黃芪多糖減輕糖尿病性肌少癥大鼠肌肉萎縮的作用機(jī)制研究*

孔一晗，劉信邦，常柏，王娟

（天津醫(yī)科大學(xué)朱憲彝紀(jì)念醫(yī)院、天津市內(nèi)分泌研究所、國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)激素與發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、天津市代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

近年來(lái)，糖尿病的發(fā)病率逐漸上升，預(yù)計(jì)到2045 年，全球糖尿病患者將達(dá)到7 億[1]，在中國(guó)，60 歲以上人群的糖尿病患病率為14.7%[2]，糖尿病常伴發(fā)各種并發(fā)癥，除糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變等常見(jiàn)的并發(fā)癥之外，糖尿病合并肌少癥也是值得關(guān)注的問(wèn)題。骨骼肌約占人體總質(zhì)量的40%，是人體重要組織和代謝器官，不僅能夠維持身體姿勢(shì)和參與運(yùn)動(dòng)，在糖代謝過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。肌少癥是一種以骨骼肌肌力、耐力以及質(zhì)量下降，影響生活質(zhì)量，甚至造成殘疾乃至死亡的退行性綜合征[3-4]。

糖尿病患者因內(nèi)分泌代謝紊亂、血管病變及神經(jīng)病變等因素，易合并肌少癥，造成肌肉萎縮等不良后果[5]，同時(shí)，肌少癥的發(fā)生又可通過(guò)影響血糖調(diào)節(jié)、機(jī)體代謝等途徑加速糖尿病的發(fā)生發(fā)展[6]。在高糖狀態(tài)下，骨骼肌中的micro RNA-106 表達(dá)量上升，而自噬能力下降，加劇脂肪在骨骼肌中的沉積，導(dǎo)致肌萎縮的出現(xiàn)[7]。此外，發(fā)生肌萎縮的組織中衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量減少，肌肉與周?chē)‰祉g帶的連接減弱，關(guān)節(jié)生物力學(xué)發(fā)生改變，對(duì)生活質(zhì)量造成影響[8]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，2 型糖尿病患者合并肌少癥的比例高達(dá)18%[9]，因此對(duì)于糖尿病合并肌少癥的研究刻不容緩。

目前，對(duì)于糖尿病合并肌少癥的治療尚不完善，除了營(yíng)養(yǎng)支持、運(yùn)動(dòng)療法等預(yù)防性的手段，西醫(yī)藥物治療也存在一些局限性[10]。中醫(yī)認(rèn)為，“脾不散精”是糖尿病患者血糖異常升高的重要環(huán)節(jié)[11]，而肌少癥屬于痿癥，脾主肌肉[12]，因此糖尿病合并肌少癥的治療多從補(bǔ)氣健脾、益氣養(yǎng)陰層面開(kāi)展。黃芪多糖是黃芪的主要活性成分之一，近年來(lái)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖具有抗炎、抗衰老、降低血糖、免疫調(diào)節(jié)等多種作用[13]，其性味甘微溫，歸脾、肺兩經(jīng)，兼具補(bǔ)氣健脾、斂瘡生肌、利尿排膿之功效[14]，其應(yīng)用于糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變等常見(jiàn)并發(fā)癥已有相關(guān)報(bào)道，但對(duì)于治療糖尿病合并肌少癥的研究少之又少，因此本文將通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究黃芪多糖對(duì)糖尿病相關(guān)性肌少癥的治療效果及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD 大鼠（雄性，8 月齡），許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010，來(lái)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，SPF 級(jí)，體質(zhì)量（400±50）g，飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)朱憲彝紀(jì)念醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，濕度60%～80%，溫度18～23 ℃，給予充分光照，此次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)了天津醫(yī)科大學(xué)朱憲彝紀(jì)念醫(yī)院的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：DXBYY-IACUC-2021054）。

