H9亞型禽流感廣譜亞單位疫苗抗原設計及其免疫效力

張雪花, 王衛華, 武 奇, 李 丁, 平繼輝, 梅 梅

(1.江蘇省農業科學院動物免疫工程研究所/國家獸用生物制品工程技術研究中心/江蘇省食品質量與安全重點實驗室,江蘇 南京 210014; 2.獸用生物制品<泰州>國泰技術創新中心,江蘇 泰州 225300; 3.南京農業大學動物醫學院,江蘇 南京 210095)

中國于1994年在廣東分離出第一個H9N2病毒。中國提供的數據中(全球共享所有流感數據倡議,GISAID)H9N2分離株超過70%。最新的活禽市場監測結果顯示,2014-2022年H9N2分離率持續居高不下,H9N2亞型逐漸超越其他亞型,成為家禽中最主要的亞型,同時也成為養禽業的頭號感染源[1-2]。大多數感染H9N2 AIV(亞型禽流感)的雞不會直接死亡,從而保留了二次感染其他亞型流感病毒的機會,促進了病毒重組。H9N2禽流感病毒作為“供體病毒”,為包括H3N8、H5N1、H7N9、H10N8和H10N3在內的各種病毒亞型提供多個內部基因[3-6]。H9N2 AIV繼續傳播和進化將進一步增加它作為新AIV基因供體的風險。盡管H9N2 AIV對禽類的致病性不強,但當與家禽中的其他病原體發生共感染或繼發感染時,會造成重大經濟損失[7-9]。

1998年,中國廣東報道了世界首例人類感染H9N2禽流感病毒的病例[10]。截至2021年12月,在全球報告中,人類感染H9N2禽流感病毒確診病例已達95例,其中2020-2021年報道的33例病例中有32例來自中國,證實了H9N2禽流感病毒存在宿主溢出的高風險[11]。可見H9N2不僅給家禽業造成嚴重的經濟損失,也對人類健康構成重大的威脅,是重要的人獸共患病病毒。

H9型AIV與H5、H7型高致病性禽流感的控制策略不同。雖然沒有強制接種H9N2禽流感疫苗,但幾乎所有雞群都接種了H9疫苗,以減少潛在的經濟損失。中國獸藥基本信息數據庫數據表明,在過去5年中,全國大約有50家生物公司生產了單價或多價H9N2疫苗。經認證的H9疫苗相關產品中,疫苗株多達25株,且均為全病毒滅活疫苗。研究和臨床數據表明,接種H9N2疫苗可以減少病毒感染引起的臨床癥狀,為免疫雞群提供有效保護。然而,H9N2頻繁的抗原漂移是當前H9N2疫苗接種的挑戰之一。當H9N2疫苗毒株與流行毒株之間的抗原性存在差異時,全病毒滅活疫苗無法提供足夠的保護[12]。H9N2疫苗需要優化毒株以適應當前病毒變異、多抗原群共流行的情況。重要的是,H9N2滅活疫苗主要誘導體液免疫,難以阻斷雞上呼吸道的病毒感染和排毒。H9N2 AIV能夠有效地在雞與雞之間進行氣溶膠傳播,即使在接種疫苗的雞之間也是如此[13],加大了病毒防控難度。因此,“防排毒”成為H9N2新型疫苗研制的新標準和又一挑戰。目前迫切需要開發更高效的疫苗來防控H9N2,例如在細胞和黏膜免疫水平上改進現有疫苗,或開發廣譜疫苗以應對抗原的頻繁變異[14]。

