無機納米酶在增強作物抗非生物脅迫中的應用研究進展

徐文龍, 張志楊, 莊林林, 陳賽男, 丁子萱, 馮迎辰, 肖清波,4,5

(1.江蘇省農業科學院農業資源與環境研究所,江蘇 南京 210014; 2.農業農村部鹽堿土改良與利用(濱海鹽堿地)重點實驗室,江蘇 南京 210014; 3.江蘇農林職業技術學院畜牧獸醫學院,江蘇 鎮江 212400; 4.江蘇大學環境與安全工程學院,江蘇 鎮江 212013; 5.南京信息工程大學應用氣象學院,江蘇 南京 210044)

作物的生長發育過程往往會受到自然環境、地域差異以及人類活動的影響,人們將不利于植物生存和生長發育的非生物逆境條件稱為非生物脅迫[1]。為了適應環境,作物能在一定范圍內抵御非生物脅迫造成的傷害[2]。然而,當非生物脅迫程度超過作物的耐受極限時,其自身的抵御機制會失去作用。在這種情況下,人工調節作物抗逆能力,對農業生產和農業環境可持續發展均具有重要意義[3]。當前,調節作物抗逆性的主要途徑有篩選/培育抗逆品種、添加外源調節物質等[4]。其中,品種選育方法是通過改變作物的特性來提高作物抵抗非生物脅迫性能,該方法研究周期長、成本高。相比于品種選育,添加外源調節物質可快速提高作物的抗非生物脅迫能力,因此長期以來被廣泛使用。

植物納米生物學是近年來興起的前沿交叉學科[4-6],該學科深度融合了納米技術與植物科學,涵蓋了植物抗非生物脅迫、植物納米毒理學等多個領域[3]。納米材料具有獨特的小尺寸效應,可作為藥物/養分載體或調節劑進入作物內部,參與作物代謝,促進作物生長[7]。在眾多納米材料中,一些納米材料具有類似天然酶的催化活性,這類納米材料被稱為納米酶[8]。

2004年,Manea等[9-10]首次將具有類核糖核酸酶活性的納米Au命名為納米酶。隨后,閻錫蘊院士團隊在NatureNanotechnology上報道納米Fe3O4具有辣根過氧化氫酶(HRP)的酶學特性,可快速催化分解H2O2,且反應遵循酶促動力學(如Michaelis-Menten方程)[11]。與傳統酶類催化劑相比,納米酶具有催化活性高、成本低、易規模化生產等優點。同時,納米酶大多由無機材料構成,可在極端條件下保證自身化學結構和性能不改變,具有比天然酶更高的穩定性[12-13]。

近年有研究結果表明,納米金屬氧化物、納米貴金屬單質、納米碳基材料等作為納米酶可有效調節植物代謝,顯著提高作物的抗非生物脅迫性能、促進作物生長[14]。目前已發現,作為植物調節劑的無機納米酶通常具有類氧化還原酶催化活性,包括過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和氧化酶(OXD)[4],具體見圖1。其中,納米酶可以發揮類抗氧化酶的功能,通過催化作用將植物體內由于非生物脅迫產生的過多氧自由基或雙氧水轉化為氧氣和水,起到清除活性氧(ROS)的作用[15-18]。此外,納米酶還具有上調作物體內蛋白質表達水平[19]、絡合重金屬離子[20]、為植物生長提供微量元素等功能[21],這些都對提高作物的抗非生物脅迫性能有重要作用。然而,當前的研究綜述多偏重于介紹納米材料作為植物生長調節劑所起到的效果[22-23],缺乏對納米酶提高作物抗非生物脅迫性能的深入、系統闡釋。因此,本文著重于歸納總結針對非生物脅迫的不同納米酶類型、納米酶作用機制、施加方式、材料設計與結構優化調控等方面的研究進展,并對該領域發展前景提出建議,以期為新型納米酶開發及其在抗非生物脅迫方面的應用提供參考。

1 用于緩解非生物脅迫的無機納米酶材料類型

自2007年閻錫蘊院士團隊重新定義納米酶開始,目前已在各類仿生酶催化領域開發出超過300種納米材料[10]。盡管目前對納米酶的定義仍有爭議[24],但研究者們普遍認為無機納米酶包括納米金屬氧化物[18,25-27]、納米貴金屬單質[28-31]、碳納米管[32-33]、納米石墨烯[34]等系列材料。相比于在其他領域內的較早應用和大量開發,納米酶在緩解作物非生物脅迫上的應用直到2017年才陸續展開。下面將根據材料類型列舉近年來報道的相關無機納米酶及其抗非生物脅迫效果(表1)。

1.1 金屬氧化物納米酶

金屬氧化物納米酶是最早被發現具有酶促功能的無機納米酶,低廉的價格和簡單的合成工藝使其迅速引起人們的關注[35]。在眾多金屬氧化物納米酶中,納米FeOx可催化芬頓反應。大多數納米FeOx具有依賴于pH值的類雙酶活性,即酸性條件下表現出類POD酶活性,中性條件下表現出類CAT酶活性,從而調控細胞內的氧化還原狀態[36]。此外,鐵元素可促進植物體內葉綠素的合成,提高植物光合作用。