1.1.2 儀器與試劑 儀器：熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems）；離心機(jī)（Eppendorf）；蛋白電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）。試劑：PCR 試劑盒購(gòu)自北京全式金生物公司；Trizol 總RNA 提取試劑盒、RIPA 裂解液、PMSF、鏈脲佐菌素（STZ）由索萊寶提供；預(yù)染蛋白Marker 由Thermo 提供；PAGE 凝膠快速制備試劑盒購(gòu)自雅酶生物；黃芪多糖來(lái)自羅恩公司；鹽酸二甲雙胍購(gòu)于中美上海施貴寶制藥有限公司（國(guó)藥準(zhǔn)字H20023370），抗體購(gòu)自Sigma 公司；引物來(lái)自擎科生物，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primers sequence

1.2 方法

1.2.1 造模及給藥 SD 大鼠分為4 組，每組6 只，分別為正常組、模型組、黃芪多糖組、二甲雙胍組，除正常組以外，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，其余3 組于適應(yīng)性喂養(yǎng)1 個(gè)月后按55 mg/kg 的劑量一次性腹腔注射STZ 制備糖尿病大鼠模型，注射7 d 后連續(xù)3 d 血糖＞16.7 mmol/L 代表造模成功。之后進(jìn)行分組灌胃給藥，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及前期實(shí)驗(yàn)總結(jié)，黃芪多糖組每日給予800 mg/kg 的黃芪多糖灌胃[15]、西藥二甲雙胍組每日給予105 mg/kg 的二甲雙胍灌胃，正常及模型組給予同等劑量的生理鹽水灌胃。

1.2.2 蘇木精-伊紅（HE）染色 大鼠給藥3 個(gè)月后麻醉處死，取腓腸肌組織進(jìn)行包埋、切片、HE 染色，在全自動(dòng)掃描儀上觀察腓腸肌形態(tài)并留存圖像。

1.2.3 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè) 將腓腸肌組織放于-80 ℃，提前配置好凝膠，取部分組織進(jìn)行蛋白提取，上樣電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，牛奶封閉、TBST 緩沖液搖動(dòng)清洗，一抗4 ℃孵育過(guò)夜、二抗孵育，最后在暗箱進(jìn)行條帶曝光并保存。

1.2.4 PCR 檢測(cè) 利用Trizol 提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行c-DNA 轉(zhuǎn)錄，并設(shè)置相應(yīng)的反應(yīng)條件。q-PCR 體系配置，離心后放入PCR 儀進(jìn)行循環(huán)，記錄CT 值等數(shù)據(jù)進(jìn)行下一步的分析。

1.2.5 血清檢測(cè) 大鼠麻醉處死后立即眼球取血，離心分離血清，采用院內(nèi)檢驗(yàn)科全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行三酰甘油（TG）檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 進(jìn)行分析，所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腓腸肌HE 染色 如圖1 所示，正常組肌肉細(xì)胞飽滿、細(xì)胞間距較小、無(wú)異常形態(tài)；模型組發(fā)生明顯萎縮、橫截面積變小，細(xì)胞間距增大、稀疏，有部分滲出及炎性浸潤(rùn)表現(xiàn)，如箭頭所示；黃芪多糖組較模型組有顯著改善，肌肉細(xì)胞面積增大，炎性狀態(tài)大大減輕；二甲雙胍組也在模型組的基礎(chǔ)上有一定程度的恢復(fù)，但改善程度不如黃芪多糖組。

圖1 各組腓腸肌HE 染色形態(tài)圖（×40）Fig.1 HE staining pattern of gastrocnemius muscle of each group (×40)

2.2 磷酸化蛋白激酶B（P-AKT）/蛋白激酶B（AKT）、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O 亞族1（FOXO1）的Western Blot蛋白表達(dá) 由圖2、表2 所示，P-AKT 與AKT 蛋白分子量在模型組均較正常組有所降低，黃芪多糖組和二甲雙胍組較模型組有所增加，且黃芪多糖組增加更為明顯（P＜0.05）。模型組FOXO1 的蛋白分子量較正常組顯著下降（P＜0.05），黃芪多糖組和二甲雙胍組比模型組明顯增加（P＜0.05），且藥物干預(yù)的兩組比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 P-AKT/ AKT、FOXO1 的蛋白表達(dá)Fig.2 Relative protein expression of P-AKT/AKT，F(xiàn)OXO1 in each group

表2 各組蛋白相對(duì)表達(dá)量（±s）Tab.2 Relative protein expression of P-AKT/AKT，F(xiàn)OXO1 in each group（±s）