本研究室擬通過對H5亞型AIV的血凝素(HA)蛋白質序列進行比對分析,設計出HA共有序列,制備成HA亞單位疫苗,效力試驗結果證明,HA亞單位疫苗對不同流行毒株具有理想的保護效果[15-16]。基于以上研究成果,本研究同樣選擇具有免疫原性的HA基因,通過對2010-2019年H9亞型AIV HA蛋白關鍵性氨基酸位點進行分析和統計,選擇每個位點最高頻率氨基酸序列,并對關鍵性抗原位點進行校正,設計出HA(H9亞型)共有序列[16],利用桿狀病毒表達系統表達HA蛋白。免疫效力試驗結果表明,該疫苗具有良好的、廣譜的免疫效果,為后續廣譜疫苗的研究提供了研究數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本實驗室于2017-2019年在浙江、安徽、江蘇和山東等省份的養雞場分離篩選H9亞型AIV毒株 115、236、YZ,經進化樹分析,3個毒株屬于h9.4.2.5分支的不同亞分支。H9亞型禽流感代表性毒株[A/chicken/Shandong/6/1996 (h9.4.2.3)(SD/6)、A/chicken/Guangxi/55/2005 (h9.4.2.5)(GX/55)、A/turkey/Wisconson/1/1966 (h9.1)(WI/1)]由南京農業大學平繼輝教授惠贈。桿狀病毒表達系統為本實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 目的基因的設計 對2010-2019年公布的H9亞型AIV HA蛋白的抗原相關位點、受體結合位點、潛在糖基化位點等關鍵序列進行分析,結合本試驗室分離的H9流行株關鍵性氨基酸位點,利用生物信息學軟件選擇高頻氨基酸,并對關鍵性位點進行校正,設計合成基因HA。

1.2.2 重組桿狀病毒的獲得與鑒定 利用桿狀病毒表達系統構建和制備含有目的基因HA的重組桿狀病毒,經藍白斑篩選獲得含有HA基因的重組質粒。用HA重組質粒轉染Sf9細胞,27 ℃靜置培養,每天觀察,待轉染細胞出現停止生長、變圓、脫落等細胞病變癥狀時,收獲,得到重組桿狀病毒rVHA。提取rVHA基因組DNA,然后進行PCR鑒定。PCR鑒定正確后,取重組病毒rVHA上清液接種Sf9細胞,觀察4 d,固定細胞,進行間接免疫熒光鑒定重組病毒特異性。

1.2.3 重組蛋白的表達、分析 取重組桿狀病毒rVHA上清液,接種懸浮培養的high five細胞,同時將野生型桿狀病毒感染high five細胞作為對照。每天取少量細胞液進行臺盼藍染色,觀察細胞死亡情況,待細胞90%變藍后收獲,利用高壓均質機將細胞破碎,進行Western-Blot、血凝活性等分析。

1.2.4 紅細胞凝集試驗檢測重組蛋白HA血凝活性 在微量血凝板上先加25 μl 磷酸緩沖鹽溶液(PBS);第一孔加25 μl重組蛋白(rHA)混勻,倍比稀釋至216;每孔再加入25 μl PBS、25 μl 1%雞紅細胞懸液,室溫(20～25 ℃)下反應30 min,記錄結果。

1.2.5 重組桿狀病毒傳代后遺傳穩定性及增殖性能鑒定 將重組桿狀病毒rVHA連續傳代至第8代,對每代HA基因的核酸序列進行測序。對每代重組桿狀病毒進行病毒滴度(TCID50)鑒定,評價重組桿狀病毒的增殖性能。

1.2.6 交叉血凝抑制試驗(HI) 檢測rHA與不同分支H9亞型AIV病毒陽性血清(115、236、YZ、SD/6、WI/1)的交叉反應活性,設無特定病原(SPF)陰性血清為對照。

1.2.7 重組蛋白的免疫原性評價 重組蛋白rHA與白油按體積比1∶3乳化制備成HA油乳劑疫苗。乳化完全后,經性狀、穩定性和無菌檢驗后,無菌裝入疫苗瓶內,命名為rHA疫苗,4 ℃保存。

