GCY在瓊脂平板上的菌落與典型的假交替單胞菌相似,呈橘黃色不透明光滑的圓形．該菌是革蘭氏陰性、兼性好氧、異養的動桿菌．場發射掃描電子顯微鏡觀察表明,菌株GCY的平均尺寸為0.4～2.0 μm．16S rRNA測序結果顯示,菌株GCY的16S rRNA序列全長1 447 bp(GenBank accession number KY 583737.1)．16S rRNA同源性分析結果顯示,菌株GCY與Pseudoalteromonaspiscicidastrain NBRC 103038和Pseudoalteromonaspiscicidastrain IAM 12932的關系最為密切．基于16S rRNA基因序列的系統發育分析結果如圖1所示,菌株GCY與Pseudoalteromonaspiscicidastrain NBRC 103038形成進化枝．平均核苷酸同源性為100%,這表明它們可能屬于同一種．

圖1 菌株GCY的系統發育樹

2.2 菌株GCY基因組特性

經過Illumina和PacBio測序得到了菌株GCY基因組的結構(圖2)．完整的基因組由Chr1和Chr2兩個染色體環組成,圖中由外到內分別為重復密度,COG、KEGG、GO基因注釋結果,ncRNAs,基因組GC含量,基因組GC偏倚值．結果表明,完整基因組由兩條環狀染色體組成,大小為5.47 Mb,平均GC含量為43.39%．全部基因總長為4.84 Mb,占基因組總長的88.5%．預測到4 626個蛋白質編碼基因、106個tRNA基因、28個rRNA基因和4個sRNA基因(表1)．氨基酸運輸和代謝(E)、翻譯、核糖體結構和生物發生(J)、信號轉導機制(T)和轉錄(K)是最豐富的COG類別．此外,在菌株GCY基因組序列中預測到了500個分泌蛋白．

表1 菌株GCY基因組特性

2.3 基于全基因組的分析

在菌株GCY基因組中還注釋到32個編碼糖基轉移酶的基因,如ftsI、ftsW、murG和rfaQ等,這些基因可能參與了菌株GCY胞外聚合物質(extracellular polymeric substances,EPS)的形成[18]．產生EPS的菌株在假交替單胞菌屬中很常見[19]．研究表明,EPS可以增強細菌對氧化應激的耐受性,從而減輕膜損傷[20]．

此外還在菌株GCY基因組中發現了adeG、mexI、mexT、mfd、msbA、PmrE、TaeA和TriC等抗生素抗性基因．在過去的幾年里,抗生素在海洋環境中被廣泛發現,以往的研究表明,抗生素可引起細胞氧化應激[21-22]．通過CARD分析,推測菌株GCY的耐藥性主要來源于外排泵機制．這種機制在革蘭氏陰性菌中普遍存在,涉及的基因包括adeG、TriC、mexT和mexI等．這些基因編碼的酶可以泵送多種抗生素,賦予菌株GCY抗生素耐藥性[23-24],同時減輕細胞的氧化應激．

綜上所述,在菌株GCY基因組中鑒別到使其兼具產胞外ROS能力與應對氧化脅迫能力的相關基因．

2.4 ROS產生特性分析

2.5 比較基因組分析

為進一步了解環境中生物源ROS的分布,首先在假交替單胞菌屬內,通過比較基因組分析了菌株GCY與其他菌株的基因組特征．以與菌株GCY基因組高度相似的Pseudoalteromonasflavipulchrastrain JG1和Pseudoalteromonaspiscicidastrain JCM 20779為代表進行基因組特征分析(圖4,表2)．如圖4所示,3個菌株核心基因組為3 737個基因,占每個基因組的90.0%～ 92.2%;菌株GCY(4 151個基因)中分別有94.3%(3 915個基因)和95.5%(3 963個基因)在菌株JG1和菌株JCM 20779中具有同源性(圖4(a)),共線性分析結果與菌株GCY、JG1和JCM 20779的密切親緣關系一致(圖4(b)),被色塊覆蓋的序列區域在基因組中完全共線和同源．中心線以下的塊表示按反向補碼(逆)方向對齊的區域．重新排列用彩色線條表示．據此推測,菌株JG1和菌株JCM 20779的基因組中也存在與胞外ROS產生和消除相關的基因．這表明與菌株GCY相似的菌株也具有產胞外ROS的潛力．同時,對3個菌株基因組中ROS相關功能基因進行檢索驗證了這一推測：3個菌株基因組中都存在編碼LAAO、Na+-轉運NADH-醌氧化還原酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的基因．有研究發現假交替單胞菌屬的其他種也能產生L-氨基酸氧化酶[25-26]和過氧化氫酶．以上分析表明具有產胞外ROS能力的微生物在假交替單胞菌屬內廣泛存在．

圖3 ROS的產生特性

(a) 3個菌株的COGs維恩圖

(b) 全基因組比對

表2 菌株GCY、JG1和JCM 20779的基因組比較

進一步利用AnnoTree(http：//annotree.uwaterloo.ca/)檢測LAAO和Na+-轉運NADH-醌氧化還原酶在環境微生物中的分布．圖5展示了具有編碼LAAO(圖5(a))和Na+-轉運NADH-醌氧化還原酶(圖5(b))基因的微生物,除了海洋生物種群外,一些存在于淡水和土壤中的微生物也具有這種能力,例如廣泛分布于土壤、淡水的假單胞菌已被證明產胞外ROS并因此被用于降解四溴雙酚A[27]．此外,研究表明與ROS產生相關的基因通過可移動遺傳元件在物種間的頻繁水平轉移有助于它們在環境中廣泛傳播[28],且胞外ROS對微生物益害并存[29],因此,有理由推測具備產胞外ROS能力的微生物可能在環境中廣泛存在．

(a) LAAO

(b) Na+-轉運NADH-醌氧化還原酶

3 結 語

本研究提供了具有產胞外ROS能力的Pseudoalteromonassp.GCY的生物學信息,鑒別了該菌株胞外ROS產生相關功能基因包括lodA、lodB和nqrA-F,抗氧化應激相關功能基因包括sod和kat等．在此基礎上通過實驗探明了氨基酸和Na+濃度是影響菌株胞外ROS產量的關鍵因素：在一定范圍內,氨基酸和Na+濃度的增大有利于胞外ROS產量的增加．研究還探明了胞外ROS產生相關基因廣泛存在于環境中的假交替單胞菌乃至各種微生物中,拓寬了對生物源ROS存在范圍的認識．綜上,本研究結果在分子水平上加深了對生物源ROS產生的理解,這為開發利用生物源ROS提供了更多啟示．此外,鑒于ROS參與環境中多種物質轉化,推測生物源ROS可能在無光區的生物元素地球化學循環中發揮了重要作用．