KOR:K+外流通道蛋白;HKT1:高親和性k+轉運蛋白;OXD:氧化酶;POD:過氧化物酶;CAT:過氧化氫酶;SOD:超氧化物歧化酶。圖1 無機納米酶用于提高作物生長與抗非生物脅迫的機制示意圖Fig.1 Mechanism scheme of the improvement of crops and anti-abiotic stress with the application of inorganic nanozymes

目前已開發出多種納米FeOx用于抵御逆境脅迫[37],包括納米Fe3O4[38]、納米γ-Fe2O3[39]、納米α-Fe2O3[40]等。2017年,Palmqvist等[39]首次將納米γ-Fe2O3作用于干旱條件下的油菜,結果表明,施加納米γ-Fe2O3后,油菜葉面中雙氧水含量下降,油菜長勢也得到提高(圖2a～圖2c)。利用共聚焦顯微鏡可清楚觀察到納米FeOx降低了非生物脅迫下的多余ROS,從而緩解植物細胞膜損傷(圖2d～圖2g)[21]。然而該研究并未報道納米FeOx的植物細胞毒性。2019年Tombuloglu等[38]對納米Fe3O4在水培大麥中的遷移轉運機制進行了研究,結果表明,高質量濃度納米Fe3O4不會對大麥產生毒害作用。透射電鏡(TEM)結果表明,納米Fe3O4主要被根細胞吸收,在莖葉部僅可在周質間隙觀察到納米Fe3O4。這說明納米Fe3O4主要富集于大麥根部,極少量轉運至葉片部位(圖2h～圖2m)。

納米CeO2是具有優異催化特性的一種稀土納米材料。2011年Celardo等[41]提出納米CeO2同時具有類SOD和類CAT的催化活性。2017年,Wu等[16]首次將聚丙烯酸包裹的納米CeO2(PNC)用于擬南芥抗鹽脅迫研究,提出納米CeO2消除ROS的能力與Ce的價態有關。隨后,該團隊考察了PNC在油菜體內的轉運及作用機制[42]。采用共聚焦顯微鏡,觀察到浸種處理下納米CeO2由種皮逐漸轉運至子葉,再進一步遷移至胚根(圖2n～圖2p)。然而,研究結果表明,納米CeO2屬于低毒或中毒性物質,會阻斷生物分子活性所必須的功能基,還可通過嗅神經通路進入腦部,導致腦部嗅球丙二醛含量升高,具有潛在生物毒性[43]。

Mn元素在植物糖酵解過程及三羧酸循環中對相關酶具有活化作用[44],且納米MnO可模擬天然酶實現抗氧化功能[7, 27]。Lu等[27]將Mn3O4納米酶作為黃瓜葉面噴施劑,在鹽脅迫下,納米Mn3O4的抗氧化性能優于納米CeO2。Mn離子進入黃瓜體內后僅在韌皮部轉運,不隨黃瓜莖干的木質部轉運至根部。此外,Ye等[44]證實,采用納米MnO作為浸種劑,可上調鹽脅迫下作物抗氧化酶相關基因的表達水平,避免ROS積累。處于作物細胞內部的納米MnO也可提高葉綠體的光合效率,增加作物的生物量[27]。

a～c分別為無納米酶處理、采用0.8 mg/ml納米γ-Fe2O3處理、采用2.0 mg/ml納米γ-Fe2O3處理的油菜實物圖[39];d～g分別為無處理空白樣水稻、25 mg/L NaF脅迫下水稻、1.0 g/L納米FeNP處理下空白樣水稻、25.0 mg/L NaF脅迫下1.0 g/L納米FeNP處理水稻的活性氧分布圖[21];h～m為1 000.0 mg/L納米Fe3O4處理后大麥葉片細胞(h～k)以及根細胞(l～m)的透射電鏡圖[38];n～p分別為油菜浸種處理后PNC在種皮、子葉和胚根中轉運的共聚焦顯微圖[42]。CW:細胞壁;PrS:周質間隙;PNC:聚丙烯酸包裹的納米CeO2;NaF:氟化鈉;FeNP:納米FeOx;Dil-PNC:熒光染料修飾聚丙烯酸包裹的納米CeO2。圖2 金屬氧化物納米酶處理作物效果Fig.2 Effects of metal oxide nanozymes on crop growth

近年來開始有將納米CuO用于緩解作物非生物脅迫的報道。納米CuO具有化學穩定性好、成本低、催化活性高等優點,已作為類POD廣泛用于生物醫學領域[53]。2020年,方清等[45]考察了納米CuO對砷脅迫下水稻種子發芽及幼苗生長的影響,結果表明,在低質量濃度納米CuO(0.5 mg/L和1.0 mg/L)作用下,水稻葉片SOD和CAT的活性都得到提高,有效抵御了砷對水稻幼苗的毒害。然而,Cu的引入可能會破壞植物細胞膜,對細胞膜上的離子通道進行抑制,使其無法吸收和轉運營養物質[54]。因此,對CuO納米酶作用的認知仍需進一步加強。