10日齡SPF雞30只,分3組,每組10只雞。第一組,rHA疫苗組,頸部皮下注射rHA疫苗,每只注射0.5 ml;第二組,商品疫苗組,每只注射0.3 ml;第三組,陰性對照組,每只注射0.5 ml無菌生理鹽水。免疫后第14 d、21 d、28 d 采血,分離血清,檢測血清HI抗體效價。免疫28 d后,選取2株處于不同亞分支的H9亞型AIV流行毒株115和YZ株進行攻毒,每只攻毒劑量為1×106.0EID50(半數雞胚感染量)。每日觀察雞群采食量、飲水量以及精神狀態是否出現異常,觀察是否出現發病和死亡情況。攻毒后2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d稱量各組試驗雞的質量,計算雞的相對增質量率。攻毒后3 d、5 d、7 d用無菌棉拭子采集雞喉頭和泄殖腔分泌物,采集的拭子樣品通過尿囊腔途徑接種10日齡SPF雞胚3枚,每枚 0.2 ml,每天觀察,連續觀察5日,檢測雞胚尿囊液血凝效價。若接種喉拭子或泄殖腔拭子的雞胚任何一個出現雞胚尿囊液血凝效價≥1×22,則該雞排毒;若雞胚尿囊液血凝效價<1×22則為可疑,需要盲傳一代,盲傳后血凝效價<1×22則判定為陰性,表明該雞不排毒。

1.3 數據處理

用Reed-Muench法計算病毒滴度。用GraphPad Prism 5軟件進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 重組質粒的鑒定

對構建的pFastBac1-HA重組桿狀病毒轉移質粒進行雙酶切驗證,獲得目的基因和載體2個條帶(圖1),結果表明HA基因與載體pFastBac1連接成功。

M:DL5 000 marker;1:雙酶切重組質粒。圖1 重組質粒pFastBac1-HA的鑒定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid pFastBac1-HA

2.2 重組病毒的拯救與鑒定

用重組質粒轉染Sf9細胞,細胞變大變圓,折光率增加,細胞停止生長,表明細胞出現病變,收獲為rVHA。通過間接免疫熒光檢測重組病毒rVHA感染的細胞與不同H9陽性血清反應的情況,熒光顯微鏡下可見,感染重組病毒的細胞出現明亮的綠色熒光(圖2A～圖2C);野生型桿狀病毒感染細胞未出現明顯熒光(圖2D),表明含HA基因的重組桿狀病毒拯救成功,且表達的HA蛋白與不同H9陽性血清間有反應活性。

2.3 Western blot鑒定重組蛋白的表達

rVHA感染的high five細胞完全病變后收獲,用高壓均質機裂解細胞,然后進行Western-Blot鑒定,rHA與H9亞型AIV陽性血清孵育后,出現與預期大小一致、較明顯的特異條帶63 000(圖3),證明HA蛋白成功獲得大量表達。

A:rVHA感染Sf9細胞(115血清);B:rVHA感染Sf9細胞(SD/6血清);C:rVHA感染Sf9細胞(WI/1);D:野毒感染Sf9細胞(115血清)。圖2 重組蛋白HA與不同H9亞型禽流感陽性血清結合的間接免疫熒光法鑒定Fig.2 Indirect immunofluorescence assay identification of recombinant protein HA reacting with positive sera of different H9 avian influenza subtypes

M:蛋白marker;1:重組蛋白HA;2:野生桿狀病毒對照。圖3 Western blot 分析重組蛋白質與H9陽性血清的反應Fig.3 Reaction of recombinant protein with positive sera of H9 subtypes avian influenza by Western blot

2.4 重組蛋白HA血凝活性

通過微量血凝試驗檢測rHA血凝活性,同時設115病毒尿囊液為對照,表達的重組蛋白HA血凝效價為1×212(圖4),說明rHA具有凝集紅細胞的生物學活性。

2.5 重組病毒遺傳穩定性及增殖性能鑒定

測序結果顯示,第1～8代重組桿狀病毒的外源HA基因與目的序列完全一致,表明重組病毒具有良好的遺傳穩定性。重組桿狀病毒傳至第7～8代時病毒滴度達108.00TCID50/ml以上(表1),表明重組桿狀病毒增殖性能良好。

圖4 重組HA蛋白的血凝活性檢測Fig.4 Detection of hemagglutination activity of recombinant HA protein