表2 各組蛋白相對(duì)表達(dá)量（±s）Tab.2 Relative protein expression of P-AKT/AKT，F(xiàn)OXO1 in each group（±s）

注：正常組相比，#P＜0.05；與模型組相比，*P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) PAKT/AKT FOXO1正常組 6 0.89±0.21 0.78±0.61模型組 6 0.54±0.40# 0.41±0.43#黃芪多糖組 6 0.85±0.37* 0.84±0.33*二甲雙胍組 6 0.72±0.32 0.83±0.43*

2.3 各組PCR 數(shù)據(jù)分析 與正常組相比，模型組、熱休克轉(zhuǎn)錄因子1（HSF1）、白細(xì)胞介素（IL-6）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）抑癌基因TP53 mRNA 水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，黃芪多糖組的MMP-9、TP53 水平顯著降低（P＜0.01），HSF1、IL-6 水平明顯降低（P＜0.05）；二甲雙胍各個(gè)指標(biāo)均較模型組有所下降，其中MMP-9 下降水平最為明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 各組HSF1、IL-6、MMP-9 和TP53 mRNA 的表達(dá)量（±s）Tab.3 Expression of HSF1，IL-6，MMP-9 and TP53 mRNA in each group（±s）

表3 各組HSF1、IL-6、MMP-9 和TP53 mRNA 的表達(dá)量（±s）Tab.3 Expression of HSF1，IL-6，MMP-9 and TP53 mRNA in each group（±s）

注：與正常組相比，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù) HSF1 IL-6 MMP-9 TP53正常組 6 1.03±0.29 1.01±0.06 1.00±0.10 1.10±0.06模型組 6 4.04±0.84## 2.52±0.43## 4.91±0.28## 1.90±0.29##黃芪多糖組 6 1.86±0.33* 1.38±0.19* 1.50±0.39** 0.92±0.22**二甲雙胍組 6 2.34±0.49* 1.58±0.17* 3.28±0.24** 1.26±0.07*

2.4 血清生化指標(biāo)TG 模型組TG 水平明顯高于正常組（P＜0.01），黃芪多糖組與二甲雙胍組相較于模型組血脂狀態(tài)均有改善，TG 水平有所降低，其中二甲雙胍組TG 水平改善較為顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表4。

表4 各組TG 水平（±s）Tab.4 TG values of each group（±s） mmol/L

表4 各組TG 水平（±s）Tab.4 TG values of each group（±s） mmol/L

注：與正常組相比，##P＜0.01；與模型組相比，**P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù) TG正常組 6 2.45±0.88模型組 6 5.60±0.81##黃芪多糖組 6 2.26±0.36**二甲雙胍組 6 0.72±0.20**

3 討論

糖尿病作為一種慢性消耗性疾病，常合并多種并發(fā)癥，近年來(lái)有些研究指出，肌少癥成為了糖尿病人群，尤其是老年糖尿病人群的新的并發(fā)癥[16]。合并肌少癥的患者會(huì)因肌力下降、肌肉萎縮等病理過(guò)程嚴(yán)重影響日常活動(dòng)，造成意外傷害而致殘乃至死亡，正日益成為糖尿病患者面臨的又一項(xiàng)挑戰(zhàn)。