1.2 貴金屬納米酶

貴金屬納米酶涵蓋了金、銀、鉑等貴金屬,此類材料的類酶催化活性在其他領域多有報道[8,10]。貴金屬納米酶的類酶活性可隨環境pH值變化而變化[13]。在諸多貴金屬納米酶中,納米Ag可參與蛋白質和碳水化合物的合成,保護植物免受病原體的侵襲[30]。2018年,Zhang等[55]指出納米Ag會誘導作物葉片的氧化應激反應,生成ROS。值得注意的是,該團隊近期的研究結果[7]表明,引發ROS產生的納米酶可誘導激活脅迫相關信號分子/防御基因,觸發種子內部的代謝重編程,從而調動作物內在防御機制[31],增強抵御非生物脅迫能力。然而,相比于金屬氧化物納米酶[56],目前用貴金屬納米酶緩解非生物脅迫的研究相對較少,這可能與其高昂的價格及其潛在重金屬毒性有關。

1.3 碳基納米酶

碳基納米酶穩定性高、成本低、易于合成和修飾,已被廣泛用于類酶催化材料研究[57]。目前,用于緩解作物非生物脅迫的碳基納米酶主要有納米石墨烯[31]、碳納米管[31]、納米富勒烯[49]、碳量子點[58]等。

Song等[59]于2010年首次發現羧基修飾的納米氧化石墨烯(GO-COOH)具有類POD酶活性,可催化H2O2與亞甲基藍產生反應。自此之后,以納米石墨烯等作為納米酶的研究十分廣泛[60]。目前,納米氧化石墨烯(GO)及其衍生物在作物抗脅迫領域的應用主要集中在抗旱脅迫[46]和抗鹽堿脅迫[34, 61]。Chen等[34]提出在120 mmol/L鹽脅迫下施加微量納米石墨烯(0.5%),可調控紫花苜蓿體內與激素信號轉導、光合作用、呼吸/轉錄調控等途徑相關的基因,促進抗氧化還原系統和光合作用等相關基因的快速表達,提高紫花苜蓿的抗鹽脅迫能力。納米石墨烯及其衍生物的質量濃度對作物抗脅迫性能有較大影響,極微量的GO(2 mg/L)即可提高樹莓的抗氧化酶活性,抵御鹽脅迫[51]。然而GO與細胞相互作用,易使作物細胞中的ROS濃度增加,反而抑制作物生長,這可能與納米石墨烯具有類POD酶活性有關[62]。

碳納米管(CNT)可視為無縫卷起的納米石墨烯層,有著極強的抗菌性,根據單根CNT上所含石墨烯層數可分為單壁CNT(SWCNT)和多壁CNT(MWCNT)。CNT具有超強剛度、優異的拉伸性和良好的生物相容性[63]。CNT對水具有高吸附能力,可促進作物對水分的吸收,提高種子的發芽率,利于根系及幼苗的生長[64]。有研究結果表明,SWCNT可通過提高電子轉移速率及葉綠體的光能利用率來增強植物的光合作用[4, 33, 65]。MWCNT則可提高Cd脅迫下玉米的發芽率[33]。2021年Chen等[33]報道了MWCNT浸種緩解玉米Cd脅迫的作用機制,MWCNT可誘導提高植物細胞壁與種皮的通透性以及水通道蛋白的基因表達,增強種子對水分的吸收。碳納米管表面帶有負電荷的官能團也可用于吸附和鈍化游離Cd2+,降低Cd2+對玉米的生物毒性,從而提高玉米的抗Cd脅迫能力。然而,Gong等[66]提出MWCNT對Cd脅迫下作物生長的影響具有質量濃度依賴性,高質量濃度MWCNT(超過5 000 mg/kg)可引起植物細胞毒害,加劇Cd脅迫,這可能是因為高質量濃度的納米粒易于團聚,抑制根的呼吸作用或者擾亂作物與環境的正常物質交換。

納米富勒烯具有高度對稱的球形結構,也是一種重要的碳基納米酶材料,該類材料易于修飾,可作為電子受體,起到類SOD的作用[65]。然而,目前主要利用該類材料的高度親水性和生物相容性,研究的重點也集中于抗干旱脅迫[49]。關于納米富勒烯的酶促活性尚未見于文獻,對于該領域仍需進一步探索。

碳量子點(CDs)具有較好的生物相容性、低毒性及水分散性,其表面豐富的官能團可參與生物代謝過程,并具有較好的ROS清除功能[67]。劉振玲等[68]研究了CDs對作物種子萌發及生長的影響,發現引入CDs可增加菠菜幼苗的生物量,且上調了菠菜種子水通道蛋白基因的表達水平,提高了作物對水分的吸收。2021年,Li等[50]考察了葉面噴施CDs對鹽脅迫下生菜抗逆性的影響,結果表明,CDs可起到類SOD作用從而消除ROS。當CDs投入量為2 mg/ml時,生菜的生物量和吸水量均得到顯著提高,丙二醛含量下降了92.2%。隨后,Li等[58]考察了鹽脅迫下水培施用CDs后甘薯的生長狀況,發現施加CDs可顯著降低甘薯根細胞ROS水平,并提高甘薯的耐鹽、耐低鉀、耐低鐵能力。有研究結果表明,CDs表面-OH和-COOH官能團能夠被植物中凝集素受體激酶(LecRKs)感知并促進cAMP/cGMP積累,激活環核苷酸門控離子通道(CNGCs),引起不依賴ROS的Ca2+富集,增強Na+/H+逆向運輸活性、HAK5介導的高親和性K+吸收活性和IRT1介導的Fe2+的吸收活性,最終提高了甘薯在多重環境脅迫下的抗逆性。