表1 重組桿狀病毒穩定性檢測結果

2.6 重組HA蛋白交叉反應活性

通過HI試驗測定rHA與不同分支H9陽性血清交叉反應的抗原性,并同時與不同分支H9病毒進行比較。由圖5可知,rHA與現有流行毒株血清(h9.4.2.5)反應的HI滴度較高,與分支較遠的WI/1(h9.1)反應最差。除去血清與同源病毒的反應,rHA反應活性明顯優于其他病毒,表明rHA具有良好的交叉反應活性。

2.7 重組病毒的免疫原性評價

HI血清抗體作為流感疫苗血清學保護的反應指標,商品疫苗效力評判標準為HI抗體效價≥1×26.00。試驗組于免疫后14 d、21 d、28 d采集靜脈血,以分離的流行毒株115、YZ作為檢測抗原檢測血清抗體HI效價。重組蛋白疫苗免疫后14 d即可誘導雞產生較高水平的 HI 抗體應答,免疫后14 d HI效價能達到1×212.00以上,免疫后28 d 達到1×214.59,rHA組抗體效價顯著高于商品苗組(圖 6)。

SPF雞免疫28 d后,對不同亞分支的H9亞型AIV流行株115和YZ以1×106EID50的病毒量進行攻毒。臨床觀察結果顯示,各攻毒試驗組在攻毒后14 d內均無死亡。rHA組、商品苗組在攻毒后無異常,飲水量、采食量、精神狀態均正常,空白組(陰性組)在攻毒后4 d食欲與飲水欲相對較差。

攻毒后2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d分別對各組試驗雞稱體質量,并計算不同試驗組雞體質量相對增長率。結果顯示,rHA免疫組的試驗雞相對增質量率最高;空白組(陰性組)的雞相對增質量率明顯低于免疫組(圖7)。

a:rHA;b:h9.4.2.5-115;c:h9.4.2.5-236;d:h9.4.2.5-YZ;e:Sh9.4.2.3-SD/6;f:h9.1-WI/1。h9.4.2.5為流行毒株。圖5 重組蛋白HA與H9不同陽性血清型交叉反應活性Fig.5 Cross-reactivity of recombinant protein HA with different positive serotypes of H9

A:以病毒115為檢測抗原檢測免疫后血清HI抗體;B:以病毒YZ為檢測抗原檢測免疫后血清HI抗體。*表示差異顯著(P<0.05)。圖6 不同抗原檢測免疫后血清HI抗體Fig.6 HI antibody in sera after immunization detected with different antigens

A:感染115毒株后試驗雞相對增質量率;B:感染YZ毒株后試驗雞相對增質量率。圖7 攻毒后不同試驗組雞的相對增質量率Fig.7 Relative weight gain rate of chickens in different experimental groups after challenge

115和YZ毒株感染后3 d、5 d、7 d分別采集各組試驗雞的咽拭子和泄殖腔拭子樣品,測定攻毒后每只雞的排毒情況。

感染115毒株3 d后,rHA疫苗組喉頭排毒率為20%,泄殖腔排毒率為0;感染5 d后,喉頭排毒率為20%,泄殖腔排毒率為0;商品苗感染3 d后,喉頭排毒率為100%,泄殖腔排毒率為20%;感染5 d后,喉頭排毒率為20%,泄殖腔未檢測到排毒;陰性對照組感染3 d、5 d后,喉頭排毒率為100%,泄殖腔排毒率為100%;感染7 d后所有組未測到排毒(表2)。

表2 感染115毒株免疫保護結果

攻擊YZ毒株3 d后,rHA疫苗組的喉頭排毒率為20%;其余未檢測到病毒,排毒率為0。商品苗組攻毒3 d后的喉頭排毒率為100%,泄殖腔排毒率為20%;攻毒5 d后喉頭排毒率為40%,泄殖腔未檢測到排毒。陰性對照組攻毒3 d、5 d后的喉頭排毒率為100%,泄殖腔排毒率也為100%。7 d后所有組未測到排毒(表3)。