本次實(shí)驗(yàn)選用了大月齡SD 鼠作為研究對(duì)象，并進(jìn)行一次性STZ 注射造模，以符合老年糖尿病模型的設(shè)計(jì)初衷。腓腸肌作為人體進(jìn)行站立、步行等活動(dòng)的重要骨骼肌，受肌少癥影響較為顯著，對(duì)大鼠腓腸肌的HE 染色發(fā)現(xiàn)，糖尿病組的肌細(xì)胞明顯發(fā)生了萎縮、滲出，細(xì)胞間隙變大，說(shuō)明高糖毒性對(duì)腓腸肌的消耗較為嚴(yán)重，這與張艷等[17]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。經(jīng)黃芪多糖灌胃治療3 個(gè)月后的腓腸肌有所改善，可見(jiàn)肌細(xì)胞相比于模型組更加飽滿，變性滲出也大面積減少，效果優(yōu)于二甲雙胍組。PI3K-AKTFOXO1 信號(hào)通路是糖尿病研究的重要通路機(jī)制之一[18]，Western Blot 結(jié)果表明，模型組P-AKT/AKT 水平較正常組明顯降低[19]，AKT 作為糖尿病的保護(hù)因子，高糖狀態(tài)降低了其含量[20-21]，經(jīng)中藥干預(yù)后含量顯著增加。FOXO1 是一種叉頭框轉(zhuǎn)錄因子，O’Neill等[22]實(shí)驗(yàn)證明FOXO 是糖尿病相關(guān)肌萎縮的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，恰恰印證了模型組FOXO1 含量的下降，而經(jīng)過(guò)藥物干預(yù)的兩組均出現(xiàn)了FOXO1 含量的上升，且相差不大，效果相當(dāng)，考慮黃芪多糖和二甲雙胍均可能通過(guò)調(diào)控FOXO 轉(zhuǎn)錄因子減輕高糖毒性并改善肌萎縮狀態(tài)[23]。聚合酶鏈PCR 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了黃芪多糖和二甲雙胍對(duì)IL-6、TP53 炎癥因子的改善作用，相比之下，黃芪多糖減輕程度要優(yōu)于西藥，這與Giha 等[24-26]文章不謀而合。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明HSF1參與糖尿病的相關(guān)進(jìn)程[27]，在本實(shí)驗(yàn)中糖尿病組HSF1 mRNA 表達(dá)量明顯提高，黃芪多糖組相較于模型組明顯降低。MMP-9 主要功能是降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)之間的動(dòng)態(tài)平衡，有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病合并下肢病變的人群MMP-9 水平明顯提高[28]，說(shuō)明MMP-9 可能通過(guò)影響下肢血液循環(huán)造成肌肉萎縮，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。糖尿病大鼠生化指標(biāo)TG 較正常組明顯升高，二甲雙胍的降脂作用要優(yōu)于黃芪多糖組。

黃芪多糖是黃芪中的重要成分之一，近年來(lái)有不少致力于研究黃芪多糖對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥的治療作用的文章。本次實(shí)驗(yàn)采用黃芪多糖對(duì)糖尿病性肌少癥進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)肌肉形態(tài)的HE 染色、Western Blot、PCR 等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了黃芪多糖對(duì)糖尿病及肌肉萎縮的改善作用。黃芪多糖由多種單糖及葡聚糖（Glu）構(gòu)成，有研究指出，β-Glu 可以作為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑增強(qiáng)免疫功能，從而改善高糖狀態(tài)，減輕肌肉萎縮[29]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可以糾正因糖尿病導(dǎo)致的輔助性T 淋巴細(xì)胞（Th）的失衡，保護(hù)胰腺的超微結(jié)構(gòu)，減輕凋亡及炎癥水平[30]，這也可能是導(dǎo)致肌肉萎縮減輕的作用機(jī)制。此外，黃芪多糖能夠上調(diào)抗氧化因子減輕氧化應(yīng)激水平[31]，并且顯著增強(qiáng)抗氧化基因表達(dá)，降低了胰島素樣肽和長(zhǎng)壽基因MTH 的表達(dá)，從而延緩各組織器官的萎縮機(jī)體的衰老[32]。葉婷等[15]證明黃芪多糖通過(guò)調(diào)節(jié)自噬改善糖尿病心肌病；有研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能降低空腹血糖、減輕胰島素抵抗從而改善血管動(dòng)脈粥樣硬化[33]。黃芪多糖還可通過(guò)下調(diào)心肌p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）/p65 的磷酸化水平減輕心肌纖維化[25]；另外有實(shí)驗(yàn)證明[34-36]，黃芪多糖通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K-AKT 途徑及炎性因子發(fā)揮作用，減輕高糖狀態(tài)及各種糖尿病并發(fā)癥，與本次實(shí)驗(yàn)部分結(jié)果相一致。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃芪多糖可能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K-AKT-FOXO1 信號(hào)通路、降低IL-6、TP53炎性因子水平，影響HSF1 和MMP-9 的活性，從而改善糖尿病性肌少癥大鼠的肌肉萎縮。