2 納米酶在作物抗非生物脅迫中的作用機制

在實際農業生產中,最常面臨的環境非生物脅迫種類有干旱、凍害、水澇、鹽堿以及土壤重金屬脅迫等[1]。當作物處于逆境時,植物體內的自由基平衡狀態被打破,導致活性氧積累,破壞植物細胞脂膜,抑制作物生長,這使得不同非生物脅迫下都需要用納米酶消除過量ROS[3]。此外,不同逆境對作物也具有各自獨特的作用機制。其中,干旱引起作物缺水、細胞膜和細胞核受損,從而造成代謝紊亂,光合作用減弱,抑制葉片和根生長[47]。凍害脅迫則會損傷作物細胞的膜結構,引起酶活性改變,破壞其生理生化過程。當溫度低于零下時,作物細胞內形成的冰晶會破壞膜結構[69]。當作物面臨鹽堿脅迫時,高質量濃度鹽離子對細胞的滲透作用造成作物吸水困難,形成生理性干旱,抑制細胞生長,同時還可破壞生物膜,降低作物的蛋白質合成速率,造成生理紊亂[25]。隨著工業發展而大量進入土壤的有毒重金屬離子會在植物體內累積,并破壞作物基因組正常復制轉錄,抑制植物光合作用;由重金屬離子帶來的氧化應激也會進一步損傷細胞膜[70]。除了作為ROS清除劑,針對不同種類的非生物脅迫,納米酶還發揮特定作用。

當前,人們尚未完全了解納米酶對作物的作用機制。基于抗逆植物生理學的研究現狀,不同的納米酶具有不同的功能,能夠從不同角度緩解非生物脅迫,主要作用機制可歸納總結如下:第一,作為外源類酶催化劑,主動清除作物體內積累的ROS;第二,調整內源抗氧化系統表達,促進作物體內抗氧化物質的生成;第三,維持細胞質Na+/K+平衡,避免Na+在植物細胞內的積累;第四,提高作物保水能力,維持滲透壓平衡;第五,調節土壤重金屬吸收,避免重金屬累積。

2.1 作為外源類酶催化劑主動清除ROS

ROS是非生物脅迫下植物代謝過程中不可避免的副產物,主要以超氧化物自由基(O2·-)、羥基自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)以及單線態氧(1O2)的形式存在[19]。在正常植物細胞內,ROS可作為信號分子,參與細胞增殖等相關生理生化反應,如降解種子體內內源性抑制劑、解除種子休眠、誘導內源乙烯的產生、促進根尖細胞生長等[71-72]。然而,ROS過量積累則會加速植物細胞膜脂過氧化鏈式反應,造成蛋白質交聯失活、DNA鏈斷裂以及光合作用受阻,甚至導致植物死亡[7]。一般情況下,植物體內的抗氧化酶系統可將植物體內的ROS水平自我調節為平衡狀態[73-74]。其中,SOD負責去除O2·-,把O2·-還原轉化為H2O2。CAT負責去除H2O2,將其分解成H2O和O2。然而,在非生物脅迫作用下,植物體內的自由基平衡狀態被打破,導致ROS積累[1]。因此,消除植物體內多余ROS是維持其正常生長的重要途徑。具有氧化還原功能的納米酶可以調控ROS的產生或清除,維持植物體內由非生物脅迫引起的氧化還原平衡。值得指出的是,由于無機納米材料能夠暴露不同晶格、晶面以及空位等不同活性位點,所以與性能單一的傳統生物酶相比,一種納米酶可能同時具備幾種類酶活性[75]。例如,SOD納米酶往往也同時具有CAT酶活性,2種功能協同作用能夠更高效地清除ROS,具有優于天然SOD或抗氧化小分子的催化性能[76]。以氧化鈰(CeO2-x)納米酶為例[16,26],當CeO2-x中Ce3+/Ce4+較低(35.0%)時[16],Ce3+可與OH·反應生成OH-,繼而與植物細胞中的H2O2在Ce4+催化下發生反應生成氧氣和水,相關反應式如下:

Ce3+?Ce4++e-

Ce3++OH·→Ce4++OH-

Ce4++ O2·-→Ce3++O2

H2O2+ 2Ce4++ 2OH-→2H2O+O2+Ce3+

然而當Ce3+/Ce4+較高(60.8%)時,則難以與H2O2發生反應,造成植物細胞中H2O2積累,無法起到抵御非生物脅迫的作用。因此,選擇合適的納米酶對于維持非生物脅迫下的氧化還原平衡至關重要。