綜上,rHA疫苗組保護率明顯高于商品苗組,表明rHA疫苗對當前H9亞型AIV流行株毒株具有良好的保護效果。

表3 感染YZ毒株免疫保護結果

3 討 論

目前,中國控制H9N2禽流感的主要策略是疫苗接種。然而,中國H9N2病毒多種抗原型同時流行,疫苗更新速度落后于病毒變異速度,使有效疫苗接種面臨挑戰。滅活疫苗免疫可有效減輕H9N2病毒感染后的臨床癥狀,大大減少經濟損失。然而,另一個挑戰是全病毒滅活疫苗免疫不能阻止H9N2 AIV再感染或病毒脫落。在中國,包括散養和混養在內的傳統畜牧業系統繼續占據重要地位,然而,中國家禽業的主要發展方向是集約化圈養。研制具有廣譜性中和活性的通用疫苗對于控制H9N2具有重要意義。關于廣譜疫苗的研究已有報道,利用Epigraph算法來設計豬 H3 流感疫苗血凝素蛋白,該疫苗接種小鼠后可產生顯著針對不同H3分離株的交叉反應抗體和T細胞反應,免疫雪貂后,用2種H3N2病毒攻擊,該疫苗可保護雪貂免受攻擊毒株的侵害[17-18];基于馬賽克HA序列的H9亞型禽流感滅活疫苗能對異源H9N2 AIV株產生較好的交叉攻毒保護效果[19]。

隨著基因工程技術的發展,重組病毒表達系統成為生產有廣譜交叉免疫效果的禽流感疫苗的技術平臺。桿狀病毒表達系統具有諸多優點:不使用活病毒,生物安全性高;表達的HA蛋白可組裝成病毒樣顆粒(VLP),其結構功能與天然蛋白質相似,免疫原性良好,蛋白質表達效率高;重組桿狀病毒基因遺傳穩定,病毒增殖性能良好,保證了疫苗的生產質量[20-21]。

新型廣譜疫苗一直是防控禽流感病毒相關研究的熱點方向,只研究單個毒株的HA免疫原性,不能得到具有廣譜保護效果的疫苗,本研究通過對2010-2019年H9亞型禽流感及本試驗室分離的最新流行株 HA蛋白的抗原相關位點、受體結合位點、潛在糖基化位點等關鍵位點序列進行分析,并對關鍵位點進行校正,利用生物信息學軟件選擇每個位點最高頻次氨基酸設計合成HA基因,并構建桿狀病毒表達系統獲得重組蛋白,經間接免疫熒光、免疫印跡、交叉血凝抑制試驗對其廣譜活性進行鑒定,初步證明重組蛋白具有廣譜的交叉反應活性。

重組蛋白疫苗免疫后14 d即可誘導雞產生較高水平的 HI 抗體應答,14 d HI效價能達到212.00以上,28 d達到1×214.59,顯著高于商品苗組。用2株不同亞分支的H9亞型AIV毒株115、YZ攻擊免疫組雞,各組均未出現臨床癥狀。攻擊115毒株3 d后,rHA疫苗組保護率為80%,商品苗保護率為0;5 d后,rHA疫苗組保護率為80%,商品苗保護率為80%。攻擊YZ毒株3 d后,rHA疫苗組保護率為80%,商品苗保護率為0;5 d后,rHA疫苗組保護率為100%,商品苗保護率為60%。表明,重組蛋白疫苗組產生較好的交叉保護效果,明顯高于商品苗組。

另外,本研究采用高表達效率的high five細胞,提高了蛋白質的表達量,血凝活性高達1×212;high five細胞為無血清培養基培養的全懸浮細胞,降低了成本,生產周期變短,適于大規模培養,為亞單位疫苗規模化生產提供了可行性。

綜上,通過分析、設計H9亞型禽流感HA關鍵位點等得到HA基因,利用Bac-to-Bac 表達的外源蛋白HA具有廣譜的保護效力,可為研究 H9亞型廣譜亞單位疫苗提供技術基礎和科學依據。