2.2 調整內源抗氧化系統表達

除了直接消除ROS外,某些納米酶還能上調植物體內合成抗氧化酶的基因表達。例如,PNC作為浸種劑可上調合成抗氧化酶、淀粉水解酶、激素合成酶等的基因表達,提高作物的抗非生物脅迫能力[42]。Chen等[25]采用RNA Seq測序技術檢測發現,鹽脅迫下黃瓜中抗氧化酶的過表達源于PNC上調了相關基因的表達水平。然而,納米酶對不同植物葉片和根系抗氧化酶的作用效果與機制不盡相同。例如,PNC處理后黃瓜葉面及根部的抗氧化酶相關基因的表達水平均得到了上調(圖3a～圖3b)[25],而在對擬南芥進行處理后,其葉片細胞中合成抗氧化酶相關上調基因數要小于下調基因數(圖3c)[77]。對于棉花,PNC則主要通過上調POD和谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)相關的基因表達來提高其抗鹽脅迫性能(圖3d～圖3e)[52]。除了植物細胞中合成的抗氧化酶可直接消除ROS外,代謝過程中生成的NO也可有效消除ROS。最近有研究結果表明,在水稻水培過程中添加PNC可誘導水稻NIA2基因的過表達,增加鹽脅迫下細胞中的內生NO產率,從而增強水稻抗鹽脅迫能力[6]。因此,納米酶可通過多種方式上調作物基因表達,提高非生物脅迫下作物內源去除ROS能力。

a～b:采用不同施加方式時PNC處理對黃瓜葉(a)與根(b)中基因(RNAseq)表達的影響[25];c:采用不同施加方式處理時黃瓜葉與根中SOD、POD和CAT相關基因表達熱圖分析[25];d:PNC上調鹽脅迫棉花幼苗發育的相關基因表達示意圖[52];e:PNC處理棉花中氧化還原酶相關基因表達熱圖分析[52]。ROS:活性氧;GST:谷胱甘肽轉移酶;PRX:過氧化物還原酶;PNC:聚丙烯酸包裹的納米CeO2。SOD:超氧化物歧化酶;POD:過氧化物酶;CAT:過氧化氫酶。圖3 納米酶處理對作物內源抗氧化系統表達的作用效果Fig.3 Effects of nanozyme treatment on endogenous antioxidant system expression in crops

非生物脅迫過程中形成的ROS會影響葉綠素的合成,破壞光系統II反應中心,抑制PSII原初光能轉換效率,造成光能利用率下降。Tombuloglu等[38]發現在大麥水培過程中引入納米Fe3O4可以上調光系統I P700蛋白和光系統II D1蛋白編碼基因psaA和psbA的表達水平,提高植物體內光合色素的含量,增加葉綠體數量,促進植物的光合作用,有利于逆境脅迫下的作物生長。Khan等[42]發現,浸種處理使PNC進入油菜種子,可顯著上調α-淀粉酶編碼基因AMY1的表達水平,增強α-淀粉酶的活性,提高胚乳中淀粉的水解率。作物體內可溶性糖含量顯著上升,為種子提供更多養分,可有效抵御非生物脅迫。

此外,采用PNC作為浸種劑可影響油菜體內的激素水平,明顯觀察到編碼水楊酸生物合成的基因SARD1和PAL表達水平出現上調[18]。浸種后,胚芽和胚根中PAL基因的表達水平在200 mmol/L NaCl鹽脅迫下分別提高了122.0%和228.0%,胚芽中水楊酸含量提高了63.2%。可見,無機納米酶對作物基因表達的調控具有多樣性。

2.3 維持胞質Na+/K+平衡

當植物面臨鹽脅迫時,Na+可在植物細胞內不斷積累,破壞細胞內離子平衡和代謝,對作物生長有直接毒害作用。由于Na+的吸收主要通過高親和K+轉運載體蛋白(HKT)以及非選擇性的K+外排通道蛋白(NSCC)完成,因此維持細胞質中低Na+/K+是植物抗鹽脅迫的關鍵[78]。2018年,Wu等[15]研究了PNC對擬南芥抵御鹽脅迫性的影響,發現消除植物細胞中累積的ROS可防止植物細胞膜上NSCC被激活,有效避免K+流失。隨后該團隊進一步對水稻的基因組學分析后發現,納米CeO2處理的植株中Na+和K+轉運蛋白均得到了增強[6, 17]。但植物細胞中外向整流鉀離子通道蛋白(KOR1)受到了抑制,提高了葉肉中K+的持留能力,從而維持細胞的Na+/K+平衡。此外,細胞質中保留的K+也可作為營養成分促進鹽脅迫條件下的作物生長。

2.4 提高作物保水能力

當作物處于干旱或鹽漬等非生物脅迫時,細胞會被動地失去部分水分,致使其面臨滲透脅迫。維持滲透壓平衡是緩解這些非生物脅迫的關鍵。無機納米酶可通過2種方式維持作物細胞內的滲透壓平衡。第一種方式是無機納米酶上調參與滲透調節的基因表達,提高滲透調節物質的濃度,保證作物的正常生長。例如,細胞中的脯氨酸可起到滲透調節作用,維持細胞膨壓、防止細胞脫水[28]。Khan等[18]發現,PNC可上調參與合成脯氨酸的吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)的相關基因表達水平,抵御逆境脅迫。同時,納米酶還可抑制細胞中游離的脯氨酸分解,使脯氨酸在作物體內大量累積[46,79]。此外,有研究結果表明,利用無機納米酶(納米Au[29]、PNC[42]、納米氧化鐵[80]等)作為浸種劑時,植物細胞中水通道蛋白相關基因的表達水平得到上調,水分吸收能力增強,作物在鹽堿脅迫以及干旱脅迫下的抗逆能力提高[22,42]。第二種方式是無機納米材料中豐富的孔道結構使其對水分子具有較強的結合能力,從而起到持水作用[61]。2016年,Borisev等[49]將納米富勒烯醇[C60(OH)24]作為葉面噴施劑用于研究其在甜菜抗干旱脅迫中的作用。在對作物細胞中脯氨酸含量進行考察后發現,甜菜中的脯氨酸含量在處理前后變化不大,這說明甜菜的抗逆能力主要源于納米富勒烯醇對水分子的強吸附作用。此外,納米材料容易在作物體內傳輸,可有效促進甜菜對水分的吸收,維持作物細胞的滲透壓平衡。

2.5 調節作物對土壤重金屬離子的吸收

土壤中的重金屬離子多指汞、鎘、鉛、鉻、砷等具有顯著生物毒性的金屬元素[81]。土壤中的重金屬含量高于一定程度時,植株的生長會變慢,甚至死亡。此外,有毒重金屬離子在作物體內的累積最終會通過食物鏈危及動物和人類[20, 66]。加入特定納米酶可固化重金屬離子,提高某些植物對重金屬的吸收去除能力。例如,Gong等[32]發現在根部施加多壁碳納米管可有效提高苧麻在Cd污染土壤中的生長效率。采用500 mg/L MWCNT處理后,Cd更易從苧麻的根部轉運至莖葉中,根部Cd質量濃度顯著下降。這是因為MWCNT易在植物體內轉運,其表面的負電荷及官能團與Cd結合,增加了Cd的吸收。與此相反的是,方清等[45]研究發現,添加少量的納米CuO可減少水稻幼苗對三價砷的吸收。這是由于納米CuO可在水中吸附砷,提高砷脅迫下水稻種子的發芽率、幼苗根葉長度及干質量。

3 納米酶施用方式對非生物脅迫的影響

當前,可通過多種方式施用無機納米酶,包括浸種處理、葉面噴施、根部施肥等。由于植物不同部位對納米酶的吸收、傳輸及累積效果存在差異,所以不同施用方式也影響納米酶的實際作用效果。

3.1 浸種處理

種子發芽是作物生長周期的起始階段,非生物脅迫下的種子發芽率及相應的萌發活性對后續作物生長有重要影響[23]。浸種處理可促進種子萌發并提高幼苗抗性。浸種時,納米酶可在種子吸水階段經滲透壓進入種皮部位,萌發階段在細胞吸附、內吞等多種作用下傳輸或累積在作物不同部位[82]。

關于無機納米酶作為浸種劑的綜述可見相關文獻[22-23]。浸種處理處于作物生長的早期階段,只需少量納米酶即可起到較好效果,是當前施用納米酶的常用方法。由于發芽階段的作物比較脆弱,納米酶通常在較小的質量濃度范圍內發揮作用[18]。使用無機納米酶作為浸種劑時尤其要注意其使用量,過量的納米酶往往會造成負面影響。此外,納米酶的作用效果受浸泡時間影響較大,實際操作中應注意根據作物品種和納米酶種類確定浸種時間和浸種質量濃度[42]。

3.2 葉面噴施

葉面噴施是常用的納米酶施加方式,往往在作物生長的早中期發揮作用。噴施之后的納米酶可從葉面氣孔進入植物體內,并轉運至細胞內部[83]。相比于根部施用,葉面噴施納米酶顯示出更高效的抵御非生物脅迫性能。Chen等[25]通過對比納米CeO2在黃瓜幼苗葉面噴施和根部施用作用效果的差異,發現納米CeO2可以被作物葉面和根系很好地吸收,但相比于根部施用,葉面噴施更易上調黃瓜的氧化還原酶活性,能夠更好地緩解鹽脅迫,這可能與納米CeO2經葉面噴施后在植物體內的轉運效率高有關。相比于浸種處理,葉面噴施需要的納米酶量較多。有研究發現,在作物生長的不同階段將納米酶浸種和葉面噴施聯合使用,能起到更好的作用效果[84]。

3.3 根部施用

相比于浸種處理和葉面噴施,根部施用納米酶效果較差。一方面是因為根部施用的納米酶容易被土壤中的膠體成分所吸附、固化;另一方面是因為納米酶往往累積在根莖部位,無法在其他部位發揮作用[38]。與此同時,采用根部施肥的處理方法還需考慮納米酶對土壤菌群的毒害問題[21]。2022年,Chen等[25]比較了根部施用以及葉面噴施PNC緩解黃瓜鹽脅迫的效果,結果表明,葉面噴施處理下黃瓜幼苗抗氧化還原酶的酶活性提高幅度優于根部施用。對處理后黃瓜植株中PNC含量進行考察,發現葉面噴施處理下保留的Ce含量遠高于根部施肥處理。說明采用根部施用方式時,作物對納米酶的吸收效率較低,這可能與納米酶在作物木質部和韌皮部的轉運效率不同有關[77,85]。

4 功能納米酶的設計與結構優化

納米酶緩解植物非生物脅迫是納米酶與植物間復雜的物理、化學、生物作用過程。要想更好地發揮納米酶的功能,需要對其物理化學性能(包括類酶活性、粒徑大小、表面配體與分散性等)均有清晰的認識。基于當前人們對納米酶的研究,對抗非生物脅迫納米酶的設計與結構優化原則進行歸納總結。

4.1 調控類酶類型與活性

能夠在非生物脅迫下清除作物體內積累的過量ROS、維持氧化還原酶活性是納米酶的最大特點。然而,作物體內ROS種類繁多,包括羥基自由基、超氧自由基、雙氧水等,氧化還原酶也包括SOD、CAT、POD等。維持ROS和氧化還原酶系統的平衡并不單純是將某一種ROS的濃度或某一種酶的活性調控在一定水平,而是需要根據作物種類、具體所受脅迫情況以及作物體內的生化水平,選擇或設計合理的納米酶以高效發揮其抗逆作用。例如,Djanaguiraman等[86]指出干旱脅迫下納米酶主要通過消除高粱體內的O2·-和H2O2來維持ROS和氧化還原酶系統的平衡,Wu等[15]則發現,鹽脅迫下納米酶主要通過去除擬南芥體內的羥基自由基來激活氧化還原酶系統。因此,對納米酶去除ROS性能的不同要求與作物種類及其所受的脅迫類型均有關。

此外,作物體內的氧化還原酶系統對納米酶的響應也有差異。例如,納米CeO2在作物體內主要起到類SOD和類CAT作用[16]。然而,GO在生物體內起到類POD的作用,導致·OH含量上升[11, 62]。越來越多的研究結果表明,納米酶在作物細胞中具有多重類酶活性[37]。例如,納米Fe3O4進入細胞后,溶酶體的酸性環境可引發其類POD酶活性,催化H2O2生成·OH;而在細胞質的中性環境中,納米Fe3O4則表現出類CAT、類SOD的作用,從而清除脅迫產生的H2O2以及·OH[11, 87]。更深入的研究發現,作物體內SOD根據其所含金屬類型可細分為Fe-SOD、Mn-SOD、Cu-ZnSOD等,在鹽脅迫下油菜體內的納米CeO2主要提高Cu-ZnSOD活性,但對Fe-SOD、Mn-SOD的活性則無明顯影響[26]。因此,需要根據作物特定的需求,設計相應的納米酶。

4.2 調控納米酶粒徑大小和分散性

納米酶需要合適的尺寸以便進入植物體內。植物細胞與動物細胞不同,不但包括細胞膜、細胞質、細胞核,最外層還存在有細胞壁。細胞壁的主要成分是纖維素,纖維素交錯排列形成直徑低于20 nm的細胞壁孔[88]。細胞壁在保護細胞抵御外來物質侵害的同時,也阻礙了納米酶的進入。因此,所設計的納米酶粒徑最好小于細胞壁孔,以便其能穿過細胞壁進入植物細胞內部。當前,鐵納米酶、氧化鈰納米酶的粒徑可達到10 nm以下,能夠通過細胞壁孔快速進入植物細胞內部[16, 26]。然而,Prerna等[40]利用粒徑為100 nm左右的納米α-Fe2O3對水稻種子和玉米種子進行浸種處理,并利用異硫氰酸熒光素(FITC)標記示蹤納米α-Fe2O3所在的位置。種子發芽后,納米α-Fe2O3均累積在水稻和玉米根部的表皮和細胞壁,這說明納米酶還可在植物細胞外部發揮作用。

納米酶在植物體內的分散性對其性能也有很大影響。即使是粒徑很小的納米酶,若發生團聚會形成尺寸較大的表觀粒徑,不僅影響其在作物體內的吸收和傳輸,還可能改變其類酶活性[66]。當納米酶的尺寸因團聚而增大,導致其無法穿過種皮,則會抑制作物產率,同時引入新的脅迫[44]。納米材料的分散性對周圍環境十分敏感,溶液物質種類、含量、pH值等的改變均會影響納米材料的分散性。植物體內環境復雜多變,納米酶的分散狀態與外部模擬環境可能存在較大差異。植物體內的ROS濃度、酶活性、pH值等微環境會隨外部環境變化而動態變化[20],這些都成為納米酶設計過程中需要考慮的影響因素[16]。

4.3 調控納米酶表面電荷狀態

除了進行粒徑控制,表面電荷狀態也是納米酶設計中需要考慮的因素[60]。納米酶表面狀態不但影響類酶活性,對粒徑分散性與傳輸性也有重要影響。例如,相對于電中性納米酶,表面正電荷或負電荷納米酶更易借助粒子間靜電作用獲得優良的分散性[60]。由于植物細胞的脂質雙層膜帶電荷,表面荷電的納米酶更易穿透脂質雙層膜進入葉綠體[89]。荷電納米酶與脂質雙層膜接觸首先造成雙層膜軟化,形成延流態[65]。這一過程有利于納米酶穿透脂質層進入葉綠體。然而,相比于帶正電荷的納米酶,帶負電荷的納米酶與葉綠體共定位的比例幾乎是其2倍[16],這可能與納米酶的ζ電位和質膜電位的相互作用有關(圖4a)。

此外,荷電狀態會影響納米酶在植物體內的傳輸和累積[56]。Spielman-sun等[85]以粒徑4 nm的納米CeO2為研究對象,發現表面呈正電的納米酶易與呈負電的細胞壁互相吸附,富集于植物根部。相比之下,表面呈負電或電中性的納米酶則更易由根部擴散至葉片(圖4b～圖4d)。由于納米酶表面配體與植物不同部位復雜的相互作用,不同表面電荷狀態的納米酶傳輸途徑截然不同。在納米酶的設計過程中需要考慮表面電荷狀態與作物體內微環境的相互作用,未來可對納米酶進行特異性表面修飾,將其傳送至特定部位。

5 結論與展望

納米酶是近十幾年來由中國科研人員提出并主要發展的一類新型納米催化材料,是涉及材料學、催化化學、醫學、生命科學等多學科交叉的新興研究領域。隨著植物納米生物學的發展,納米酶在抵御作物非生物脅迫方面顯現出巨大潛力,吸引了越來越多研究者的關注,不論在理論還是實際作用效果方面都取得了較大的研究進展。然而總體來看,納米酶促進作物生長的研究仍處于起步階段,因此本文對該領域的進一步發展提出了如下展望:

第一,全面認識無機納米酶在抵御非生物脅迫中的作用機制。近年來,納米酶抵御非生物脅迫機制的研究越來越引起人們重視,從關注納米酶的催化去除ROS性能逐漸擴展到調控內源抗氧化酶系統平衡、維持滲透平衡、調控基因表達、調整代謝過程等作物生理生化及分子機制的響應。但植物內部生長代謝系統十分復雜,當前對于納米酶的研究往往只考慮單一或少數幾種影響因素,尚未對其在抵御非生物脅迫中的作用機制有全面認識,對納米酶發揮作用的確切機理尚不明確。后續除了需繼續深入研究納米酶的作用模式,還需揭示與植物生理相關的復雜分子機制甚至精準調控相關基因表達,對所觀察到試驗現象的理解和解釋還需綜合考慮作物種類、處理條件、納米酶特性、逆境環境以及納米酶使用量等多種因素,才能找到納米酶在抵御非生物脅迫中的準確作用規律。

a:葉綠體中納米氧化鈰的熒光共定位分析圖[16];b～d:采用20 mg/L納米氧化鈰水培處理34 h后Ce在小麥根部(b)、葉面(c)、葉尖(d)的元素分布圖[85]。PNC1、PNC2表示負電荷CeO2;ANC表示正電荷CeO2;CeO2(+)表示正電荷CeO2;CeO2(0)表示中性CeO2;CeO2(-)表示負電荷CeO2;ROI表示感興趣區域。圖4 不同表面電荷狀態的納米酶在作物體內的分布狀態Fig.4 Distribution of nanozymes with different surface charge states in crops

第二,加強對納米酶的定向設計和性能優化。在對納米酶作用規律深刻認識的基礎上,未來對納米酶的開發研究需要更注重根據作物需求加強定向設計和性能優化。通過近十幾年持續不斷的研究,已經發現眾多種類的納米酶能夠有效抵御非生物脅迫。但相比于其在催化化學、檢測以及生物醫學等領域中的蓬勃發展,納米酶在植物和農業中的應用探索仍處于跟隨者地位,多數無機納米酶材料是從非農業領域照搬過來的。這一方面是由于納米酶作為新興學科本身就發源于材料、催化、生物醫學等領域的交叉研究,另一方面也是因為前期缺乏對納米酶作用規律的深刻認識。隨著研究者對納米酶抵御非生物脅迫作用規律認識的加深,使得對納米酶的開發研究有條件從現有納米催化材料的簡單篩選,轉向根據作物特定需求對納米酶進行定向設計和性能優化,促進納米酶在農業領域的進一步發展。例如,可通過納米酶表面分子的選擇性修飾使其被吸收傳輸至作物的特定部位,根據脅迫作用下作物體內累積ROS的類型和受抑制氧化還原酶的種類合理調控納米酶種類和活性以及設計多功能納米酶,在具有類酶活性的基礎上兼具吸附固化重金屬、負載功能性小分子等作用,都是未來值得發展的研究方向。

第三,加強對納米酶的生態環境效應研究。隨著納米生物技術的發展,人們已經研究了多種新型納米酶,未來納米酶的種類還將持續增加。然而,當前對納米酶的農業應用大多處于實驗室階段,要想推進納米酶的實際應用,需進一步明確其生態環境效應。目前已知能夠較好緩解非生物脅迫的納米酶大多有重金屬成分,如Ce、Mn等。雖然納米酶在浸種或葉面噴施中的成本可控、用量較小,但長期施用對生態環境的影響仍不明確。當前,由于鐵納米酶具有較好的環境安全性和較低的使用成本等特性,已經在開展大規模田間試驗了。未來對于新型納米酶的開發可更多使用對生物環境危害較小的元素類型。

總之,隨著近年來植物納米生物學的進一步發展,無機納米酶材料在緩解作物非生物脅迫的研究中已經表現出巨大的應用潛力,這對于推進納米技術與農業生產的有機結合,助力農業可持續發展有著重要意義。